陳郁蕙， 黃金花， 馮啟理， 鄧惠敏

(廣州市昆蟲發(fā)育調(diào)控與應(yīng)用重點實驗室， 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 廣州 510631)

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家蠶BmFKBP45基因的表達(dá)和功能分析

陳郁蕙， 黃金花， 馮啟理*， 鄧惠敏*

(廣州市昆蟲發(fā)育調(diào)控與應(yīng)用重點實驗室， 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 廣州 510631)

以家蠶(Bombyxmori)為研究對象，對果蠅DmFKBP39的同源蛋白BmFKBP45進行了表達(dá)和初步的功能分析. 對DmFKBP39和BmFKBP45進行氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)，它們都含有酸性氨基酸區(qū)域、堿性氨基酸區(qū)域、核定位信號及FKBP結(jié)構(gòu)域. 將BmFKBP45的第2個堿性區(qū)域與核蛋白HMG2的DNA結(jié)合位點進行比對，相似性達(dá)到21%，推測BmFKBP45可通過其第2個堿性區(qū)域與DNA結(jié)合，但EMSA的結(jié)果顯示重組BmFKBP45不與果蠅的JHRE1元件結(jié)合. RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，BmFKBP45在各個發(fā)育時期的家蠶翅原基中都有表達(dá)，在蛹期的表達(dá)量逐漸下降. 激素處理實驗結(jié)果顯示，BmFKBP45的表達(dá)并不受20E和JH的影響. 利用Pull-down、Far-western blot和Co-IP實驗鑒定出一個與BmFKBP45相互作用的蛋白Bm6G1. 這些研究結(jié)果為進一步探究BmFKBP45的功能提供了線索.

家蠶； BmFKBP45； 親免蛋白； 蛻皮激素； 保幼激素； 30K蛋白

在生物體內(nèi)，免疫抑制劑通過結(jié)合相應(yīng)的受體蛋白而發(fā)揮作用，人們將這些受體蛋白命名為親免蛋白(Immunophilin). 根據(jù)結(jié)合不同的免疫抑制劑，這類蛋白可分為兩大類型：能與環(huán)孢素A特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)命名為親環(huán)蛋白(Cyclophilin,CyP)；能與FK506和雷帕霉素結(jié)合的蛋白質(zhì)命名為FK506結(jié)合蛋白(FK506-binding protein，F(xiàn)KBP)[1]，并將與免疫抑制劑結(jié)合的位點稱為FKBP結(jié)構(gòu)域. FKBPs蛋白具有肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(Peptidyl Prolyl cis/trans Isomerase,PPIase)催化活性，能催化蛋白質(zhì)或多肽中脯氨酸肽鍵的順反轉(zhuǎn)變，并且它們的PPIase活性可以被免疫抑制劑抑制. 部分親免蛋白也具備分子伴侶的特性. FKBP38位于線粒體膜上，用RNAi抑制FKBP38的表達(dá)會導(dǎo)致抗凋亡因子Bcl-2的結(jié)構(gòu)異常. FKBP38可能發(fā)揮了一個分子伴侶的作用，通過穩(wěn)定Bcl-2的構(gòu)象而參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程[2]. 親免蛋白是免疫抑制劑的受體蛋白，最初研究親免蛋白主要是圍繞其在免疫抑制反應(yīng)中的作用機理而展開. 最先發(fā)現(xiàn)的是FKBPs中最小的FKBP12蛋白，它通過結(jié)合FK506和雷帕霉素抑制T細(xì)胞的免疫作用，但是復(fù)合物FK506-FKBP12和雷帕霉素-FKBP12所起的調(diào)控機理有所不同. FK506-FKBP12作用的靶蛋白是鈣調(diào)磷酸酶(Calcineurin,CaN)[3]，而雷帕霉素-FKBP12作用的靶蛋白是雷帕霉素靶蛋白(Target of Rapamycin，TOR)[4].

昆蟲的FKBPs可分為3種類型：第1類與人類的FKBP12和FKBP13具有同源性；第2類的FKBPs具有序列相似性，相對分子量是3.8×104～4.6×104之間；第3類是人類的FKBP52的同源物. 在鱗翅目昆蟲草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)中，首次發(fā)現(xiàn)了一個親免蛋白(SfFKBP46)，這個蛋白是根據(jù)其Mw(4.58×104)及FKBP結(jié)構(gòu)域命名的. SfFKBP46含有一個C末端FKBP結(jié)構(gòu)域和核定位信號序列(Nuclear Localization Signal,NLS)，并且和FKBP25一樣也具有結(jié)合DNA的能力[5]. 在脊椎動物中發(fā)現(xiàn)類固醇激素受體能結(jié)合熱激蛋白和親免蛋白[6]，后來發(fā)現(xiàn)煙草天蛾(Manducasexta)的FKBP46也能與EcR/USP結(jié)合形成復(fù)合物，為研究FKBPs與細(xì)胞核激素受體的關(guān)系提供了一個理想的模式系統(tǒng)[7]. 通過基因芯片分析，LI等[8]在黑腹果蠅L57細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了16個受JH誘導(dǎo)的基因，它們的啟動區(qū)都含有JH反應(yīng)元件DmJHRE1(JH response element)，并鑒定出FK506結(jié)合蛋白(DmFKBP39)和Calponin-like蛋白(DmChd64)能結(jié)合到DmJHRE1上. 酵母雙雜交和GST pull-down分析顯示，這2個蛋白能與 DmEcR/DmUSP和DmMet結(jié)合，共同調(diào)控JH應(yīng)答基因的表達(dá)[8]. 本文主要研究與果蠅DmFKBP39同源的BmFKBP45是否與DmFKBP39一樣參與了激素的信號傳導(dǎo)途徑，從而為認(rèn)識家蠶變態(tài)發(fā)育的激素調(diào)控機理提供實驗的證據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑

所選用的家蠶為大造品系，蠶卵來自廣東省蠶業(yè)研究所. 大腸桿菌BL21、Rosetta和pET-32a載體質(zhì)粒，以及提取試劑盒HiPure Plasmid Micro Kit購自Invitrogen公司；DNA聚合酶、DNA限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、RT-PCR試劑盒和熒光定量PCR試劑盒均購自TaKaRa公司； DNA膠回收采用Axygen公司的試劑盒；免疫共沉淀所用的Protein A/G-Plus Beads購自上海悅克生物科技有限公司；蛋白純化樹脂His·Bind Resin購自美國Novagen公司；牛血清白蛋白組分、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑等購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔抗體購自武漢博士德生物工程有限公司.

