李子羊，劉 佳，孫海燕，李德陽，吳松權(quán)，全雪麗*

(1．延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉133002；2．吉林省美城園林工程有限責(zé)任公司 吉林 長春 130022)

?

IBA濃度對膜莢黃芪不定根生物量、毛蕊異黃酮及毛蕊異黃酮葡萄糖苷積累的影響

李子羊1，劉 佳1，孫海燕1，李德陽2，吳松權(quán)1，全雪麗1*

(1．延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉133002；2．吉林省美城園林工程有限責(zé)任公司 吉林 長春 130022)

以長白山不同地區(qū)2種膜莢黃芪不定根為試材，研究了IBA濃度對膜莢黃芪不定根生物量、毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的影響。結(jié)果表明：和龍黃芪與安圖黃芪不定根生物量在培養(yǎng)3 d時無顯著性變化，并分別在培養(yǎng)7 d的5 mg/L和2 mg/L IBA處理中達到峰值；2種黃芪不定根分別于培養(yǎng)3 d的4 mg/L和2 mg/L IBA處理中呈現(xiàn)了毛蕊異黃酮與毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的峰值。

膜莢黃芪；不定根；IBA濃度；生物量；毛蕊異黃酮；毛蕊異黃酮葡萄糖苷

黃芪，又名綿芪，為多年生草本植物，在我國主要分布于東北、華北地區(qū)[1],其味甘、性微溫?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪具有保護血管、心肌，調(diào)節(jié)免疫，抗腫瘤和抗氧化等功效[2]。黃芪中主要活性成分包括黃芪皂苷、多糖、黃酮類[3]。研究表明，黃酮類是一種天然的抗氧化劑，且抗氧化水平明顯高于黃芪皂苷[4]。作為一種黃酮類化合物，異黃酮通常與藥材的生物活性密切相關(guān)[5]。毛蕊異黃酮與毛蕊異黃酮葡萄糖苷是黃芪根中2種主要的異黃酮成分，毛蕊異黃酮在糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucose:calycosin 7-O-glucosyltransferase, UCGT)的作用下生成毛蕊異黃酮葡萄糖苷[6-7]。在市場上，藥材干燥根中異黃酮類化合物的含量通常決定其價格[8]?！吨袊幍洹?005 年版規(guī)定，黃芪藥材含量的檢測指標僅有黃芪甲苷，而在 2010 年版又增加了毛蕊異黃酮葡萄糖苷。因此，對黃芪中毛蕊異黃酮與毛蕊異黃酮苷的研究得到了更廣泛的關(guān)注[9]。

近年來，市場上對于黃芪的需求日益增大，加之野生資源的銳減，使得只能依靠人工栽培來滿足黃芪的市場供應(yīng)[10]。而人工栽培黃芪又存在明顯的缺點，據(jù)報道，人工栽培黃芪的總黃酮含量明顯低于野生，同時周期較長，一般3～4年方可采收[11]。不定根培養(yǎng)技術(shù)是利用植物器官的培養(yǎng)技術(shù)，也是更加快捷且大量得到植物次生代謝產(chǎn)物的有效途徑之一，具有生長周期短、病蟲害發(fā)生率低、遺傳背景同一和方便實用等優(yōu)點[12]。目前，藥用植物中人參的不定根研究相對較多，韓國在人參不定根的產(chǎn)業(yè)化方面取得了突破性進展；我國也對太子參、三七、紅豆杉、甘草、柴胡、蒼術(shù)、東北刺人參、黃芩等進行了研究[13]。Wu等[14]人于2010年建立了黃芪不定根的培養(yǎng)體系。本研究以長白山區(qū)2種膜莢黃芪不定根為材料研究IBA濃度對毛蕊異黃酮與毛蕊異黃酮葡萄糖苷積累的影響，為利用黃芪不定根生物合成毛蕊異黃酮與毛蕊異黃酮葡萄糖苷奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試野生膜莢黃芪種子采自吉林省和龍市(海拔1 200 m)與吉林省安圖縣(海拔500 m)。經(jīng)延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物學(xué)教研室石鐵源教授鑒定為膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge。

1.2 藥品與試劑

毛蕊異黃酮(110722)和毛蕊異黃酮葡萄糖苷(110907)，標準品購自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)均大于98%。乙腈為色譜純(美國Fisher公司)；水為純凈水(娃哈哈有限公司)；分析用甲醇為色譜純(美國邁瑞達科技有限公司)；其他試劑均為分析純(購于國內(nèi)各公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 膜莢黃芪不定根的誘導(dǎo)

