陸小艷,楊 藝,楊 丹

(廣西壯族自治區(qū)百色市人民醫(yī)院,1. 感染性疾病科; 2. 呼吸內(nèi)科,廣西 百色,533000)

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T-SPOT. TB聯(lián)合血漿細(xì)胞因子檢測在活動性結(jié)核病診斷中的應(yīng)用

陸小艷1,楊 藝2,楊 丹1

(廣西壯族自治區(qū)百色市人民醫(yī)院,1. 感染性疾病科; 2. 呼吸內(nèi)科,廣西 百色,533000)

目的 探討結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT. TB)聯(lián)合血漿細(xì)胞因子干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)檢測在結(jié)核病診斷中的作用。方法 隨機(jī)選取30例活動性結(jié)核病患者為A組,20例非活動性結(jié)核病患者為B組,30例健康體檢者為C組。各組分別行外周血T-SPOT. TB檢測，并采用ELISA法檢測血漿IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平。比較A、B組T-SPOT. TB陽性患者各孔斑點(diǎn)數(shù)；比較3組血漿IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10濃度。通過繪制ROC曲線，對T-SPOT. TB試驗(yàn)、血漿細(xì)胞因子水平在鑒別活動性與非活動性結(jié)核中的價(jià)值進(jìn)行分析。結(jié)果 當(dāng)T-SPOT. TB結(jié)果為陽性時(shí),A組患者B孔斑點(diǎn)數(shù)明顯多于B組，得出ROC曲線下面積AUC是0.689(P<0.05)，為有效診斷指標(biāo)。A、B組的IFN-γ、IL-10水平存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，均為有效診斷指標(biāo)(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論 T-SPOT. TB聯(lián)合血漿IFN-γ、IL-10濃度檢測對判斷結(jié)核是否具有活動性有較高價(jià)值。

結(jié)核; IFN-γ; IL-2; IL-4; IL-10; 結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn); 診斷

結(jié)核病是致病菌為結(jié)核分歧桿菌的慢性傳染性疾病，全球每年約有150萬人因結(jié)核病而死亡，中國結(jié)核病每年患病人數(shù)高居全球第二。目前，對肺結(jié)核病的診斷仍是醫(yī)療界面臨的重要挑戰(zhàn)。結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT. TB)在結(jié)核病的診斷方面具有較高的敏感性及特異性，但在區(qū)分結(jié)核活動性與否方面尚不理想，而臨床上對于活動性結(jié)核病與非活動性結(jié)核病的治療措施截然不同，對兩者的鑒別診斷亦尤為重要。研究[1]表明，當(dāng)機(jī)體感染結(jié)核分歧桿菌后大多數(shù)處于潛伏感染狀態(tài)，當(dāng)某些原因引起機(jī)體發(fā)生免疫功能紊亂時(shí)，感染可再活化，即發(fā)生活動性結(jié)核病。可見，機(jī)體的免疫狀態(tài)與結(jié)核病的活動性密切相關(guān)。有研究[2]認(rèn)為，在結(jié)核病的不同狀態(tài)，血漿中某些細(xì)胞因子水平可發(fā)生不同程度的變化，增加檢測的不穩(wěn)定性。本研究分別選取了細(xì)胞免疫與體液免疫相關(guān)細(xì)胞因子作為檢測指標(biāo)，探討其在結(jié)核病診斷中的作用，尤其是活動性結(jié)核病與非活動性結(jié)核病的鑒別診斷，進(jìn)一步了解抗結(jié)核的免疫機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年10月—2015年12月百色市人民醫(yī)院住院的30例活動性結(jié)核病患者為A組,20例非活動性結(jié)核病患者為B組。2組均經(jīng)細(xì)菌學(xué)或組織學(xué)檢查并經(jīng)臨床診斷證實(shí)。排除患有嚴(yán)重肝腎疾患、自身免疫性疾病、HIV感染、妊娠、近期使用過免疫抑制類藥物的患者。A組男22例，女8例；年齡19～78歲，平均(55.1±2.6)歲；其中包括活動性肺結(jié)核18例，腸結(jié)核2例，結(jié)核性心包炎2例，結(jié)核性腦膜炎2例，結(jié)核性腹膜炎2例，結(jié)核性胸膜炎1例，結(jié)核性胸膜炎合并肺結(jié)核2例，結(jié)核性心包炎合并胸膜炎1例。B組男12例，女8例；年齡22～80歲，平均(54.9±2.5)歲；其中包括陳舊性肺結(jié)核病15例，陳舊性結(jié)核性胸膜炎1例，結(jié)核潛伏感染4例。另隨機(jī)選取同期健康體檢的健康者30例為C組，其中男16例，女14例；年齡19～80歲，平均(54.8±2.9)歲。3組一般資料比較無顯著差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 T-SPOT. TB試驗(yàn)方法：各組入院后分別行外周血T-SPOT. TB檢測。真空肝素鈉抗凝管采集外周靜脈血5 mL,常溫靜置2 h后送檢。T-SPOT. TB試劑盒購自上海復(fù)星高科技有限公司，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書逐步進(jìn)行。試驗(yàn)結(jié)束后，光鏡下觀察試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。

