謝興 朱敬先 胡小青 敖英芳

北京大學(xué)第三醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所（北京 100091）

數(shù)字成型脫礦皮質(zhì)骨組織工程學(xué)半月板支架的制備與檢測

謝興 朱敬先 胡小青 敖英芳

北京大學(xué)第三醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所（北京 100091）

目的：探尋新的異種異體半月板移植物。方法：使用牛脛骨皮質(zhì)骨板作為移植物原料，通過測量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的實(shí)際膝關(guān)節(jié)半月板數(shù)據(jù)，經(jīng)過三維建模重建半月板形態(tài)，利用數(shù)控機(jī)床對(duì)脫鈣皮質(zhì)骨進(jìn)行加工。對(duì)加工成型的半月板進(jìn)行生物力學(xué)檢測，同時(shí)觀察其大體結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果：該方法制備的異種異體半月板移植物能夠很好地進(jìn)行塑形改建，具有接近正常豬半月板的生物力學(xué)性質(zhì)。同時(shí)含有大量I型膠原網(wǎng)絡(luò)，利于新生組織長入及替代。該移植物有細(xì)胞長入的空隙，同時(shí)具有一定的初始支撐強(qiáng)度。結(jié)論：該移植物具有細(xì)胞長入的空隙，同時(shí)具有一定的初始支撐強(qiáng)度，可作為半月板的替代材料。

半月板移植；脫鈣皮質(zhì)骨；數(shù)字成型；組織工程半月板

半月板損傷是常見的運(yùn)動(dòng)創(chuàng)傷。雖然對(duì)于半月板損傷的治療原則已從起初的全切半月板發(fā)展到現(xiàn)在的盡量多地保留半月板[1]，但很多嚴(yán)重?fù)p傷如盤狀軟骨撕裂，位于非血供豐富區(qū)的嚴(yán)重撕裂的半月板往往還免不了要接受半月板全切除手術(shù)。半月板全切術(shù)后將導(dǎo)致過早的、進(jìn)行性的關(guān)節(jié)軟骨退變。將同種異體半月板移植引入臨床可解決半月板缺失后的膝關(guān)節(jié)退變問題，但同種異體半月板移植的供體來源非常有限，且存在與受體的匹配問題。因此，人們不斷探索新的半月板移植物。理想的半月板移植物除了具備與同種異體半月板相同或相近的生物力學(xué)特性外，還需要具備易于獲得且具有一定的可塑性。

異種異體半月板移植作為同種異體半月板移植的替代曾在本所進(jìn)行了初步的實(shí)驗(yàn)研究，經(jīng)過對(duì)移植物的不斷改善，結(jié)果表明，異種異體半月板組織移植后對(duì)軟骨有保護(hù)作用，可以延遲關(guān)節(jié)軟骨的退變[2]。但異種異體半月板移植物取材后不易進(jìn)行修整，難以使其與受體完美結(jié)合，鑒于此，本研究旨在尋找新的可進(jìn)行塑形的移植物。

1 材料和方法

1.1 受體半月板的測量

準(zhǔn)確地測量受體半月板的數(shù)據(jù)是能否準(zhǔn)確修整半月板移植物的關(guān)鍵。在研究過程中我們?cè)?jīng)考慮對(duì)動(dòng)物進(jìn)行個(gè)體測量然后個(gè)性化進(jìn)行假體制作，如果每只動(dòng)物都進(jìn)行CT及MRI，需要對(duì)每只動(dòng)物進(jìn)行麻醉，工作量巨大，且無法在短時(shí)間內(nèi)完成。我們選擇了替代方案。取用其他實(shí)驗(yàn)剩余的豬內(nèi)側(cè)半月板采集數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，選擇體重相近的豬齡為1年左右的實(shí)驗(yàn)用豬進(jìn)行測量，尋找出一種移植物的模板，使得所有被測動(dòng)物的半月板與模板相比誤差均小于10%。分別計(jì)算半月板體部及前后角的長、寬、厚度，記錄、制作表格，然后將測量數(shù)據(jù)求均值，作為建立半月板數(shù)字模型的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1.2 受體半月板的數(shù)字三維重建

將測量的數(shù)值代入設(shè)計(jì)好的半月板三維重建數(shù)字模型，構(gòu)建數(shù)字化的三維半月板模型，模型設(shè)計(jì)的原理是假設(shè)半月板脛骨面為水平，掃描半月板股骨面建立半月板股骨面弧面，然后使其與水平面連接形成半月板形態(tài)，不連續(xù)的部位用垂線作圖將其連接。為手術(shù)方便，我們還設(shè)計(jì)了半月板假體的連接柄以便將半月板插入骨道內(nèi)。所有建模過程均使用UG NX4 CAD軟件。見圖1。