選取飽滿膜莢黃芪種子用自來水沖洗2 h，75% 酒精消毒45 s，無菌水漂洗3次，使用0.1%升汞消毒6 min，無菌水漂洗6次后，接種于MS+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L，pH值為5.8的培養(yǎng)基上，于(25±1) ℃，自然光照下培養(yǎng)，待其發(fā)芽長成完整植株，取根部新鮮組織，將其切成1 cm長的外植體，接入培養(yǎng)基中。不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+IBA 3.0 mg/L+蔗糖30 g/L ，不定根增殖培養(yǎng)基為B5+IBA 2.0 mg/L+蔗糖30 g/L的液體培養(yǎng)基，pH值為5.8，于(25 ± 2) ℃、相對濕度70%下暗培養(yǎng)。

1.3.2 IBA濃度對膜莢黃芪不定根生物量、毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的影響

取0.5 g新鮮不定根組織接入B5+IBA 2.0 mg/L+蔗糖30 g/L的液體增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)25 d后添加不同濃度的IBA(0、1、2、3、4、5 mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)3 d和 7 d后收集不定根。培養(yǎng)條件為(25 ± 2) ℃、相對濕度70%，暗培養(yǎng)。將收集的不定根在50 ℃ 下烘干至恒重，稱其干物質(zhì)質(zhì)量，即生物量。通過高效液相色譜法測定毛蕊異黃酮與毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量。

1.3.3 毛蕊異黃酮與毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的測定

參照宋成英等的方法[15]進行測定，1) 標準品溶液制備：準確稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷標準品1 mg，加入甲醇配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標準品溶液，在 4 ℃冰箱中儲存待用;2) 供試品溶液的配制：取烘干的膜莢黃芪不定根，研磨成粉末后精確稱量 0.3 g，放入 250 mL 圓底燒瓶中，精確加入分析級甲醇 30 mL，80 ℃加熱回流 4 h，經(jīng)搖勻后過濾，精密量取濾液 25 mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，殘渣加色譜級甲醇溶解至 3 mL，搖勻后經(jīng) 0.45 μm 微孔濾膜過濾，封存后置于4 ℃冰箱中儲存待用。每個處理重復(fù)3次;3) 標準曲線繪制: 精密吸取毛蕊異黃酮與毛蕊異黃酮葡萄糖苷標準品溶液，加入色譜級甲醇稀釋為 8 個濃度梯度，在高效液相色譜儀中測其峰面積。以毛蕊異黃酮葡萄糖苷標準品的濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。毛蕊異黃酮回歸方程為y=119.51x-100 080.56,R2=0.999 4；毛蕊異黃酮葡萄糖苷回歸方程為:y=110.58x-504 111.87,R2=0.998 8;4) 色譜條件：華譜C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；檢測波長 230 nm;柱溫為30 ℃；體積流速為0.8 mL/min；進樣量20 μL；流動相為乙腈(A)和水(B)，梯度洗脫程序：0～30 min，15%～55%乙腈；30～35 min，55%～100%乙腈；35～40 min，100%～15%乙腈；40～45 min，15%乙腈。

1.4 統(tǒng)計分析

利用SPSS 19.0 軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 IBA濃度對和龍黃芪不定根生物量、毛蕊異黃酮及毛蕊異黃酮葡萄糖苷的影響

由表1可見，和龍黃芪不定根在培養(yǎng)3 d后生物量與對照組無顯著性差異，而在培養(yǎng)7 d時在3、4、5 mg/L IBA 濃度下觀察到不定根生物量顯著提高，且隨著IBA濃度的增加而逐漸上升，并于5 mg/L IBA時達到峰值(1.205 g)。

不同IBA濃度對和龍黃芪不定根毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的影響見圖1。經(jīng)不同濃度IBA處理后的毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量均顯著高于對照組。表明IBA處理不定根可以增加其毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量。這與田海麗等[16]的研究中，IBA可以提高黃芩不定根中總黃酮含量的結(jié)果相類似。在4 mg/L IBA培養(yǎng)3 d時達到峰值(225 μg/g)，隨著IBA濃度的增加，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的積累水平在5 mg/L處理顯著低于4 mg/L處理。推測不定根在5 mg/L IBA濃度下形成激素脅迫，迫使毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量減少。類似地，培養(yǎng)天數(shù)為7 d時，4 mg/L IBA處理中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的積累量達到峰值(154 μg/g)，并在IBA濃度為5 mg/L時顯著下降。在4 mg/L和5 mg/L IBA濃度的處理中，和龍黃芪不定根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量顯著低于3 d時。推測可能由于此時不定根的旺盛生長所致，其生物量于5 mg/L IBA濃度下達到峰值(表1)。在不同IBA濃度對和龍黃芪不定根毛蕊異黃酮的影響中，觀察到了其含量類似的趨勢(圖2)，其在不同的培養(yǎng)天數(shù)中均于4 mg/L達到峰值(12.8 μg/g,12.2 μg/g)。相對于毛蕊異黃酮葡萄糖苷，毛蕊異黃酮的含量呈現(xiàn)較低水平。這與Tuan等[7]利用茉莉酸甲酯處理黃芪毛狀根，測定的毛蕊異黃酮與毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的結(jié)果類似。毛蕊異黃酮葡萄糖苷是毛蕊異黃酮糖基化后的產(chǎn)物，糖基化通常是在許多植物天然產(chǎn)物的生物合成最后一步，可以提高天然產(chǎn)物的溶解性和穩(wěn)定性，并促進其在植物細胞內(nèi)的存儲和積累[17]。