1.2.2 血漿細(xì)胞因子檢測方法: A、B組入院后均行血漿細(xì)胞因子檢測,C組與門診行檢測。真空肝素鈉抗凝管采集外周靜脈血5 mL,常溫靜置2 h后3 000 r/min離心10 min,收集血漿,ELISA法檢測血漿中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平。ELISA試劑盒購自R&D公司。

1.3 觀察指標(biāo)

比較A、B組T-SPOT. TB陽性患者各孔斑點(diǎn)數(shù)；比較3組血漿IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10濃度。通過繪制ROC曲線，對T-SPOT. TB試驗(yàn)、血漿細(xì)胞因子水平在鑒別活動性與非活動性結(jié)核中的價(jià)值進(jìn)行分析。

若斑點(diǎn)計(jì)數(shù)為以下情況則判斷為陽性: ① 當(dāng)陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)<6,A、B孔斑點(diǎn)數(shù)與陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)之差≥6時(shí); ② 當(dāng)10>陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6時(shí)，如果A或B孔斑點(diǎn)數(shù)≥陰性孔斑點(diǎn)數(shù)×2。當(dāng)達(dá)不到上述標(biāo)準(zhǔn)，且陽性對照孔斑點(diǎn)數(shù)≥20,判斷為陰性，表明患者體內(nèi)不具針對MTB的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 T-SPOT. TB試驗(yàn)結(jié)果

A組中T-SPOT. TB陽性28例，陰性2例; B組中T-SPOT. TB陽性19例，陰性1例。C組T-SPOT. TB均為陰性。A組T-SPOT. TB陽性患者A孔斑點(diǎn)數(shù)1～205個(gè)，平均24.01個(gè); B孔斑點(diǎn)數(shù)1～390個(gè)，平均75.51個(gè); A、B孔斑點(diǎn)數(shù)之和為11～563個(gè)，平均112.5個(gè)。B組T-SPOT. TB陽性患者A孔斑點(diǎn)數(shù)1～163個(gè)，平均19個(gè); B孔斑點(diǎn)數(shù)1～238個(gè)，平均26.01個(gè); A、B孔斑點(diǎn)數(shù)之和為8～395個(gè)，平均50.51個(gè)。

圖1 2組T-SPOT.TB陽性患者A孔斑點(diǎn)數(shù)

圖2 2組T-SPOT.TB陽性患者B孔斑點(diǎn)數(shù)

圖3 2組T-SPOT.TB陽性患者A+B孔斑點(diǎn)數(shù)

采用GraphPad Prism 5 軟件對2組T-SPOT. TB陽性患者A、B孔斑點(diǎn)數(shù)進(jìn)行散點(diǎn)圖繪制，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示A、B組T-SPOT. TB陽性患者A孔斑點(diǎn)數(shù)比較無顯著差異(P>0.05),如圖1-1; A組T-SPOT. TB陽性患者B孔斑點(diǎn)數(shù)明顯多于B組T-SPOT. TB陽性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),如圖1-2; 2組T-SPOT. TB陽性患者A+B孔斑點(diǎn)數(shù)之和比較無顯著差異(P>0.05),見圖1、2、3。

2.2 各組血漿細(xì)胞因子水平比較

各組血漿IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10存在不同程度的差異。A組IFN-γ、IL-10水平明顯高于B、C組; A、B組IL-2水平明顯低于C組,IL-4水平明顯高于C組; B組IL-10水平明顯高于C組；以上組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組血漿細(xì)胞因子水平比較 pg/mL