圖1 半月板三維重建數(shù)字模型

1.3 脫礦皮質(zhì)骨的準(zhǔn)備及成型

選擇皮質(zhì)骨均勻的牛脛骨皮質(zhì)骨，將其切割成為長方形片狀，進(jìn)行脫鈣。使用快速脫鈣液（中杉金橋）浸泡樣本24小時(shí)，然后經(jīng)流水沖洗，洗去多余的脫鈣液。使用精細(xì)化數(shù)控機(jī)床（Carver S600A RT北京精雕）將其塑形成為預(yù)計(jì)的半月板移植物。將脫鈣后的標(biāo)本進(jìn)行冷凍干燥，使用冷凍干燥機(jī)冷凍干燥48小時(shí)。冷凍干燥后的標(biāo)本深低溫（－80℃）保存，使用前用生理鹽水浸泡半小時(shí)以上進(jìn)行水合。見圖2。

圖2 皮質(zhì)骨支架制作過程

1.4 超微結(jié)構(gòu)觀察

取一塊水合后的脫鈣骨標(biāo)本，投入戊二醛固定液再次固定24小時(shí)以上。經(jīng)充分固定后，在與固定液相同的磷酸緩沖液中浸洗3次，充分洗去固定液成分。分別切取冠狀面及橫斷面。切好的組織逐級(jí)酒精脫水，臨界點(diǎn)干燥，導(dǎo)電處理后包埋在金屬托上，使用掃描電鏡（JEOL公司JSM-5600LV）進(jìn)行觀察。電鏡下隨機(jī)選取膠原暴露清晰的視野，進(jìn)行拍照，圖像用photoshop軟件進(jìn)行分析。

1.5 生物力學(xué)性質(zhì)分析

使用納米壓痕測試儀器（TI950 Tribolndenter HYSITRON）對(duì)水合前及水合后的脫鈣骨及正常小型豬半月板組織分別進(jìn)行測試。測試方法如下。

取脫礦皮質(zhì)骨支架和小型豬半月板組織，切割成肉眼可見的平整的小塊。10%中性甲醛固定1 h，流水洗去固定液；將樣品固定在納米壓痕測試托柄上，PBS溶液保持樣品濕潤；選用直徑20 μm球狀藍(lán)寶石探頭，壓縮臂選用TriboIndenter；壓縮條件設(shè)定為：加載2 s，保持2s，卸載2 s；最大壓痕深度為500 nm；通過視頻監(jiān)控選定測試點(diǎn)，取五點(diǎn)平均值為修復(fù)組織的力學(xué)特性。微觀掃描：利用納米壓痕儀器微觀探頭，對(duì)軟骨缺損修復(fù)進(jìn)行微觀掃描，獲取修復(fù)組織的微觀形貌圖，分析修復(fù)關(guān)節(jié)面的平整度。數(shù)據(jù)處理：納米壓痕過程中數(shù)據(jù)的收集包括負(fù)荷與壓痕深度，頻率為50 Hz，初步獲得樣品的負(fù)荷-位移曲線。

2 結(jié)果

2.1 受體半月板測量數(shù)據(jù)

測量15只豬半月板的前后徑、左右徑、前角寬、體部寬、后角寬、脛骨平臺(tái)前后徑、脛骨平臺(tái)左右徑、前角厚、體部厚、后角厚。計(jì)算其平均值。

表1 小型豬半月板及脛骨平臺(tái)測量數(shù)據(jù)（±s，cm，n=15）

表1 小型豬半月板及脛骨平臺(tái)測量數(shù)據(jù)（±s，cm，n=15）

部位 測量值2.80–0.10 2.71–0.11 1.1–0.08 0.95–0.04 1.21–0.08 0.65–0.04 0.61–0.05 0.63–0.06 3.05–0.14 2.84–0.11前后徑左右徑前角寬體部寬后角寬前角厚體部厚后角厚脛骨平臺(tái)前后徑脛骨平臺(tái)左右徑

2.2 脫鈣骨的超微結(jié)構(gòu)

經(jīng)過掃描電鏡觀察，脫鈣骨放大后呈現(xiàn)網(wǎng)格狀的膠原網(wǎng)絡(luò)，表面結(jié)構(gòu)凹凸不平，利于細(xì)胞的粘附（圖3A）。在進(jìn)一步放大后，可以觀察到由于脫鈣，皮質(zhì)骨表面有大小不一的孔洞，可以自由通過小分子蛋白質(zhì)等，利于物質(zhì)交換（圖3B）。

圖3 脫鈣骨支架的掃描電鏡觀察

2.3 納米壓痕儀器測量脫鈣骨支架的生物力學(xué)性能

通過納米壓痕儀器對(duì)水合前、后組織工程半月板支架和正常小型豬半月板組織進(jìn)行壓力測試，結(jié)果可見水合前脫礦皮質(zhì)骨生物力學(xué)特性接近骨組織，水合后與半月板組織接近。見圖4。

