高　琦，王　琦，倪宏波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江　大慶　163319）

豬藍(lán)耳病病毒、圓環(huán)病毒和沙門氏菌混合感染的實驗室診斷

高琦，王琦，倪宏波?

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江大慶163319）

隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，豬群發(fā)病往往不是由單一病原所致，而是以兩種或兩種以上的病原相互協(xié)同作用所造成的。感染豬群常見的病原有豬瘟病毒、藍(lán)耳病病毒、圓環(huán)病毒、沙門氏菌、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、副豬鏈球菌、巴氏桿菌和嗜血桿菌等，并經(jīng)常發(fā)生幾種病原混合感染的情況，導(dǎo)致豬群的高發(fā)病率和高死亡率，危害極大。本文通過對某豬場病死仔豬進(jìn)行病理解剖和實驗室診斷，確診其為藍(lán)耳病病毒、圓環(huán)病毒和沙門氏菌混合感染。

藍(lán)耳病病毒；圓環(huán)病毒；沙門氏菌；混合感染

近年來，由于生豬生產(chǎn)規(guī)模越來越大，加上頻繁的調(diào)入轉(zhuǎn)出，豬病的動態(tài)也越來越復(fù)雜，“新病”越來越多[1]。常常是多種病毒、細(xì)菌混合感染或繼發(fā)感染，導(dǎo)致高發(fā)病率和死亡率，并且控制難度增大，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重[2]。豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome）是一種高度接觸性傳染病，呈地方流行性。PRRSV只感染豬，各種品種、不同年齡和用途的豬均可感染，但以妊娠母豬和1月齡以內(nèi)的仔豬最易感。患病豬和帶毒豬是本病的重要傳染源。感染豬的流動也是本病的重要傳播方式[3]?，F(xiàn)已知豬圓環(huán)病毒（Circovirus）有兩個血清型，即PCV1和PCV2。PCV1為非致病性的病毒，PCV2為致病性的病毒。豬對PCV2具有較強(qiáng)的易感性，感染豬可自鼻液、糞便等廢物中排出病毒，經(jīng)口腔、呼吸道途徑感染不同年齡的豬[4]。豬沙門氏菌病又名仔豬副傷寒，是由沙門氏菌屬細(xì)菌引起的仔豬的一種傳染病，主要表現(xiàn)為敗血癥和壞死性腸炎，有時發(fā)生腦炎、腦膜炎、卡他性或干酪性肺炎[5]。

大慶市某豬場突發(fā)傳染性疾病，送檢的病死豬經(jīng)病理剖檢和實驗室診斷，確診為PRRSV、PCV2和沙門氏菌混合感染，現(xiàn)報告如下。

1　發(fā)病情況

該豬場自繁自養(yǎng)14頭母豬，育肥豬200頭左右，各個生產(chǎn)時期的豬分舍飼養(yǎng)。接種疫苗種類為豬瘟疫苗、偽狂犬疫苗、口蹄疫疫苗、細(xì)小病毒病疫苗、水腫疫苗。豬場發(fā)病率為10%～15%，出現(xiàn)1頭病死豬。

2　臨床癥狀

母豬出現(xiàn)精神沉郁、食欲下降和生產(chǎn)性能下降，育肥豬表現(xiàn)為輕度呼吸系統(tǒng)癥狀，少數(shù)出現(xiàn)咳嗽及耳尖皮膚出現(xiàn)深紫色，發(fā)病豬出現(xiàn)扎堆現(xiàn)象。

3　剖檢病理變化

剖檢可見氣管、支氣管充滿泡沫，喉頭表面有廣泛出血點，胸腹腔積水較多；肺臟腫脹、堅硬或性病變；肝臟腫大、表面有暗紅色出血斑；盲似橡皮，肺泡有出血斑，肺尖葉和心葉萎縮或?qū)嵸|(zhì)腸和結(jié)腸黏膜充血和出血，黏膜上覆蓋一層彌漫性、壞死性、腐乳狀物質(zhì)、剝開見底部紅色、邊緣不規(guī)則的潰瘍面。

圖1　喉頭廣泛出血點圖Fig.1　W idely hem orrhagic spot

圖2　肺臟腫脹變硬、出血Fig.2　Enlargem ent and hemorrhage of the larynx on the lung of the sw ine

圖3　肝臟腫大充血出血Fig.3　En largem ent and hemorrhage

圖4　腸黏膜出血Fig.4　Hemorrhage on the intestinal on the liver of the sw ine m ucosa o f the sw ine

4　實驗室診斷

4.1涂片染色鏡檢將細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶紫染色，后經(jīng)碘液媒染，用酒精脫色，脫色后再用復(fù)紅染料進(jìn)行染色。在光學(xué)顯微鏡下，分離菌株為革蘭氏陰性，粉紅色兩端鈍圓，中等大小的直桿菌。

圖5　粉紅色兩端鈍圓中等大小的直桿菌Fig.5　Red ends obtuse medium-sized straight bacillus

4.2鑒別培養(yǎng)培養(yǎng)用接菌環(huán)挑取腸內(nèi)容物分別接種于SS瓊脂鑒別培養(yǎng)基和麥康凱鑒別培養(yǎng)基上，置37℃恒溫箱中需氧培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)。