1.2 方法

1.2.1BmFKBP45基因克隆及原核表達(dá) 以果蠅的DmFKBP39(GenBank accession number：NM_079640.3)為詢問序列，利用NCBI的BLAST工具獲得家蠶中與DmFKBP39同源的基因，即BmFKBP45(GenBank accession number：NM_001043891.1). 根據(jù)BmFKBP45的mRNA序列設(shè)計包含BamH I、XhoI酶切位點的特異引物(上游：GGATCCATGTTTTGGGGATTAATAAT；下游：CTCGAGTCACTTAACATTCTTCAATT). 以家蠶翅原基cDNA為模板，PCR擴增該基因的編碼開放閱讀框ORF. PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min(變性到延伸總34個循環(huán))，72 ℃補充延伸10 min. 將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化到DH5α菌體中，提取質(zhì)粒測序，然后通過BamH I、XhoI雙酶切后回收目的片段，并將其插入經(jīng)過同樣酶切的pET-32a表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化到BL21菌體中，加入最終濃度為1 mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測表達(dá)情況.

1.2.2 重組蛋白的純化及包涵體復(fù)性 根據(jù)蛋白純化試劑盒His·Bind Kit(Norvagen)說明書進行重組蛋白的純化. 重組蛋白若為包涵體，所用的結(jié)合緩沖液、洗滌緩沖液及洗脫液均要帶有6 mol/L的尿素. 操作步驟如下：

樣品制備：收集誘導(dǎo)菌體，12 000 r/min離心取沉淀，用預(yù)冷的結(jié)合緩沖液(不含尿素)重懸沉淀，在冰上超聲波破碎直至細(xì)胞完全破裂(超聲波破碎7 s，冰上靜置7 s,交替進行). 于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液并用孔徑為0.45 μm的濾膜過濾待用. 若為包涵體，用少量的結(jié)合緩沖液(含2 mol/L尿素)重懸沉淀2次，沉淀再次溶于結(jié)合緩沖液(含6 mol/L尿素)里，于4 ℃下過夜，次日于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液待用.

純化：取100～400 μL His·Bind樹脂至1.5 mL離心管中，1 000 r/min離心1 min，棄上清液. 按以下順序平衡樹脂：3倍體積(相對于His·Bind樹脂的體積，下同)的Strip緩沖液洗3次(舊樹脂采用)；2倍體積的蒸餾水洗2次；2倍體積的Charge緩沖液洗3次；2倍體積的結(jié)合緩沖液洗2次. 每一步都充分混勻，平衡步驟之間1 000 r/min離心1 min，棄上清液. 將制備好的上清液樣品加入已平衡的樹脂中，室溫結(jié)合30 min，于1 000 r/min離心1 min，棄上清液. 按以下順序清洗已結(jié)合目的蛋白的樹脂：3倍體積的結(jié)合緩沖液洗3次，3倍體積的洗滌緩沖液洗3次，期間于1 000 r/min離心1 min，棄上清液. 最后用2倍體積的洗脫液洗3次，于1 000 r/min離心1 min，收集上清液即為純化的蛋白樣品. 期間上下輕輕混勻管中的內(nèi)容物.

透析復(fù)性：取純化的包涵體蛋白樣品于透析袋中，依次用含6、4、2 mol/L尿素的透析液在4 ℃下攪拌透析，各3 h，然后用不含尿素的透析液透析攪拌過夜. 次日將透析后的蛋白液從透析袋吸到離心管，于4 ℃、1 000 r/min離心10 min，上清液即為復(fù)性后的蛋白樣品，置于-80 ℃保存?zhèn)溆? 1.2.3 多克隆抗體的制備 成年兔子免疫前禁食24 h，進行耳緣動脈取血作為檢測抗體時的陰性對照. 首次免疫將純化的抗原與等體積的Freund’s完全佐劑充分混合乳化，1 000 r/min離心1 min，至水相和油相不分層即可注射. 首次免疫的抗原量為1 mg，第2、3次為0.5 mg. 每次免疫間隔7～10 d. 第3次重復(fù)免疫注射后，第7天進行耳緣動脈取血，血液于37 ℃下放置 2 h，然后置于4 ℃過夜，第2天早上于4 ℃、10 000 r/min離心10 min. 取上清液分裝到1.5 mL離心管中，加入最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的防腐劑疊氮化鈉，-80 ℃保存?zhèn)溆? 1.2.4 Pull-down分析 按照蛋白純化方法制備樣品及處理His·Bind 樹脂柱子. 分別取200 μL His·Bind 樹脂至3個標(biāo)記為A、B、C的1.5 mL離心管，將制備好的上清液樣品等量加到A、B離心管中，向C管加入1 mL(0.5～1.0 g/L)翅原基蛋白裂解液(作為陰性對照)，于搖床上低溫孵育3 h. 將與C管等量的蛋白提取液加入B管，繼續(xù)在搖床上低溫結(jié)合3 h. 3管于800 r/min離心1 min，棄上清液. 用2倍體積的預(yù)冷的Tris-HCl緩沖液沖洗His·Bind樹脂，800 r/min離心1 min后棄上清液，重復(fù)6次. 用適量的洗脫液洗脫1 h，800 r/min離心1 min后收集上清液. 1.2.5 Far-western blot分析 根據(jù)WU等[9]的方法進行了改進，具體方法如下：SDS-PAGE電泳分離蛋白(如Bm6G1純化蛋白)，于4 ℃恒流300 mA把蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜. 用不同濃度的鹽酸胍變性復(fù)性緩沖液對膜上的蛋白進行變性及復(fù)性處理. 如表1配比，配制出5種不同濃度的鹽酸胍變性復(fù)性緩沖液，每種濃度緩沖液的總體積均為25 mL. 依次用6、3、1 mol/L的鹽酸胍變性復(fù)性緩沖液在室溫下對膜上的蛋白進行變性及復(fù)性處理30 min. 接著用0.1 mol/L的鹽酸胍變性復(fù)性緩沖液在4 ℃條件下對膜上蛋白處理30 min，最后用0 mol/L的鹽酸胍變性復(fù)性緩沖液在4 ℃下處理膜上蛋白過夜.