2.3 T-SPOT. TB試驗(yàn)、血漿細(xì)胞因子水平對活動性與非活動性結(jié)核的診斷價(jià)值

2.3.1 T-SPOT. TB試驗(yàn)：當(dāng)T-SPOT. TB結(jié)果為陽性時(shí)，A組患者B孔斑點(diǎn)數(shù)明顯多于B組。進(jìn)一步進(jìn)行ROC曲線分析，得出ROC曲線下面積(AUC)=0.689(P<0.05),為有效診斷指標(biāo)。B孔斑點(diǎn)數(shù)對活動性與非活動性結(jié)核診斷的靈敏度為50.0%,特異度為88.5%,陽性似然比為4.67,陰性似然比為0.65。

2.3.2 血漿細(xì)胞因子水平：A組和B組的IFN-γ、IL-10水平存在顯著差異。進(jìn)一步進(jìn)行血漿IFN-γ濃度ROC曲線分析，得出AUC=0.925(P<0.01)，為有效診斷指標(biāo)，對活動性與非活動性結(jié)核的鑒別，靈敏度為93.5%,特異度為86.0%,陽性似然比為6.22,陰性似然比為0.06。進(jìn)一步進(jìn)行血漿IL-10濃度ROC 曲線分析，得出AUC=0.891(P<0.01),為有效診斷指標(biāo)，對活動性與非活動性結(jié)核的鑒別，靈敏度為93.6%,特異度為90.0%,陽性似然比為9.32,陰性似然比為0.06。

3 討 論

人體感染結(jié)核分歧桿菌后的發(fā)病與結(jié)核分歧桿菌的數(shù)量、毒力、機(jī)體免疫力等因素密切相關(guān)。大部分人感染結(jié)核分歧桿菌后處于潛伏狀態(tài)，此時(shí)，機(jī)體所感染的結(jié)核分歧桿菌在體內(nèi)以靜止形式存在。當(dāng)機(jī)體由于某些原因發(fā)生免疫力下降時(shí)，結(jié)核桿菌可能由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)化為活化狀態(tài)，此時(shí)潛伏感染轉(zhuǎn)變?yōu)榛顒有越Y(jié)核病[3-4]。機(jī)體抗結(jié)核免疫反應(yīng)主要依賴巨噬細(xì)胞參與的細(xì)胞免疫，整個(gè)過程受多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)。Th1型細(xì)胞因子能夠增加巨噬細(xì)胞抗菌活性，有利于對結(jié)核病的控制[5]; Th2型細(xì)胞因子可降低巨噬細(xì)胞的抗菌活性，促進(jìn)結(jié)核病的發(fā)展[6]。Th1/Th2的動態(tài)平衡決定了結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展。

本研究選取了IFN-γ和IL-2(Th1型細(xì)胞因子)、IL-4和IL-10(Th2型細(xì)胞因子)作為研究指標(biāo)。結(jié)果顯示，A組(活動性結(jié)核病患者)血漿IFN-γ、IL-10濃度明顯高于B組(非活動性結(jié)核病患者)和C組(健康體檢者)，這與相關(guān)文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道一致。可見，機(jī)體感染結(jié)核分歧桿菌后,Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)增強(qiáng),T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ水平增加。B組與C組間比較，血漿IFN-γ水平未見明顯差異，分析可能是由于非活動性結(jié)核病患者中大部分為陳舊性結(jié)核病患者的原因。IFN-γ能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化，增加其抗原提呈作用，在控制結(jié)核感染中發(fā)揮重要作用[9]。本研究還發(fā)現(xiàn)，活動性結(jié)核病患者血漿中IL-10水平明顯高于非活動性結(jié)核病患者。說明活動性結(jié)核病換成存在明顯的免疫紊亂現(xiàn)象,Th1/Th2細(xì)胞因子失衡明顯。IL-10能夠抑制促炎因子的產(chǎn)生，通過對抗原提呈細(xì)胞活性的抑制發(fā)揮阻止T淋巴細(xì)胞活化的作用[10]。本研究通過對A、B組患者血漿IFN-γ、IL-10濃度進(jìn)行ROC曲線分析，得出IFN-γ曲線下面積AUC=0.925,IL-10曲線下面積AUC=0.891,可見2種細(xì)胞因子在活動性與非活動性結(jié)核病的鑒別診斷中均具有較高價(jià)值，其中IL-10的陽性似然比明顯高于IFN-γ,可見IL-10更有助于對活動性結(jié)核病的診斷。