圖6　SS瓊脂鑒別培養(yǎng)基Fig.6　SalmonellaShigellaagar

圖7　麥康凱鑒別培養(yǎng)基Fig.7　MacConkeyAgar

在SS瓊脂鑒別培養(yǎng)基上為無色菌落中心是黑色，可鑒別為沙門氏菌；在麥康凱鑒別培養(yǎng)基上為無色菌落，初步診斷為沙門氏菌。

4.3生化試驗取硫化氫、葡萄糖、蕈糖、阿拉伯糖、賴氨酸脫氫酶、尿素酶、枸櫞酸鹽、鳥氨酸脫氫酶生化管各2只。將每種生化管的其中1只接入細(xì)菌菌落，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h。取出生化管，將試驗管與對照管進(jìn)行對比，觀察試驗管的顏色變化。

生化管發(fā)酵試驗結(jié)果如下：硫化氫出現(xiàn)黑色沉淀；葡萄糖顏色變黃；蕈糖顏色變黃；阿拉伯糖顏色變黃；賴氨酸脫氫酶顏色變紫；尿素酶顏色變粉紅；枸櫞酸鹽顏色變藍(lán)；鳥氨酸脫氫酶顏色變紫。綜合以上結(jié)果分離菌株鑒定為沙門氏菌。

圖8　生化試驗Fig.8　Biochemicaltests

4.4PPCCRR檢測將新鮮的肝臟組織進(jìn)行研磨，用AXYGEN提取試劑盒提取DNA和RNA。將提取出的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。以組織中提取的病毒DNA以及病毒RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，分別選用豬瘟、高致病性藍(lán)耳病、普通藍(lán)耳病、圓環(huán)病毒、偽狂犬的特異性引物進(jìn)行PCR鑒定。PCR結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析如圖9所示。

引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

其中，第2泳道230bp左右有一條帶，與高致病性藍(lán)耳病病毒目的擴(kuò)增片段大小相符；第3泳道320bp左右有一條帶與普通藍(lán)耳病病毒片段相符；第4泳道493bp左右有一條條帶，與圓環(huán)病毒片段相符。

4.5藥敏試驗用酒精燈火焰滅菌后的鑷子取出藥敏片，貼到已涂菌的平皿培養(yǎng)基表面。將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24h后，觀察結(jié)果。

藥敏試驗結(jié)果顯示硫酸頭孢喹肟、鹽酸頭孢噻呋、頭孢唑啉高度敏感。

圖9　PCR檢測結(jié)果Fig.9　PCR Detection results

表1　引物序列Table1　Sequence

5　討論

5.1發(fā)病原因?qū)υ撠i場仔豬的發(fā)病原因進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該豬場飼養(yǎng)管理水平較低，飼養(yǎng)密度較大；環(huán)境消毒不徹底，排泄物沒有無害化處理；免疫程序混亂，沒有對豬群進(jìn)行過抗體水平檢測來判斷豬群中是否存在病源感染。當(dāng)環(huán)境驟變時，豬體抵抗力下降，病原侵入豬體造成嚴(yán)重?fù)p失[6]。

5.2防治措施由于本豬場散發(fā)了藍(lán)耳病和圓環(huán)病毒病，提示豬場疫苗免疫還存在漏洞，患病的豬將成為傳染源，對其他豬群構(gòu)成危害[7]。一旦疫區(qū)未患病豬免疫力降低，就會被感染而患病，這樣就隨時有暴發(fā)傳染病的危險[8]。因此，一般情況下對沒有發(fā)病的同群豬常應(yīng)用大劑量的疫苗，一方面是強(qiáng)烈刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體；另一方面是疫苗抗原的占位作用，能阻止強(qiáng)毒對其他正常細(xì)胞和組織的侵襲和毒害；而且，疫苗抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生干擾素，會抑制病毒的繁殖[9]。根據(jù)實驗室進(jìn)行的藥敏試驗檢測結(jié)果可知，防治本豬場的細(xì)菌性疾病可用硫酸頭孢喹肟、鹽酸頭孢噻呋、頭孢唑啉進(jìn)行治療，并會產(chǎn)生較好的治療效果。

表2　藥敏試驗結(jié)果Tab le2　Drug suscep tibility test results

6　結(jié)論

通過病理解剖和實驗室診斷，確診該豬場發(fā)生了藍(lán)耳病病毒、圓環(huán)病毒和沙門氏菌混合感染，與商品化試劑盒的檢測結(jié)果相符合。

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Diagnosis of them ixed infection of PRRS、Circovirus and Salmonella of sw ine

Gao Qi,Wang Qi,Ni Hongbo*
(Col lege of Animal Science and Veterinary Medicine,Hei longj iang Bayi Agricul tural University,Heilongj iang Daqing163319)

With the continuous expansion of breeding scale,the incidence of diseases in swine herds are caused by two or more pathogens in the form of mutual cooperation rather than certain pathogen.There are some common pathogens such as circovirus,Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,swine fever virus,haemophilus parasuis,streptococcus,pasteurel la and so on, which lead to high morbidity and mor tality in swine herd by mixed infection.In this paper,we diagnosed piglets died on cer tain farm with mixed infection of PRRSV,Circovirus and Salmonel la by pathological measurement and laboratory diagnosis.

PRRSV;Circovirus;Salmonel la;Mixed infection

S858.28

B

1672-9692(2016)02-0036-05

2015-01-08

高琦（1993-），女，在讀碩士，從事分子病原學(xué)致病機(jī)理研究。

倪宏波（1972-），男，博士，教授，主要研究方向為分子病原學(xué)與免疫學(xué)。