圖4 水合前后的半月板支架材料負(fù)荷-位移曲線

3 討論

移植物的可塑性是移植物與受體完美匹配的關(guān)鍵因素，與移植成功與否息息相關(guān)。即便是同身高體重的人之間，半月板形狀也會(huì)存在很大差異，而半月板移植物允許的誤差為10%。對(duì)移植物進(jìn)行一定的修整可以提高移植的成功率。在本實(shí)驗(yàn)中，我們挑選特殊部位的皮質(zhì)骨牛脛骨的皮質(zhì)骨板作為支架的材料，這幾乎是牛四肢長骨中強(qiáng)度最大、形狀最為規(guī)整、密度最大的部位。用它來進(jìn)行加工，能滿足我們對(duì)材料尺寸及生物力學(xué)性能的要求。另外，精確建模及數(shù)字三維重建是我們控制移植物形狀的方法。這種方法也被應(yīng)用于血管及骨組織等多種組織器官的移植中[3，4]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此方法獲取的半月板移植物形態(tài)與自體半月板匹配度高，可以用于進(jìn)一步的移植實(shí)驗(yàn)。

為了進(jìn)一步分析移植物支架的生物學(xué)特性，我們對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。脫礦皮質(zhì)骨主要構(gòu)成為I型膠原，與半月板相似，我們觀察其超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)其膠原纖維的排列有足夠的孔隙讓細(xì)胞長入。而脫鈣處理過程可以有效地去除組織中殘余的細(xì)胞成分，大大降低異種移植物的抗原性。本實(shí)驗(yàn)中脫礦皮質(zhì)骨在塑形前進(jìn)行了脫鈣脫脂深低溫冷凍等步驟，這些去抗原性的步驟將植入物抗原性降到了最低水平。脫礦骨組織在體內(nèi)有骨化的可能，在植入前可進(jìn)行因子誘導(dǎo)其成軟骨，以防止其骨化導(dǎo)致植入手術(shù)失敗。在后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，我們將對(duì)牛皮質(zhì)骨板制作的半月板移植物進(jìn)行進(jìn)一步免疫學(xué)檢測。

我們之前的研究以及其他學(xué)者的研究[5，6]，均發(fā)現(xiàn)脫鈣皮質(zhì)骨具有很好的生物相容性，可以讓組織細(xì)胞快速長入。這也是該材料能夠作為組織工程支架的理論基礎(chǔ)。而力學(xué)特性是決定半月板移植成功與否的關(guān)鍵因素。我們?cè)谘芯恐惺褂眉{米壓痕技術(shù)對(duì)牛脫礦皮質(zhì)骨的生物力學(xué)特性進(jìn)行了檢測。該技術(shù)的精確測量程度達(dá)到了納米級(jí)[7]，可以對(duì)類似軟骨的組織進(jìn)行很好的檢測與分析[8，9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明水合后的皮質(zhì)骨支架更接近于半月板組織自身的力學(xué)強(qiáng)度，其壓力-應(yīng)變曲線更加光滑，說明其表面更為規(guī)則。由于含水量對(duì)標(biāo)本力學(xué)性質(zhì)的影響主要表現(xiàn)在對(duì)蠕變性能的影響上，對(duì)于軟骨類組織，這一指標(biāo)就顯得尤為重要。在其他學(xué)者的研究中也對(duì)比了不同含水量對(duì)材料彈性模量的影響[10]，與我們的研究結(jié)果相符。同時(shí)，經(jīng)過水合處理的半月板支架可以更好的加工，其表面更易于進(jìn)行生物修飾。

4 總結(jié)

通過對(duì)小型豬半月板的精細(xì)測量，我們建立了重建移植物的三維模型。利用精細(xì)加工數(shù)控機(jī)床，我們使用脫鈣后的牛皮質(zhì)骨板制備了半月板異種異體移植物。制作出的模型可重復(fù)性高，形態(tài)規(guī)則，與半月板高度匹配。通過對(duì)移植物的超微結(jié)構(gòu)觀察及使用納米壓痕儀對(duì)其生物力學(xué)性能進(jìn)行測試，結(jié)果證實(shí)該移植物具有細(xì)胞長入的空隙，同時(shí)具有一定的初始支撐強(qiáng)度，可作為半月板的替代材料。

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Digital Prototyping Demineralized Bone Tissue Scaffold for Meniscal Implantation

Xie Xing，Zhu Jingxian，Hu Xiaoqing，Ao Yingfang
Institute of Sports Medicine，Third Hospital of Peking University，Beijing，China 100191 Corresponding Author：Ao Yingfang，Email：yingfang.ao@vip.sina.com

Objective To introduce an alternative xenogenic subject for meniscal implantation.Methods The bovine tibial cortical bone was decalcified using the CNC machine and then reconstructed to be the shape of swine knee meniscus through the three-dimensional modeling.The biomechanics，general structure and ultrastructure of the mimic xenogenic meniscus were observed.Results The xenogenic meniscal grafts exhibits the biomechanical property similar to the swine meniscus and contains a large number of type I collagen matrix，which provides enough space for new cell growing and filling.The reconstructed graft also has better initial biomechanical strength.Conclusion The xenogenic graft processed from bovine tibial cortical bone can be used as an alternative material for meniscal implantation due to its adequate cell growing gap and better initial support strength.

meniscal transplantation，decalcified cortical bone，digital prototyping，tissue engineering

2015.12.18

國家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)81401810）

敖英芳，Email：Email：yingfang.ao@vip.sina.com