T-SPOT. TB試驗(yàn)在結(jié)核病的診斷方面具有較高的特異性，且不受機(jī)體免疫狀態(tài)影響。Suzukawa[11]等在對T-SPOT. TB試驗(yàn)相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行的Meta分析中報(bào)道,T-SPOT. TB對結(jié)核病的診斷綜合靈敏度為90%,特異度為93%。Donnachie等[12]在研究中稱,T-SPOT. TB對活動性結(jié)核病的診斷靈敏度是92.1%,特異度是82.5%。在T-SPOT. TB試驗(yàn)中，每個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)致敏的T淋巴細(xì)胞，斑點(diǎn)數(shù)目的增加也就反應(yīng)了結(jié)核病的活動性。本研究中，活動性結(jié)核病患者與非活動性結(jié)核病患者的A孔斑點(diǎn)數(shù)、A孔與B孔斑點(diǎn)總數(shù)無明顯差異，而活動性結(jié)核病患者B孔斑點(diǎn)數(shù)明顯高于非活動性結(jié)核病患者，這與其他報(bào)道相一致[13-15]。通過對各組B孔斑點(diǎn)數(shù)進(jìn)行ROC曲線分析,AUC=0.689,靈敏度為50.0%,特異度為88.5%?？梢奣-SPOT. TB試驗(yàn)B孔斑點(diǎn)數(shù)雖為有效診斷指標(biāo)，但診斷價(jià)值較低。

綜上所述,Th1/Th2細(xì)胞因子動態(tài)失衡在結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用; T-SPOT. TB聯(lián)合血漿ELISA 的IFN-γ、IL-10濃度檢測在結(jié)核病的診斷中具有較高價(jià)值。患者入院后可先行T-SPOT. TB檢測，結(jié)果呈陽性時(shí)，進(jìn)一步進(jìn)行IFN-γ、IL-10濃度測定，以區(qū)分結(jié)核病的活動性，指導(dǎo)治療。

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Value of T-SPOT. TB combined with plasma cytokines in diagnosis of active tuberculosis

LU Xiaoyan1,YANG Yi2,YANG Dan1

(1.DepartmentofInfectiousDiseases; 2.DepartmentofRespiratoryMedicine,People′sHospitalofBaise,Baise,Guangxi,533000)

Objective To explore the value of T-SPOT. TB combined with interferon (IFN)-γ,interleukin (IL)-2,IL-4,IL-10 in diagnosis of tuberculosis (TB). Methods Thirty patients with active TB were designed as group A,20 patients with inactive TB were designed as group B,and 30 healthy examined people were designed as group C. Each group was conducted with peripheral blood T-SPOT. TB test,and the levels of plasma IFN-γ,IL-2,IL-4,and IL-10 were detected by ELISA method. The number of each hole SPOT of T-SPOT. TB-positive patients were compared between group A and group B,and the levels of plasma IFN-γ,IL-2,IL-4,and IL-10 were compared among three groups. Receiver operating characteristic (ROC) curve was drawn for assessing the value of T-SPOT. TB test and plasma cytokines in the differential diagnosis of active TB and inactive TB. Results When T-SPOT. TB result was positive,the number of B hole SPOT of T-SPOT was obviously higher in group A than group B,and the area under the ROC curve (AUC) was 0.689 (P<0.05),which indicating it was a effective diagnostic index. There were significant differences between group A and group B in the levels of IFN-γ and IL-10 (P<0.05 orP<0.01). Conclusion T-SPOT. TB combined with the detection of plasma IFN-γ and IL-10 concentration has a high diagnostic value in the assessment of whether TB is active or not.

tuberculosis; IFN-γ; IL-2; IL-4; IL-10; T-SPOT. TB test; diagnosis

2016-01-06

中國高校醫(yī)學(xué)期刊臨床專項(xiàng)資金(11527840)

R 825.2

A

1672-2353(2016)21-041-04

10.7619/jcmp.201621013