表1 不同濃度的鹽酸胍變性復(fù)性緩沖液的配制材料

用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的BSA的TBST封閉，37 ℃溫育1 h. TBST洗膜3次以去除封閉液，每次10 min. 加入重組并經(jīng)His-tag純化的蛋白液(如BmFKBP45，10 μg，1 mg/L)，4 ℃孵育過夜. 第2天用TBST洗膜3次，每次10 min. 加入一抗BmFKBP45抗體(以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的BSA-TBST稀釋，1∶5 000)，室溫孵育1 h. TBST洗膜3次，每次10 min. 加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的BSA-TBST稀釋，1∶10 000)，室溫孵育1 h. TBST洗膜1次，再用TBS洗膜3次，每次10 min. 用NBT/BCIP顯色液進行顯色反應(yīng).

1.2.6 免疫共沉淀 將1 000 μL翅原基組織蛋白裂解液(0.5～1.0 g/L)與30 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50% 的Protein A/G-Plus Beads懸浮液在搖床上于4 ℃下緩慢搖動1 h. 然后于4 ℃下2 500 r/min離心1 min,取沉淀作實驗的陰性對照. 各取500 μL上清液到2個新的離心管中，按1∶50比例加入目的蛋白抗體及免疫前血清，4 ℃緩慢搖動3 h. 添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50% 的Protein A/G-Plus Beads 30 μL繼續(xù)孵育1 h. 2 500 r/min、4 ℃離心1 min，棄上清液，用洗滌緩沖液上下顛倒洗滌沉淀，2 500 r/min、4 ℃離心1 min，重復(fù)4次. 最后一次洗滌后，收集洗出液作為對照. 加入20 μL 2×SDS-PAGE 電泳上樣緩沖液，重懸沉淀，瞬時高速離心. 100 ℃加熱變性5 min，取部分或全部樣品進行Western blot 分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 BmFKBP45的生物信息學(xué)分析

2.1.1 BmFKBP45與DmFKBP39蛋白序列比較分析 以果蠅DmFKBP39為詢問序列，在家蠶數(shù)據(jù)庫[10]中以 E-value

對BmFKBP45與DmFKBP39的序列進一步分析發(fā)現(xiàn)，DmFKBP39的酸性氨基酸緊密排在一起形成2個酸性區(qū)域(acidic domain)，分別為Asp89-Asp99和Glu119-Gln184區(qū)域；堿性氨基酸緊密排在一起形成一個Pro185-Gln239堿性區(qū)域(basic domain)；C末端Gly251-His357是一個肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域(FKBP domain). BmFKBP45的2個酸性氨基酸區(qū)域分別位于Asp91-Glu111和Ala146-Glu215，2個堿性氨基酸區(qū)域分別位于Lys119-Thr144和Thr217-Ser295，C末端Gly296-Lys402區(qū)域是一個肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域，其核定位信號序列(NLS)存在于這2個蛋白的堿性區(qū)域內(nèi). BmFKBP45的Asp91-Glu111和Ala146-Glu215酸性區(qū)域分別比DmFKBP39的Asp89-Asp99和Glu119-Gln184酸性區(qū)域多了10個和4個氨基酸. BmFKBP45不僅比DmFKBP39多了1個堿性區(qū)域Lys119-Thr144(26個氨基酸)，而且BmFKBP45的Thr217-Ser295堿性區(qū)域比DmFKBP39的Pro185-Gln239堿性區(qū)域多了24個氨基酸(圖1). BmFKBP45與DmFKBP39的氨基酸數(shù)目出現(xiàn)的差異，是由這2個蛋白在進化上出現(xiàn)的堿性區(qū)域的缺失或增加及區(qū)域中氨基酸的增減造成的. 上述結(jié)果表明，家蠶中并不存在FKBP39，但BmFKBP45與DmFKBP39具有明顯的相似性. 這2個蛋白除了氨基酸數(shù)目不一樣外，整體上它們的結(jié)構(gòu)是很相似的. 因此家蠶中的BmFKBP45可能是果蠅中的DmFKBP39的同源物，推測它們具有類似的功能. 本研究以果蠅中的DmFKBP39為參照蛋白研究家蠶的BmFKBP45的生物學(xué)功能.

圖1 BmFKBP45 與DmFKBP39蛋白氨基酸序列比較分析

2.1.2 BmFKBP45結(jié)合DNA分析 DmFKBP39是一個具有結(jié)合DNA能力的核蛋白[11]，那么BmFKBP45是否也是一個DNA結(jié)合蛋白？有文獻[5]報道，草地貪夜蛾SfFKBP46是個DNA結(jié)合蛋白，因為它與HMG2的DNA結(jié)合區(qū)域的相似性達(dá)到26%，并且預(yù)測能形成α-螺旋(圖2A). 其中HMG2屬于高遷移率族蛋白的一種，是結(jié)合DNA的核蛋白. 將BmFKBP45的第2個堿性區(qū)域(Thr217-Ser295)與HMG2進行比對，相似性達(dá)到21%(圖2B). 另外，通過在線軟件PSIPRED[12]分析BmFKBP45的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其第2個堿性區(qū)域中存在2個螺旋結(jié)構(gòu)，分別為Lys241-Ala251和Lys269-Glu280，它們通過無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)連接(圖2C). 這些序列比對及二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，BmFKBP45可能具有DNA結(jié)合能力，并且可能通過其堿性氨基酸區(qū)域(Thr217-Ser295)結(jié)合DNA.