表1 IBA濃度對和龍黃芪不定根生物量影響

注:表中不同小寫英文字母代表P<0.05水平的顯著性差異,下同。

圖2 IBA濃度對和龍黃芪不定根毛蕊異黃酮含量的影響

2.2 IBA濃度對安圖黃芪不定根生物量、毛蕊異黃酮與毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的影響

由表2可知，安圖黃芪不定根在培養(yǎng)3 d時生物量與對照組無顯著性差異，這類似于和龍黃芪不定根；當(dāng)培養(yǎng)天數(shù)達到7 d時，安圖黃芪不定根生物量在IBA低濃度下(1、2 mg/L)顯著增加，并在2 mg/L IBA濃度下達到峰值(1.155 g)，而隨IBA濃度繼續(xù)增加，不定根的生物量與對照組無顯著性差異。

不同IBA濃度下毛蕊異黃酮葡萄糖苷在安圖黃芪不定根中的積累水平見圖3。培養(yǎng)天數(shù)為3 d時，安圖黃芪不定根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量在IBA濃度為1 mg/L時與對照組無差異，并在IBA濃度為2 mg/L處理中達到峰值(151 μg/g)，此時為對照組的1.5倍；隨著濃度的繼續(xù)增加，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量顯著下降，并在5 mg/L IBA處理中顯著低于對照組。在培養(yǎng)天數(shù)為7 d時，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量隨IBA濃度的增加逐漸上升。在IBA的高濃度下(4、5 mg/L)，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的積累機制與培養(yǎng)3 d時截然相反。表明此時不定根已逐漸適應(yīng)高濃度的IBA，并隨著IBA不斷地消耗，其次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量不斷增加。毛蕊異黃酮的含量呈現(xiàn)較低水平(圖4)，其與毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量出現(xiàn)了類似的趨勢，分別在3 d處理2 mg/L IBA濃度與7 d處理5 mg/L IBA濃度下達到峰值。

表2 IBA濃度對安圖黃芪不定根生物量影響

圖3 IBA濃度對安圖黃芪不定根毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的影響

圖4 IBA濃度對安圖黃芪不定根毛蕊異黃酮含量的影響

3 討論與結(jié)論

隨著黃芪野生資源的銳減與市場需求的增大，黃芪人工栽培的種種缺點逐漸暴露出來[10-11]。黃芪多以根入藥，因此以黃芪不定根培養(yǎng)技術(shù)以其周期短、病蟲害率低等特點，使其成為快速且大量獲得黃芪次生代謝產(chǎn)物的有效途徑之一[12]。IBA是一種能顯著提高植物插穗生根率的生長素[18]，已被廣泛應(yīng)用于各種植物不定根的誘導(dǎo)。但是不同IBA濃度對于黃芪不定根的影響仍未見報道。本研究以長白山主產(chǎn)區(qū)不同海拔高度的2種黃芪為原材料誘導(dǎo)不定根，探究IBA對不同種質(zhì)資源黃芪不定根的生物量、毛蕊異黃酮與毛蕊異黃酮葡萄糖苷積累的影響。

本研究結(jié)果表明，源自相對較高海拔的和龍黃芪不定根(1 200 m)可以較好地適應(yīng)高濃度的IBA，并且其生物量、毛蕊異黃酮與毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量均高于海拔相對較低的安圖黃芪不定根(500 m)。不同地區(qū)黃芪質(zhì)量的差異，可能是由于種間差異、氣候因素等引起的[19]。不同海拔地區(qū)的年平均溫度、土壤等生態(tài)因子存在較大差異，這可能導(dǎo)致了2種黃芪不定根對響應(yīng)外源激素能力的不同。和龍黃芪與安圖黃芪不定根分別于培養(yǎng)3 d的 4 mg/L 和 2 mg/L IBA 處理中呈現(xiàn)了毛蕊異黃酮與毛蕊異黃酮葡萄糖苷最高的積累，可在此時收獲不定根。

[1] 梁喜龍，方淑梅，劉暢，等.CuSO4與H3BO3對黃芪幼苗建成及部分生理生化指標的影響[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報,2012,23(03):1-4.

[2] 劉曉慶，李軍，薛恒躍，等.不同來源、不同等級黃芪飲片中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量分析 [J].藥物分析雜志,2013,33(05):874-880.

