靳 光，薛艷蓉

(山西省農(nóng)科院 畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030000)

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小鼠發(fā)情周期陰道上皮細胞形態(tài)變化的研究

靳 光，薛艷蓉

(山西省農(nóng)科院 畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030000)

為了區(qū)分小鼠發(fā)情周期各階段陰道內(nèi)部細胞組織形態(tài)學(xué)變化，利用陰道組織涂片法，對6只成年實驗小白鼠連續(xù)6 d進行陰道涂片、鏡檢，觀察陰道涂片中細胞的變化規(guī)律。結(jié)果表明，在小鼠發(fā)情周期各階段陰道涂片特征明顯，其中在發(fā)情前期，陰道涂片特征為形狀不規(guī)則或蝌蚪狀的有核上皮細胞占絕大多數(shù)，白細胞和角質(zhì)化上皮細胞很少。在發(fā)情期，陰道涂片特征幾乎全是片狀的無核角質(zhì)化細胞。在發(fā)情后期，陰道涂片特征為少量無核角質(zhì)化上皮細胞，白細胞占大多數(shù)。在發(fā)情間期，陰道涂片特征為上皮細胞少而皺縮，涂片中有大量白細胞。試驗結(jié)果表明，小鼠在整個發(fā)情周期過程中陰道內(nèi)部細胞組織形態(tài)會發(fā)生一系列變化，特征顯著，可以作為區(qū)分小鼠發(fā)情周期階段的一個簡便方法。

發(fā)情周期；陰道組織涂片；小鼠

小鼠是常用的醫(yī)學(xué)實驗動物，發(fā)情周期一般為5～6 d，根據(jù)其生理變化，可將發(fā)情周期劃分為4個時期，即發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期和發(fā)情間期。嚙齒類動物在性周期的不同階段，陰道黏膜發(fā)生不同程度的變化，因此可一次判斷發(fā)情周期的不同階段。為了確定、區(qū)分小鼠各個發(fā)情階段，本實驗采用陰道組織涂片法，對己烯雌酚處理的小鼠，在發(fā)情周期各階段分別進行陰道組織涂片觀察，以期探究小鼠發(fā)情周期陰道內(nèi)部細胞組織發(fā)育變化及形態(tài)特征，為區(qū)分小鼠發(fā)情周期階段提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

以6只雌性未孕小白鼠為實驗動物，在室溫、自然光照、自由飲水的條件下合籠飼養(yǎng)，采用全價顆粒飼料飼養(yǎng)。

1.2 實驗器材與藥品

顯微鏡、10 μL移液槍、1 mL注射器、鼠籠、蘇木精伊紅染液、生理鹽水、己烯雌酚等。

1.3 方法與步驟

1.3.1 誘導(dǎo)發(fā)情

取雌性小鼠4只，其中2只作對照，其余每只皮下注射己烯雌酚50 μg。待實驗鼠外陰部出現(xiàn)發(fā)情癥狀后，每天7：00時、15：00時、23：00時進行陰道黏液涂片直到發(fā)情間期。整個實驗大約持續(xù)6 d。

1.3.2 陰道黏液涂片的制作

用右手小拇指和無名指夾住小鼠尾根，手背壓過小鼠背部，再用大拇指和食指握緊小鼠頸部背側(cè)和耳部的皮膚以完成小鼠的固定工作。移液槍插緊槍頭，吸取10 μL生理鹽水，打入小鼠陰道內(nèi)部，并來回抽吸數(shù)次，充分混勻后滴到載玻片中央，均勻涂開，在空氣中自然干燥。然后將干燥好的載玻片放到95%酒精里固定15 min，蘇木精染色15～30 min，自來水沖洗2 min，伊紅染色1 min，蒸餾水沖洗干凈剩余染料，封片鏡檢。

2 實驗結(jié)果

發(fā)情前期是發(fā)情間期向發(fā)情期的過渡，陰道涂片的特征為形狀不規(guī)則或蝌蚪狀的有核上皮細胞占絕大多數(shù)，白細胞和角質(zhì)化上皮細胞很少(圖1-A，圖2-A)；發(fā)情期陰道涂片的特征幾乎全是片狀的，無核角質(zhì)化細胞(圖1-B，圖2-B)；發(fā)情后期是發(fā)情期向發(fā)情間期的過渡，陰道涂片特征為少量無核角質(zhì)化上皮細胞，白細胞占大多數(shù)(圖1-C，圖2-C)；發(fā)情間期陰道涂片特征為上皮細胞少而皺縮，涂片中有大量白細胞(圖1-D，2-D)。