圖2 BmFKBP45 的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域分析

2.2 BmFKBP45 cDNA的克隆及原核表達(dá)

2.2.1BmFKBP45 cDNA的克隆 本實驗以前期構(gòu)建好的BmFKBP45/pMD18-T為模板，重新設(shè)計引物(FKBP45E-F2、FKBP45E-R2)進行克隆并獲得了該基因ORF的cDNA.BmFKBP45的ORF的cDNA預(yù)測大小為1 209 bp. 經(jīng)PCR擴增在1 000～1 500 bp處出現(xiàn)一條條帶(圖3)，與BmFKBP45的大小一致，經(jīng)測序確定此序列確為BmFKBP45.BmFKBP45編碼一個含402個氨基酸的蛋白質(zhì)，預(yù)測相對分子量大小為4.5×104. 將克隆出來的BmFKBP45經(jīng)過BamH I和XhoI雙酶切后，連接到蛋白表達(dá)載體pET-32a上，雙酶切證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖4).

圖3 BmFKBP45 ORF cDNA的PCR擴增

圖4 BmFKBP45/pET-32a重組質(zhì)粒雙酶切

Figure 4 Double enzyme digestion of the recombinant plasmid ofBmFKBP45/pET-32a

2.2.2BmFKBP45基因的原核表達(dá) 將BmFKBP45/pET-32a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)大腸桿菌中，在30 ℃的培養(yǎng)條件下，加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá). 以誘導(dǎo)的空載體pET-32a及不做誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒作為對照. BmFKBP45預(yù)測相對分子量為4.5×104，加上載體上一個相對分子量為1.83×104的His-tag標(biāo)簽，其相對分子量預(yù)測為6.33×104. SDS-PAGE結(jié)果顯示，BmFKBP45/pET-32a重組質(zhì)粒和對照相比，在6.64×104處出現(xiàn)了一條明顯的蛋白條帶，其大小與BmFKBP45預(yù)測相對分子量相近. 將菌體經(jīng)過超聲波破碎后，發(fā)現(xiàn)重組蛋白是以可溶的形式存在(圖5). 利用His-tag純化了BmFKBP45重組蛋白. 除了目的蛋白BmFKBP45外，在2.90×104～4.43×104處還出現(xiàn)了一條較明顯的蛋白條帶. 在經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的空質(zhì)粒菌體(第1泳道)和未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體重組蛋白(第2泳道)的2組對照中，出現(xiàn)一條很弱的與上述蛋白條帶處于同一位置的蛋白條帶，但在經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體重組蛋白的實驗組中(第 3泳道)，此處的蛋白條帶變粗，說明這個被誘導(dǎo)大量表達(dá)的蛋白并不屬于pET-32a質(zhì)粒和菌體的. 這個在純化蛋白中(第7泳道)出現(xiàn)的相對分子量偏小的蛋白可能是BmFKBP45在菌體內(nèi)被降解后而成的產(chǎn)物.

1：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET-32a菌體蛋白；2：未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體重組蛋白；3：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體重組蛋白(未破碎)；4：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體重組蛋白(破碎)；5：誘導(dǎo)的菌體重組蛋白上清；6：誘導(dǎo)的菌體重組蛋白沉淀；7：純化蛋白

圖5 BmFKBP4重組蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析

Figure 5 SDS-PAGE analysis of expression of BmFKBP4 recombinant protein

2.3 BmFKBP45在翅原基中的表達(dá)譜

為了檢查BmFKBP45在家蠶翅原基中的mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，提取了5齡幼蟲及蛹期的家蠶翅原基的總RNA及蛋白質(zhì)，并用RT-PCR和Western blot 技術(shù)檢測了BmFKBP45在不同發(fā)育時期的翅原基中的表達(dá)情況(圖6). RT-PCR結(jié)果顯示，BmFKBP45在翅原基的各時期都有表達(dá)，進入蛹期后其表達(dá)水平呈下降的趨勢(圖6A). Western blot結(jié)果顯示，在5.50×104處出現(xiàn)了BmFKBP45蛋白條帶(箭頭所指)，可能是由于體內(nèi)的BmFKBP45發(fā)生了蛋白修飾而導(dǎo)致表觀分子量的變化. 整體上看，BmFKBP45在蛋白水平的表達(dá)情況與mRNA水平的變化一致(圖6B).

L5Dy (y=1,2,…,5)表示幼蟲5齡y天;Wx (x=1,2)表示熟蠶x天；PP表示預(yù)蛹期；Pm (m=0,1,2…,7)表示蛹期m天.

在圖6B中還有一條大小約為2.90×104的蛋白條帶，推測可能是由于BmFKBP45發(fā)生了剪接而造成的. 由于FKBPs家族的同源性較高，此蛋白條帶也可能是這個家族中的其他成員. 在Western blot中所用的抗體是BmFKBP45多克隆抗體，這也可能是出現(xiàn)非特異條帶的原因之一.