[3] 韓燕.中藥黃芪的研究概況[J].河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2003, 18(109): 86-88.

[4] 汪德清，沈從梅，田亞平，等.黃芪的三種提取成分對氧自由基作用的影響[J].中國藥理學(xué)通報,1994,10(02):129-132.

[5] Ma X F,Tu P F,Chen Y J,et al.Preparative isolation and purification of two isoflavones from Astragalus membranaceus Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao by high-speed counter-current chromatography[J].Journal of Chromatography A,2003,992(1-2):193-197.

[6] Park Y J,Thwe A A,Li X H,et al.Triterpene and flavonoid biosynthesis and metabolic profiling of hairy roots,adventitious roots,and seedling roots of Astragalus membranaceus[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2015,63(40):8862-8869.

[7] Tuan P A,Chuang E,Thew A A,et al.Transcriptional profiling and molecular characterization of astragalosides,calycosin,and calycosin-7-O-β-D-glucoside biosynthesis in the hairy roots of Astragalus membranaceus in response to methyl jasmonate[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2015,63(27):6231-6240.

[8] Ma X Q,Shi Q,Duan J A,et al.Chemical analysis of Radix Astragali (Huangqi) in China:A comparison with its adulterants and seasonal variations[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2002,50(17):4861-4866.

[9] 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(2010年，1部) [M] .北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010．

[10] 秦嘉澤，全雪麗，田海麗，等.長白山野生膜莢黃芪不定根總黃酮積累規(guī)律研究[J].北方園藝,2014,16:158-160.

[11] 廉家盛，高日，吳松權(quán)，等.膜莢黃芪不定根組織培養(yǎng)的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(07):2664-2667.

[12] Murthy H N,Hahn E J,Pack K Y.Adventitious roots and secondary metabolism[J].Chinese Journal of Biotechnology,2008,24(05):711-716.

[13] 尹雙雙，高文遠，王娟，等.藥用植物不定根培養(yǎng)的影響因素[J].中國中藥雜志,2012,37(24):3691-3694.

[14] Wu S Q,Lian M L,Gao R,et al.Bioreactor application on adventitious root culture of Astragalus membranaceus[J].In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant,2011,47(06):719-724.

[15] 宋成英，封加福.HPLC同時測定黃芪藥材中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2013,19(11):115-117.

[16] 田海麗，全雪麗，秦嘉澤，等.IBA濃度與培養(yǎng)基對黃芩不定根生物量和總黃酮含量的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015,43(04):65-66.

[17] Li L,Modolo L V,Escamilla-Trevino L L,et al.Crystal structure of Medicago truncatula UGT85H2-insights into the structural basis of a multifunctional(Iso)flavonoid glycosyltransferase[J].Journal of Microbiology and Biotechnology,2007,370(05):951-963

[18] Kochhar S,Singh S P,Kochhar V K.Effect of auxins and associated biochemical changes during clonal propagation of the biofuel plant-Jatropha curcas[J].Biomass and Bioenergy,2008,32(12):1136-1143.

[19] 段琦梅，梁宗鎖，楊東風(fēng)，等.不同產(chǎn)地黃芪藥材質(zhì)量的差異性分析[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版). 2010,38(10):187-192.

Effect of IBA concentration on the accumulation of calycosin and calycosin-7-O-β-D-glucoside in adventitious roots of Astragalus membranaceus

LI Ziyang1，LIU Jia1, SUN Haiyan1, LI Deyang2, WU Songquan1, QUAN Xueli1*

(1.AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China;2.LandscapeEngineeringLimitedCompanyofMeichengofJilinProvince,ChangchunJilin130022,China)

Two types of adventitious roots ofAstragalusmembranaceusin Changbai Mountains as materials, the effect of IBA concentration on the biomass and accumulation pattern of calycosin and calycosin-7-O-β-D-glucoside was investigated. The results showed that biomasses of adventitious roots of bothA.membranaceusfrom Helong and Antu were not significantly changed within 3 days cultured, and both reached peak values when cultured 7 days with 5 mg/L and 2 mg/L IBA treatments, respectively. Additionally, both calycosin and calycosin-7-O-β-D-glucoside contents reached peak values when cultured for 3 days with 4 mg/L and 2 mg/L IBA treatments, respectively.

Astragalusmembranaceus; adventitious roots; IBA concentrations; biomass; calycosin; calycosin-7-O-β-D-glucoside

2016-07-06 基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(21462044)

李子羊(1991—)，男，吉林大安人，在讀碩士，研究方向為生物技術(shù)。全雪麗為通信作者，

E-mail: arswsq@ybu.edu.cn

1004-7999(2016)03-0209-05

10.13478/j.cnki.jasyu.2016.03.005

R284.2

A