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南極適冷菌Psychrobacter sp. G冷激蛋白基因Csp2039的表達分析*

2016-12-12 02:38:52林學(xué)政
海洋科學(xué)進展 2016年1期
關(guān)鍵詞:鹽度南極低溫

李 陽,車 帥,王 楨,林學(xué)政*

(1.國家海洋局 第一海洋研究所,山東 青島,266061;2.國家海洋局 海洋生物活性物質(zhì)重點實驗室,山東 青島, 266061)

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南極適冷菌Psychrobacter sp. G冷激蛋白基因Csp2039的表達分析*

李 陽1,2,車 帥1,2,王 楨1,2,林學(xué)政1,2*

(1.國家海洋局 第一海洋研究所,山東 青島,266061;2.國家海洋局 海洋生物活性物質(zhì)重點實驗室,山東 青島, 266061)

以南極適冷菌Psychrobactersp. G為研究對象,利用qRT-PCR和Western blot技術(shù)從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平對冷激蛋白基因Csp2039在不同溫度/鹽度脅迫條件下的表達特征進行了研究。在轉(zhuǎn)錄水平上,qRT-PCR分析表明,冷激蛋白基因Csp2039的表達于6 h時顯著被低溫(0 ℃,10 ℃)和高溫(30 ℃)誘導(dǎo);低鹽(0)脅迫下,基因Csp2039的表達先被誘導(dǎo)后被抑制,在鹽度為15的脅迫下,基因Csp2039的表達均被誘導(dǎo),高鹽(90,120)時基因Csp2039的表達在6 h時顯著被誘導(dǎo);在溫度和鹽度協(xié)同脅迫條件下,溫度為0 ℃時,無論鹽度高低,基因Csp2039的表達均顯著上升,而高溫(30 ℃)時,除2 h被低鹽誘導(dǎo)以外,其余條件下均顯著被抑制。在翻譯水平上,Western blot分析表明,冷激蛋白Csp2039的表達被低溫(0 ℃,10 ℃)顯著誘導(dǎo),但高溫(30 ℃)對其抑制并不明顯;在低鹽(0,15)脅迫下,Csp2039蛋白的表達均被誘導(dǎo),高鹽(90)脅迫下,Csp2039蛋白的表達先被抑制,然后逐漸升高;在溫度和鹽度協(xié)同脅迫條件下,低溫(0 ℃)時,當(dāng)鹽度為15時,Csp2039蛋白的表達被誘導(dǎo),鹽度為90時,Csp2039蛋白的表達量被顯著抑制;而高溫(30 ℃)時,該蛋白在鹽度15時6 h的表達量最大,鹽度90時于6 h其表達被顯著抑制。比較分析表明,在轉(zhuǎn)錄水平上基因Csp2039表達量的變化更容易受溫度影響,而在翻譯水平上鹽度對Csp2039蛋白的影響作用大于溫度;基因Csp2039在翻譯水平上對溫度/鹽度脅迫的應(yīng)答時間要遲于轉(zhuǎn)錄水平的。

Psychrobacter;冷激蛋白基因Csp2039;qRT-PCR;Western blot;表達分析

南極具有獨特的地理、環(huán)境和氣候特征,如寒冷、干燥、低營養(yǎng)、強輻射等[1]。微生物在南極生態(tài)系統(tǒng)及物質(zhì)地球化學(xué)循環(huán)中起著重要作用,同時,基礎(chǔ)研究及開發(fā)應(yīng)用前景也很廣闊。在這一極端的生態(tài)系統(tǒng)中,生態(tài)學(xué)中處于明顯優(yōu)勢的是低溫微生物,主要嗜冷菌和適冷菌為主[2],具有多種適應(yīng)環(huán)境的機制,如極地微生物可以產(chǎn)生在低溫下具有較高酶活力的低溫酶[3];也可以通過降低細(xì)胞膜脂肪酸的不飽和度、碳鏈長度以及增加支鏈脂肪酸的含量來提高細(xì)胞膜的流動性,從而維持細(xì)胞膜功能[4-5];冷激基因能夠正常表達產(chǎn)生冷激蛋白[6]等。冷激蛋白(cold shock protein,Csp)作為RNA的分子伴侶,可阻止mRNA在低溫下形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu),從而保持基因的表達效率,提高蛋白合成能力,維持正常的生理功能[6]。