2.4 BmFKBP45對激素20E和JH的響應(yīng)情況

研究表明，保幼激素JH III對果蠅DmFKBP39的表達(dá)具有誘導(dǎo)作用[11]，為了研究激素對家蠶BmFKBP45的表達(dá)是否具有影響，對L5D3家蠶幼蟲注射2 μg蛻皮激素(20E)或JH類似物甲氧普烯(methoprene)，在處理1、2、4、8、16、32 h后提取翅原基RNA，利用qRT-PCR檢測BmFKBP45對激素的響應(yīng)情況. 結(jié)果顯示，與二甲基亞砜(DMSO)對照比較，注射20E及甲氧普烯對BmFKBP45的表達(dá)并沒有顯著的影響(圖7).

圖7 qRT-PCR檢測20E和methoprene對翅原基BmFKBP45 mRNA表達(dá)的影響

Figure 7 qRT-PCR analysis of mRNA expression ofBmFKBP45 in response to 20E and methoprene treatments

2.5 Pull-down檢測與BmFKBP45互作的蛋白

BmFKBP45是親免蛋白家族的成員. 目前對FKBP12、FKBP52等親免蛋白研究較多，但對BmFKBP45的功能研究尚缺乏. 本研究通過Pull-down技術(shù)鑒定家蠶中與BmFKBP45相互作用的未知蛋白，從而為闡明BmFKBP45的功能提供線索. 把帶有His標(biāo)簽的BmFKBP45固定到His·Beads上，然后將提取的翅原基細(xì)胞蛋白通過栓層析分離，洗滌除去不能結(jié)合的蛋白后進行SDS-PAGE分析(圖8)，第1泳道是將體外表達(dá)BmFKBP45的菌體總蛋白過柱子后洗脫下來的樣品，第2泳道是把BmFKBP45固定到His·Beads上，再將翅原基細(xì)胞蛋白過親和柱，經(jīng)過洗脫留下的樣品，第3泳道是只將翅原基蛋白過親和柱的洗脫樣品. 與第1和第3泳道對比，在第2泳道的3.50×104～4.0×104及2.50×104～3.50×104處各出現(xiàn)了一條差異條帶(箭頭所指)，分別命名為D1和D2.

1：BmFKBP45純化蛋白(對照)；2：BmFKBP45的 Pull-down產(chǎn)物；3：翅原基蛋白(對照)

圖8 Pull-down檢測與BmFKBP45互作的蛋白

Figure 8 Pull-down analysis of the interactive proteins with BmFKBP45

提取D1和D2蛋白進行MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析，然后將檢測到的蛋白肽與NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫進行序列比對，共鑒定到20個蛋白質(zhì). 其中D1蛋白條帶包括逆轉(zhuǎn)錄酶、細(xì)胞骨架蛋白、能量轉(zhuǎn)換蛋白及與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的蛋白質(zhì)(表2). D2蛋白條帶主要包括表皮幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白和30K蛋白. 根據(jù)保守的基序, 表皮蛋白分為R&R、Tweedle、CPF 及CPFL等家族. D2蛋白條帶中的表皮幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白屬于R&R家族，具有結(jié)合幾丁質(zhì)的能力. 家蠶30K蛋白的相對分子量約為3.0×104，是一群核苷酸和氨基酸序列高度相似的低分子量脂蛋白. 有些30K蛋白的合成受激素調(diào)控. 30K蛋白是末齡幼蟲和蛹期血液中含量最大的一群蛋白，能抑制蛻皮激素誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡. 此外，30K蛋白可以與葡萄糖和葡聚糖結(jié)合，在昆蟲的自我防御中起作用. 在D2蛋白條帶中鑒定出2個30K蛋白，其GenBank登錄號、蛋白分值分別是:gi|126415,182;gi|225905552,175. 經(jīng)過對這2個蛋白的氨基酸序列進行比對后發(fā)現(xiàn)，它們的氨基酸數(shù)目一致，但存在一個氨基酸的差異，這可能是由測序誤差或核苷酸多態(tài)性造成的，因此這2個蛋白可能是同一種蛋白，即Bm6G1蛋白. 有研究表明，Bm6G1通過結(jié)合BmEcR從而抑制20E的信號傳導(dǎo)[13]. 當(dāng)體內(nèi)存在高滴度的JH時，DmFKBP39大量表達(dá)，并通過結(jié)合DmEcR來抑制20E的信號傳導(dǎo)[8]. Bm6G1和DmFKBP39都可以與EcR結(jié)合，說明30K蛋白、FKBPs蛋白和EcR有可能形成30K/FKBPs/EcR復(fù)合物從而發(fā)揮作用. 因此，本研究進一步分析Bm6G1蛋白與BmFKBP45的相互作用及功能.

表2 D1蛋白條帶MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定結(jié)果

2.6 Bm6G1的克隆及表達(dá)

2.6.1Bm6G1的克隆 利用翅原基cDNA作為模板克隆得到了Bm6G1(GenBank Accession number:NM_001044021)的ORF(圖9).Bm6G1編碼256個氨基酸，預(yù)測相對分子量大小為3.0×104，等電點為6.25. 將克隆出來的Bm6G1經(jīng)過BamH I和HindIII雙酶切后，連接到蛋白表達(dá)載體pET-32a上，用酶切驗證重組質(zhì)粒(圖10).

2.6.2 體外誘導(dǎo)Bm6G1蛋白的表達(dá) 將Bm6G1/pET-32a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Rosetta(DE3)大腸桿菌中，在37 ℃的培養(yǎng)條件下，用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá). 以空載體pET-32a作為對照. Bm6G1的預(yù)測相對分子量為3.0×104，加上載體上相對分子量為1.83×104的His-tag標(biāo)簽，其預(yù)測大小為4.83×104. SDS-PAGE結(jié)果顯示(圖11)，Bm6G1/pET-32a重組質(zhì)粒(第2泳道)和對照組(第1泳道)相比，表達(dá)出了一個大小與預(yù)測相對分子量一致的蛋白. 該重組蛋白主要以包涵體的形式存在的(第4泳道). 利用His-tag柱將已經(jīng)變性的Bm6G1重組蛋白進行了純化(第5泳道).