圖1 40x鏡下陰道涂片HE染色結(jié)果

圖2 100x鏡下陰道涂片HE染色結(jié)果

3 討論

小鼠陰道黏膜為復(fù)層扁平上皮，又稱為復(fù)層鱗狀上皮，由不同層數(shù)的細胞所組成，其細胞形狀由底部的立方狀逐漸轉(zhuǎn)變成表面的扁平狀?；准毎沙掷m(xù)分裂，新形成的細胞會逐漸推向游離表面，之后便會脫落。在此過程中，細胞會先成熟然后再退化，表面細胞會有明顯的退化；這在核方面特別明顯，它們會逐漸變得致密、扁平，之后完全瓦解。

因此小鼠的發(fā)情周期是一個連續(xù)變化的周期性過程，所以各階段陰道脫落的細胞組成內(nèi)容也是逐漸轉(zhuǎn)變的，這在本實驗中發(fā)情期頻繁采樣觀察的結(jié)果中得到很好的體現(xiàn)。在發(fā)情前期，己烯雌酚未完全吸收入血，小鼠血液的己烯雌酚水平還未達到頂峰，陰道上皮細胞發(fā)育或成熟速度緩慢，脫落的上皮細胞仍以有核上皮細胞為主。當(dāng)處于發(fā)情期時，體內(nèi)的己烯雌酚水平達到最大，己烯雌酚刺激陰道上皮增厚，上皮細胞迅速生長發(fā)育，表面的細胞變得大而扁平，呈多邊形，有鈍角，成熟后退化，細胞核逐漸消失，此時上皮細胞合成和聚集的大量糖原會在陰道桿菌的作用下分解成乳酸，使陰道保持酸性，抑制病菌的生長繁殖。隨著己烯雌酚水平慢慢下降，上皮細胞的發(fā)育速度慢慢趨向正常，上皮變薄，在脫落掉剩余的發(fā)情期時過度成熟的無核上皮細胞后發(fā)生白細胞浸潤，防止由于糖原減少引起微生物感染，所以此時白細胞是此時陰道涂片主要的細胞成分，但仍有部分或較少的無核上皮細胞。

雖然陰道涂片法可以較明顯地區(qū)分小鼠發(fā)情周期各階段特征，但當(dāng)實驗鼠出現(xiàn)個別發(fā)情不明顯或個別發(fā)情階段特征不明顯的現(xiàn)象時，在各階段陰道脫落的細胞組成成分差別不大，比如本實驗中發(fā)情間期和發(fā)情后期的鏡檢結(jié)果，該方法便表現(xiàn)出一定的局限性，需要進一步通過其他方法來確認(rèn)是否發(fā)情。在本實驗中影響實驗結(jié)果相關(guān)的實驗設(shè)計及實驗操作方面因素及注意事項有：

3.1 實驗安排

小鼠的發(fā)情周期不同于大鼠，發(fā)情周期內(nèi)各階段持續(xù)的時間也與大鼠有異，而且考慮到實驗鼠數(shù)量有限，可能存在的個體差異大的問題會影響實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，因此實驗并沒有完全按照資料上提供的數(shù)據(jù)安排小鼠陰道黏液采樣時間，而是根據(jù)每次涂片制作后的鏡檢結(jié)果來決定下次采樣時間。盡管小鼠的發(fā)情周期約為5～6 d，但陰道黏液變化最為明顯的時間則集中在前3天時間內(nèi)，所以本實驗在前3天內(nèi)的采樣次數(shù)比較集中，即每天3次采樣，后3天采樣則沒有如此頻繁，一天一采即可。

3.2 采樣

每次采樣時，小鼠陰道內(nèi)壁柔嫩，用槍頭吸取黏液時動作要輕柔，避免動作過大劃傷小鼠陰道，影響實驗結(jié)果觀察。

考慮到每次采樣對小鼠是強應(yīng)激刺激，勢必會影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，本實驗將實驗鼠分兩批采樣，有兩只實驗鼠在發(fā)情前期發(fā)情期時制作涂片，另外兩只鼠在發(fā)情后期時制作涂片，而當(dāng)4只實驗鼠處于發(fā)情間期時，均制作涂片。

3.3 涂片制作

因不同階段細胞組成成分不同，要保證細胞核充分染色，所以蘇木精染色時間較長。另外，15 min的染色時間并不固定，要根據(jù)染色效果實時調(diào)整。

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2016-08-29

靳光(1981-)，男，助理研究員，主要研究方向為動物醫(yī)學(xué)。

S814.3

A

1005-2739(2016)06-0006-03