冷激蛋白是指生物體在低溫刺激下所產(chǎn)生的一系列小分子蛋白質(zhì),廣泛存在于嗜冷和嗜溫微生物中[7-8],包括大腸桿菌[9]、枯草芽孢桿菌[10]、球形節(jié)桿菌[11]、假單胞菌[12]等。大腸桿菌Csp蛋白家族主要包括9種冷激蛋白(CspA~CspI),其中CspA,CspB,CspE,CspG和CspI與冷激適應(yīng)調(diào)制機制有關(guān),均能被低溫誘導(dǎo)[13],CspD對大腸桿菌生長穩(wěn)定期的DNA復(fù)制有抑制作用,但不能被低溫誘導(dǎo)[14]。在對冷激蛋白的研究中以對CspA的研究最多。CspA由70個氨基酸組成,三維結(jié)構(gòu)包括由5個反向平行的β鏈組成的2個β折疊的β桶狀結(jié)構(gòu)和7個表面芳香烴結(jié)構(gòu),用來結(jié)合單鏈DNA[15]。大腸桿菌CspA基因序列在5'端有一段比較長的高度保守的非翻譯區(qū),對CspA基因表達起著非常重要的作用[15];當(dāng)溫度降低時,CspA基因的表達在轉(zhuǎn)錄水平上顯著上升[16]。在極地細(xì)菌適應(yīng)低溫環(huán)境中冷激蛋白也起著重要的作用,低溫可以誘導(dǎo)冷激蛋白基因的表達以適應(yīng)外界溫度的變化[17]。南極適冷菌Psychrobactersp. G中有3個冷激蛋白基因,qRT-PCR研究表明,屬于CspA蛋白家族的基因Csp2039在低溫條件下(0 ℃)表達量顯著增加[18]。為進一步了解南極細(xì)菌的生境適應(yīng)機制,本研究利用qRT-PCR和Western Blot技術(shù)對南極適冷菌Psychrobactersp. G中的Csp2039基因在不同溫度、鹽度和溫鹽協(xié)同脅迫條件下、在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的表達情況進行了研究。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

南極適冷菌Psychrobactersp. G分離自南極喬治王島西南部的海水并保存于本實驗室,該菌株的最適生長溫度是20 ℃,最適生長鹽度是45[19]。

南極適冷菌Psychrobactersp. G最適鹽度培養(yǎng)基:胰蛋白胨5 g,酵母粉1 g,NaCl 14 g,溶解于1 L過濾后的青島近海海水(鹽度約為31)中,并于1×105Pa下濕熱滅菌20 min[18],所使用不同鹽度培養(yǎng)基的成分見表1。

表1 培養(yǎng)基成分Table 1 Component of culture medium

1.2 冷激蛋白基因Csp2039原核表達體系的構(gòu)建

1.2.1 引物設(shè)計與冷激蛋白基因Csp2039的擴增

根據(jù)基因組測序結(jié)果(CP006265),設(shè)計用于冷激蛋白基因Csp2039克隆的特異性引物,在其5′端分別引入相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI的酶切位點(表2)。

表2 擴增冷激蛋白基因Csp2039的特異性引物Table 2 Specific primers used in amplification of gene Csp2039

特異性引物由博尚生物技術(shù)有限公司合成。以南極適冷菌Psychrobactersp. G的基因組為模板,進行PCR擴增。PCR條件如下:95 ℃ 5 min;95 ℃ 45 s,42 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。

1.2.2 表達載體pET22b和目的基因的連接

目的基因Csp2039經(jīng)PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳分離后,用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)切膠回收目的片段,分別用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI對載體pET 22b和目的基因Csp2039進行雙酶切,于37 ℃水浴中酶切過夜(12 h)后,用DNA產(chǎn)物純化試劑盒(北京天根生化科技有限公司)對目的片段進行純化回收。調(diào)整目的基因DNA和載體的摩爾數(shù)比例約為1/10~1/5,加入T4 DNA連接酶,將混合反應(yīng)物于16 ℃水浴中過夜(12 h)連接,連接反應(yīng)產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α。