圖9 Bm6G1 ORF的PCR擴增

圖10 Bm6G1/pET-32a重組質(zhì)粒雙酶切分析

Figure 10 Double enzyme digestion of the recombinant plasmid of Bm6G1/pET-32a

1：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的空載體菌體蛋白(對照)；2：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體重組蛋白；3：誘導(dǎo)的菌體重組蛋白上清；4：誘導(dǎo)的菌體重組蛋白沉淀；5：純化的蛋白

圖11 SDS-PAGE 檢測Bm6G1重組蛋白的表達(dá)

Figure 11 SDS-PAGE detection of expression of Bm6G1 recombinant protein

2.7 BmFKBP45與Bm6G1的相互作用

2.7.1 Far-western blot驗證BmFKBP45與Bm6G1的相互作用 在Pull-down的蛋白中，發(fā)現(xiàn)了Bm6G1能與 BmFKBP45發(fā)生結(jié)合. 利用Far-western blot進一步驗證這2個蛋白質(zhì)是否存在相互作用. 將純化的Bm6G1進行SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，用重組純化的BmFKBP45蛋白與之孵育后用BmFKBP45抗體檢測. 結(jié)果表明，與未用BmFKBP45蛋白進行孵育的對照相比(圖12C)，用BmFKBP45蛋白進行孵育后在Bm6G1處出現(xiàn)了條帶(第4泳道)，而負(fù)對照組(用BSA孵育)沒有出現(xiàn)該蛋白條帶(第3泳道)，這表明在膜上的Bm6G1蛋白能與重組的BmFKBP45蛋白發(fā)生特異結(jié)合，結(jié)合后的蛋白復(fù)合物可被BmFKBP45蛋白抗體識別(圖12B).

反過來，將純化的BmFKBP45進行SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，用重組純化后的Bm6G1與之孵育后用Bm6G1抗體檢測. 結(jié)果表明，與未用Bm6G1蛋白進行孵育的對照相比(圖13C)，用Bm6G1蛋白進行孵育后在BmFKBP45處出現(xiàn)了條帶(第4泳道)，而負(fù)對照組(用BSA孵育)沒有出現(xiàn)蛋白條帶(第3泳道)，這表明在膜上的BmFKBP45蛋白能與重組純化的Bm6G1蛋白發(fā)生特異結(jié)合，結(jié)合后的蛋白復(fù)合物可被Bm6G1蛋白抗體識別(圖13B).

1、3：BSA；2、4、5:Bm6G1純化蛋白

圖12 利用BmFKBP45抗體進行Far-western blot檢測BmFKBP45與Bm6G1的相互作用

Figure 12 Far-western blot analysis of the interaction between BmFKBP45 and Bm6G1 by BmFKBP45 antibody

1、3：BSA；2、4、5:BmFKBP45純化蛋白

圖13 利用Bm6G1蛋白抗體進行Far-western blot檢測BmFKBP45與Bm6G1的相互作用

Figure 13 Far-western blot analysis of the interaction between BmFKBP45 and Bm6G1 by using Bm6G1 antibody

2.7.2 Co-IP檢測BmFKBP45與Bm6G1的相互作用 Far-western blot是在體外進行的蛋白結(jié)合實驗，為了檢測這2個蛋白在家蠶體內(nèi)是否也會發(fā)生相互作用，提取剛進入蛹期(P0)的家蠶翅原基組織蛋白，用BmFKBP45多克隆抗體進行免疫共沉淀，所得的蛋白復(fù)合物進行SDS-PAGE分離后用Bm6G1多克隆抗體進行Western blot檢測. 在圖14中，當(dāng)加入BmFKBP45蛋白抗體、翅原基組織蛋白及Protein A/G-Plus Beads進行孵育并洗滌時，在約3.0×104處出現(xiàn)了一條蛋白條帶(第1泳道)，而第4次洗滌后的洗出液在3.0×104處沒有出現(xiàn)該蛋白條帶(第4泳道)，說明洗滌效果較好. 當(dāng)加入翅原基組織蛋白及Protein A/G-Plus Beads進行孵育(第2泳道)，或加入免疫前血清、翅原基組織蛋白及Protein A/G-Plus Beads進行孵育(第3泳道)時，在約3.0×104處均沒有出現(xiàn)蛋白條帶，表明在實驗組第1泳道的約3.0×104處的蛋白不與Protein A/G-Plus Beads和免疫前血清發(fā)生結(jié)合，而是與BmFKBP45蛋白發(fā)生特異結(jié)合而被沉淀下來的蛋白. 3.0×104處的蛋白條帶大小與Bm6G1(3.0×104)的大小相近，因此，可以認(rèn)為該3.0×104蛋白是Bm6G1蛋白. 綜上所述，BmFKBP45蛋白與Bm6G1蛋白在體內(nèi)也是可以發(fā)生特異結(jié)合的.

圖14 Co-IP檢測翅原基中BmFKBP45與Bm6G1的相互作用

Figure 14 Co-IP detection of the interaction between BmFKBP45 and Bm6G1 in the wing discs

3 討論

WU等[9]在果蠅中發(fā)現(xiàn)了一個親免蛋白家族成員DmFKBP39參與了JH的調(diào)控通路. 本研究的主要目的是探究在家蠶中與DmFKBP39同源的BmFKBP45的可能功能.

以DmFKBP39蛋白序列為參考序列，在家蠶數(shù)據(jù)庫中SilkDB中進行Blast后并沒有找到完全對應(yīng)的BmFKBP39，但鑒定到了3個同源蛋白BmFKBP45、BmFKBP12和BmFKBP59. 其中BmFKBP45與DmFKBP39相似性為43.7%. 對這2個蛋白的序列結(jié)構(gòu)進一步分析發(fā)現(xiàn)(圖1)，它們都含有酸性氨基酸區(qū)域和堿性氨基酸區(qū)域，堿性區(qū)域內(nèi)都含有核定位信號(NLS). 除此之外，它們都具有一個肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域. BmFKBP45酸性區(qū)域的氨基酸數(shù)目比DmFKBP39多，并且BmFKBP45比DmFKBP39多了一個堿性區(qū)域. 綜上所述，BmFKBP45和DmFKBP39這2個蛋白除了氨基酸數(shù)目有差異外，整體上它們的結(jié)構(gòu)是很相似的，推測家蠶BmFKBP45可能是果蠅中的DmFKBP39的同源蛋白，它們可能具有類似的功能.