1.2.3 重組子的鑒定、轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)表達和重組蛋白的純化

挑取37 ℃過夜培養(yǎng)后在LB培養(yǎng)基平板上長出的單菌落,移種于含終濃度為100 μg/mL Amp的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。為確定插入基因片段的序列準(zhǔn)確性,送新鮮菌液至南京金斯瑞有限公司用T7引物測序。用普通質(zhì)粒小提試劑盒(北京天根生化科技有限公司)從重組質(zhì)粒測序結(jié)果正確的菌液中提取質(zhì)粒,然后轉(zhuǎn)化表達型宿主感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3),涂布于重組子篩選平板。將獲得的表達型宿主菌E.coliBL21(DE3)-pET22b+Csp2039用終濃度為1 mmol/L的IPTG對重組菌進行誘導(dǎo)表達。

利用Ni+親和層析法純化目的重組蛋白,將濃縮后的純化重組蛋白送GenScript公司(南京)制備多克隆抗體(Order ID:5001978-1)。

1.3 脅迫處理

首先將菌株G在最適生長溫度(20 ℃)和鹽度(45)條件下于250 mL的Zobell 2216E培養(yǎng)基中培養(yǎng),待培養(yǎng)液OD600達到約0.5時(指數(shù)生長期),進行如下脅迫處理:1)溫度脅迫:將菌株分別于0,10和30 ℃培養(yǎng),并分別于2,6和12 h時各取樣2 mL于-80 ℃保存,將剩余菌液8 000 g離心5 min后用50 mmol Tris-HCl(pH=8.0)重懸,并用Constant Systems高壓細(xì)胞破碎儀(One Shot)破碎菌體,破碎后液體置于-20 ℃保存。2)鹽度脅迫:將OD600約為0.5的培養(yǎng)液于20 ℃下8 000 g離心5 min,收集菌體。將獲得的菌體分別重懸于與離心前體積相等的、鹽度分別為0,15,90和120的培養(yǎng)基中。重懸后的菌體分別于20 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2,6和12 h后各取樣2 mL于-80 ℃保存,剩余菌液處理方法同溫度脅迫。3)溫度鹽度協(xié)同脅迫:按照鹽度脅迫的操作方法,將OD600約為0.5的培養(yǎng)液分別于如下條件下繼續(xù)培養(yǎng):溫度0 ℃,鹽度15;溫度30 ℃,鹽度15;溫度0 ℃,鹽度90;溫度30 ℃,鹽度90。菌株于上述條件下分別繼續(xù)培養(yǎng)2,6和12 h后各取樣2 mL于-80 ℃保存。最適生長條件下(溫度為20 ℃,鹽度為45)繼續(xù)培養(yǎng)的菌株于相同時間點(2,6和12 h)取樣設(shè)為對照,進行轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的差異表達分析。

1.4 qRT-PCR分析

利用RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取了經(jīng)不同溫度、鹽度脅迫處理和不同時間處理的菌株G的總RNA,獲得的總RNA的質(zhì)量通過測定其A260/A280值確定。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Reagent Kit (大連寶生物工程有限公司)將得到的1 000 ng RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用SYBRPremixExTaqTMII(大連寶生物工程有限公司)試劑盒進行qRT-PCR分析。利用軟件Primer 5.0設(shè)計用于基因Csp2039 qRT-PCR的引物(F:GCTAAAGGTTTTGGTT; R: GCTCAGCTTGTGGG),內(nèi)參基因選定為GAPDH (F: AGTCAGGCACATTTAGCG; R:GGCATAGCCCCATTCATT)[18,20]。qRT-PCR程序參數(shù)設(shè)定:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,退火(Csp2039:44 ℃,GAPDH:51 ℃)20 s,72 ℃ 20 s,40個循環(huán);95 ℃ 1 min,退火(Csp2039:44 ℃,GAPDH:51 ℃)30 s,95 ℃ 30 s。所有實驗均重復(fù)3次?;谂R界循環(huán)值(Ct)對基因Csp2039的mRNA進行定量,采用相對Ct值法(2-ΔΔCt)處理所得數(shù)據(jù),對照組基因表達量標(biāo)準(zhǔn)化為1[21],并對樣本的重復(fù)性以及樣本間的差異進行統(tǒng)計分析。本研究中為實驗組分別與對照組比較。

1.5 Western blot檢測

冷激蛋白Csp2039不同脅迫條件下在翻譯水平上的表達研究采用Western blot技術(shù)進行[22]。步驟如下:

1)SDS-PAGE電泳完成后,將濃縮膠部分去除,用適量的轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡膠大約15 min;

2)根據(jù)膠的大小,剪一張同樣大小的PVDF膜,剪去一角作為正反面的標(biāo)記,PVDF膜要用適量的甲醇浸泡30 s后轉(zhuǎn)至轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡膜約15 min;

3)根據(jù)PVDF膜的大小剪切4塊厚濾紙(濾紙的大小應(yīng)略大于PVDF膜的大小),將剪好的濾紙放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中,平衡約10 min;

4)向轉(zhuǎn)膜器的操作板上倒入少量的轉(zhuǎn)膜緩沖液,從陽極面到陰極面將濾紙、PVDF膜、SDS-PAGE膠按照濾紙-濾紙-PVDF膜-SDS-PAGE膠-濾紙-濾紙的順序疊加起來,每加一層時用玻璃棒趕出氣泡,并加入適量的轉(zhuǎn)膜緩沖液,保持電流恒定為280 mA,轉(zhuǎn)膜時間為100 min;

5)電轉(zhuǎn)完成后,PVDF膜在含5%脫脂奶粉的TBST的封閉液中4 °C輕搖3 h;

6)一抗抗血清以1∶5 000稀釋于封閉液中4 ℃過夜;

7)用適量TBST洗膜3次,每次輕搖10 min;

8)Goat Anti Rabbit IgG [HRP]以1∶5 000稀釋于封閉液中,4 ℃輕搖3 h;

9)TBST洗膜3次,每次輕搖10 min;TBS洗膜1次,10 min;

10)加入發(fā)色液(9 mL TBS,1 mL 4-氯-1-萘酚,6 μL 30%H2O2)暗室中發(fā)色約40 min,到適當(dāng)程度以水終止。

完成以后,將有條帶的PVDF膜進行灰度掃描,確定在翻譯水平上冷激蛋白基因Csp2039的表達情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷激蛋白Csp2039在重組菌中的表達和純化

重組菌株pET22b+Csp2039/BL21(DE3)于20 ℃經(jīng)IPTG(為1 mmol/L)誘導(dǎo)表達24 h,高壓細(xì)胞破碎后不同細(xì)胞組分分別與5×SDS上樣緩沖液混合煮沸,進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),結(jié)果如圖1所示??梢钥闯觯c未誘導(dǎo)對照相比較,重組菌株于分子量約7 kDa處出現(xiàn)了明顯條帶,與預(yù)測的Csp2039)分子量(6.5 kDa)基本一致。本研究將純化后的蛋白作為抗原送至GenScript公司(南京)進行多克隆抗體的制備,經(jīng)檢測后確定為冷激蛋白Csp2039的有效多克隆抗體,制備好的抗體用于Western blotting,檢測冷激蛋白Csp2039不同脅迫條件下在翻譯水平上的表達情況。

圖1 Csp2039蛋白電泳圖

2.2 對溫度的應(yīng)答特征

冷激蛋白基因Csp2039的表達在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平基本上是被低溫誘導(dǎo)的。

qRT-PCR(圖2)表明,菌株G的冷激蛋白基因Csp2039的表達在轉(zhuǎn)錄水平上于6 h時顯著被低溫(0 ℃,10 ℃)誘導(dǎo),相對表達量最大,其中0 ℃時,其表達呈極顯著性差異,約為對照的8.0倍;在之后的6 h表達量逐漸下降,于12 h反而被顯著抑制。在高溫(30 ℃)時,Csp2039基因的表達先被抑制,在隨后的6 h顯著升高,表達量約為對照組的2.3倍;在之后的6 h中表達量又逐漸下降。

Western blot結(jié)果(圖3a)經(jīng)灰度掃描后分析極表明(圖3b),冷激蛋白基因Csp2039在蛋白水平上的表達于6 h時被低溫(0 ℃,10 ℃)顯著誘導(dǎo),被高溫(30 ℃)抑制,但應(yīng)答速度相對于轉(zhuǎn)錄水平滯后。在低溫(0 ℃,10 ℃)脅迫下,2 h時Csp2039蛋白的表達沒有明顯變化;當(dāng)溫度脅迫6 h時,蛋白Csp2039在低溫脅迫下的表達達到最大值,分別約為對照組的1.7倍(0 ℃)和1.9倍(10 ℃)。高溫(30 ℃)脅迫下,2 h時蛋白Csp2039的表達量也沒有明顯變化,6 h和12 h時的表達被抑制。