研究表明，分子伴侶蛋白復(fù)合物主要包括肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(FKBP51、FKBP52和Cyp40)、分子伴侶(Hsp90和Hsc70)及分子伴侶相互作用蛋白(Hop、Hip和p23)等蛋白組分，具有輔助蛋白發(fā)生正確折疊或穩(wěn)定蛋白復(fù)合體的作用[6,14-15]. BmFKBP45應(yīng)該是一個肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶. 但同時通過對BmFKBP45的序列分析發(fā)現(xiàn)，BmFKBP45具有一個位于C末端的PPIase結(jié)構(gòu)域、核定位信號及潛在的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(圖1)，這表明BmFKBP45在家蠶體內(nèi)既可能是一個分子伴侶，還可能是一個調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的DNA結(jié)合蛋白. 通過對BmFKBP45基因進行RT-PCR檢測和對BmFKBP45蛋白進行Western blot分析，這2個實驗的結(jié)果顯示BmFKBP45的表達(dá)在mRNA及蛋白質(zhì)水平的變化情況一致，即在幼蟲期高表達(dá)、蛹期低表達(dá)(圖6)，并且家蠶microarray分析也顯示其在各個組織都有高水平的表達(dá). BmFKBP45的表達(dá)沒有明顯的時期及組織特異性，與這個家族蛋白的廣泛分布和組成型表達(dá)的特性一致. 但相對蛹期來說，其在家蠶幼蟲期處于一個比較高的表達(dá)水平，這與ZHANG等[16]利用鳥槍法蛋白質(zhì)分析并結(jié)合MS測序?qū)倚Q翅原基組織的蛋白組分的分析結(jié)果相似. 幼蟲期是家蠶向外界吸收營養(yǎng)(進食桑葉)的發(fā)育階段，此時更容易受到外界病原體的入侵. 親免蛋白BmFKBP45在幼蟲期上調(diào)表達(dá)，可能與親免蛋白家族蛋白的免疫調(diào)節(jié)功能有關(guān)[15]. 另外，家蠶幼蟲處于生長比較旺盛的時期，體內(nèi)大量合成蛋白質(zhì)，需要分子伴侶蛋白復(fù)合物穩(wěn)定或折疊大量合成的蛋白及其復(fù)合體. 隨著家蠶翅原基的不斷發(fā)育，特別是在蛹期后期，翅原基細(xì)胞增殖能力降低，細(xì)胞內(nèi)合成蛋白質(zhì)減少，所以對一些分子伴侶或核蛋白如BmFKBP45的需求逐漸降低. 這可能是BmFKBP45在幼蟲期上調(diào)表達(dá)而在蛹后期下調(diào)表達(dá)的原因.

激素處理結(jié)果顯示，BmFKBP45在體內(nèi)的表達(dá)并沒有受到這2種激素明顯的誘導(dǎo)或者抑制(圖7). 這說明BmFKBP45與DmFKBP39不一樣，它的表達(dá)不受到激素的直接調(diào)控. 另一方面，對BmFKBP45的啟動子進行分析發(fā)現(xiàn)，它含有5個熱激因子(Heat Shock Factor，HSF)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點[17]. 當(dāng)生物細(xì)胞受到熱脅迫時，活化的熱激因子HSF會識別并結(jié)合到熱激蛋白Hsp基因的啟動子區(qū)域的熱激元件上，從而起始Hsp基因的轉(zhuǎn)錄. 有研究表明，當(dāng)古生菌和細(xì)菌受到熱脅迫時，F(xiàn)KBPs會迅速且大量地合成[18-20]. 因此，推測熱脅迫促使HSF與BmFKBP45上的熱激元件結(jié)合，從而激活BmFKBP45的轉(zhuǎn)錄.

Bm6G1屬于30K蛋白家族成員，目前研究表明這個蛋白家族主要在免疫防御、細(xì)胞凋亡及胚胎發(fā)育等過程中起著重要的作用. 在家蠶中，30K蛋白Bm6G1和Bm19G1能結(jié)合葡萄糖、葡聚糖及昆布二糖等糖分子，可能在啟動家蠶免疫防御系統(tǒng)，抵抗外界真菌的侵染時發(fā)揮了關(guān)鍵的作用[21-22]. 將不含30K蛋白的家蠶血清及含30K蛋白的家蠶血清加入昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)含30K蛋白的家蠶血清抑制細(xì)胞凋亡的能力更強[23]. 純化的家蠶30K BmLPl重組蛋白也可以抑制昆蟲或哺乳動物細(xì)胞發(fā)生凋亡. Bm6G1蛋白能與USP競爭結(jié)合EcR-B1，從而抑制了20E通過USP/ EcR-B1復(fù)合體所誘發(fā)的細(xì)胞凋亡[13]. 在家蠶胚胎的卵黃蛋白中，約35%是30K蛋白[11]. 隨著胚胎的不斷發(fā)育，胚胎中的30K蛋白質(zhì)逐漸減少[24]. 而有研究表明30K蛋白可以被剛孵化的蟻蠶提取物中的30kP蛋白酶A降解[25]，推測在家蠶胚胎發(fā)育的過程中，30K蛋白可能被30kP蛋白酶A降解成氨基酸小分子，為合成其他功能蛋白提供氨基酸來源[26]，從而幫助胚胎的發(fā)育.

目前，對家蠶BmFKBP45的研究很少. SOMARELLI等[17]首次發(fā)現(xiàn)BmFKBP45可以與U1 snRNA結(jié)合，推測它參與前體mRNA的剪接加工. BmFKBP45含有谷氨酸/天冬氨酸片段及賴氨酸/精氨酸片段，它們交替出現(xiàn)，這種結(jié)構(gòu)在核蛋白、FKBP25和FKBP46中起著介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用或者賦予蛋白結(jié)合核酸的功能[5,17,27]. 許多FKBPs蛋白是免疫抑制劑FK506和雷帕霉素的胞內(nèi)受體，這些抑制劑通過結(jié)合FKBP12分別作用于鈣調(diào)磷酸酶/NF-AT信號通路和雷帕霉素靶蛋白信號通路，抑制機體發(fā)生免疫反應(yīng)[3-4]. FKBP38被RNAi后，導(dǎo)致抗凋亡因子Bcl-2的結(jié)構(gòu)異常，推測FKBP38發(fā)揮了一個分子伴侶的作用，通過穩(wěn)定Bcl-2的構(gòu)象而參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程[2]. 在果蠅中，DmFKBP39通過與DmChd64、DmEcR、DmUSP和DmMet等蛋白互作形成復(fù)合物，結(jié)合到DmJHRE1上從而調(diào)控JH應(yīng)答基因的表達(dá)[8].

BmFKBP45與Bm6G1的相互作用尚未見報道，是本研究的新發(fā)現(xiàn). 雖然尚不清楚兩者相互作用的具體機理及功能. 對家蠶翅原基組織的蛋白組分分析及MS測序，發(fā)現(xiàn)BmFKBP45在家蠶幼蟲期大量表達(dá)[24]，這與本研究的結(jié)果一致(圖 6). 幼蟲期是家蠶向外界吸收營養(yǎng)(進食桑葉)的發(fā)育階段，此時更容易受到外界病原體的入侵. 親免蛋白BmFKBP45在幼蟲期上調(diào)表達(dá)，可能與親免蛋白家族的免疫調(diào)節(jié)功能有關(guān)[15]. Bm6G1作為家蠶的先天免疫系統(tǒng)中的模式識別受體，通過識別并結(jié)合葡聚糖等病原體模式分子激活家蠶體內(nèi)的免疫應(yīng)答[21]. 因此,我們推測BmFKBP45與Bm6G1結(jié)合后，可能共同參與免疫反應(yīng)過程；另外，BmFKBP45含有NLS及能結(jié)合核酸的谷氨酸/天冬氨酸片段及賴氨酸/精氨酸片段[17]，暗示其可能具有進核和結(jié)合核酸的能力. BmFKBP45與Bm6G1結(jié)合后，可能調(diào)節(jié)BmFKBP45結(jié)合DNA靶標(biāo)元件的活性，或是阻止BmFKBP45遷移到核內(nèi)，這些假設(shè)還有待實驗證明. 第三，MsFKBP46能與MsEcR/MsUSP結(jié)合形成復(fù)合物[7]；DmFKBP39也能與DmEcR/DmUSP結(jié)合，抑制了20E的信號傳導(dǎo)途徑[8]；Bm6G1通過結(jié)合BmEcR從而抑制20E的信號傳導(dǎo)途徑[13]. MsFKBP46、DmFKBP39和Bm6G1都可以與EcR結(jié)合并參與激素的調(diào)控過程，說明30K蛋白、FKBPs蛋白和EcR有可能形成30K/FKBPs/EcR復(fù)合物從而在激素調(diào)控中發(fā)揮作用. 本研究已經(jīng)證明了BmFKBP45與Bm6G1的相互作用，而它們能否與BmEcR結(jié)合及在激素調(diào)控中發(fā)揮作用還有待研究. BmFKBP45的表達(dá)不受到激素的影響，而Bm6G1的表達(dá)受到JH的抑制[28]，說明這2個蛋白的相互作用可能會受到體內(nèi)JH的抑制.

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【中文責(zé)編：莊曉瓊 英文責(zé)編：李海航】

Expression and Functional Analysis of BmFKBP45 in the Silkworm, Bombyx mori

CHEN Yuhui, HUANG Jinhua, FENG Qili*, DENG Huimin*

(Guangzhou Key Laboratory of Development Regulation and Application Research of Insects, School of Life Sciences, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

The expression and function of theDrosophilaDmFKBP39 homolog in the silkworm, BmFKBP45, were analyzed in this study. By comparing the amino acid sequences of DmFKBP39 and BmFKBP45, it is found that both of them contained an acidic amino acid region, a basic amino acid region, a nuclear localization signal and a FKBP domain. Alignment for the DNA binding domain of HMG2 with the second basic region of BmFKBP45 shows a similarity of 21%, suggesting that BmFKBP45 may be capable of DNA binding through the second basic amino acid region. However, EMSA experiment showed that BmFKBP45 did not bind to DmJHRE1. The RT-PCR and western blot results indicated that BmFKBP45 expressed at different developmental stages in the silkworm wing disc and its expression decreased gradually during the pupal period. The hormone treatment assays demonstrated that the expression of BmFKBP45 was not changed by either ecdysone (20E) or juvenile hormone (JH). The pull-down, far-western blot and Co-IP experiments indicated an interaction between BmFKBP45 and Bm6G1, which provides a new perspective for further exploring the function of BmFKBP45.

Bombyxmori; BmFKBP45; immunophilin; ecdysone; juvenile hormone; 30K protein

2016-09-21 《華南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目(“973計劃”,2012CB114602)；國家自然科學(xué)基金項目(31330071，31301918)

Q986

A

1000-5463(2016)06-0001-12

*通訊作者:馮啟理，教授，Email:qlfeng@scnu.edu.cn；鄧惠敏，講師，Email:denghuiminmin@163.com.