圖2 Csp2039基因?qū)囟让{迫的應(yīng)答特征

圖3 溫度脅迫下Csp2039蛋白的表達分析

2.3 對鹽度的應(yīng)答特征

qRT-PCR(圖4)表明,低鹽(0)條件下,基因Csp2039的表達在6 h時被顯著抑制;在鹽度為15的條件下,基因Csp2039的表達均被誘導(dǎo),并在12 h達到最大,約為對照組的2.8倍。高鹽(90,120)時基因Csp2039的表達在2 h時被顯著抑制。

Western blot結(jié)果(圖5a)經(jīng)灰度掃描后分析表明(圖5b),在低鹽(0)脅迫下,Csp2039蛋白的表達均被誘導(dǎo),在12 h時達到最大;在鹽度為15的脅迫下,Csp2039蛋白的表達量顯著升高,并于2 h達到最大,約為對照組的3.8倍;在高鹽(90)脅迫下,Csp2039蛋白的表達量在2 h被抑制,然后顯著上升,于12 h時達到最大值,約為對照組的3.1倍;高鹽(120)時Csp2039蛋白的表達在6 h和12 h抑制程度不明顯?;駽sp2039在翻譯水平與轉(zhuǎn)錄水平對鹽度脅迫的應(yīng)答特征并不完全一致。

圖4 Csp2039基因?qū)}度脅迫的應(yīng)答特征

圖5 鹽度脅迫下Csp2039蛋白的表達分析

2.4 對溫度/鹽度的應(yīng)答特征

qRT-PCR(圖6)表明,在溫度/鹽度協(xié)同脅迫條件下,溫度為0 ℃時,無論鹽度高低,冷激蛋白基因Csp2039在轉(zhuǎn)錄水平的表達均顯著上升,并且低鹽度(15)時其相對表達量要高于高鹽度(90)的,并于2 h時達到最大值,分別約為對照組的4.3倍和2.8倍;高溫(30 ℃)時,除在2 h低鹽(15)情況下基因Csp2039的表達稍被誘導(dǎo),其余條件下Csp2039基因的表達均顯著被抑制。

Western blot(圖7a)經(jīng)灰度掃描后分析表明(圖7b),低溫(0 ℃)脅迫下,當(dāng)鹽度為15時,Csp2039蛋白的表達于12 h時達到最大,約為對照組的1.7倍;當(dāng)鹽度為90時,Csp2039蛋白的表達被抑制。而在高溫(30 ℃)脅迫下,當(dāng)鹽度為15時于6 h Csp2039蛋白的表達量達到最大,約為對照組的2.7倍,之后下降,12 h表達量僅為對照組的0.7倍;當(dāng)鹽度為90時,Csp2039蛋白的表達量在2 h時升高,6 h時顯著下降,12 h時無明顯變化。在溫鹽協(xié)同脅迫作用下,基因Csp2039在翻譯水平與轉(zhuǎn)錄水平的應(yīng)答也不完全一致。

圖6 冷激蛋白Csp2039基因?qū)囟塞}度協(xié)同脅迫的應(yīng)答特征

圖7 溫鹽脅迫下Csp2039蛋白的表達分析

3 討 論

由于極地生態(tài)系統(tǒng)具有獨特性,因此為微生物在極端環(huán)境的適應(yīng)性機制研究提供了豐富的資源。南極細(xì)菌Psychrobactersp. G分離于南極喬治王島西南部海域中,該菌屬于適冷菌最明顯的特征是:菌株最適生長溫度為20 ℃,溫度高于30 ℃時菌株則停止生長[23]。本研究從南極適冷菌Psychrobactersp. G中克隆得到了Csp2039基因。研究表明,冷激蛋白Csp2039與冷激蛋白CspA家族蛋白的同源性很高,存在與單鏈核苷酸結(jié)合相關(guān)的保守區(qū)RNP1和RNP2區(qū)[18]。本文針對極地微生物冷激基因能夠在低溫下正常表達產(chǎn)生冷激蛋白這一適應(yīng)機制展開研究。

qRT-PCR和Western blot研究表明,溫度變化對Csp2039基因的表達有著較大的影響,其表達量在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上均被低溫(0 ℃,10 ℃)誘導(dǎo),這表明該基因為典型的冷激蛋白基因。對基因Csp2039先前的研究中發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)錄水平上低溫(0 ℃)時于2,6,12 h 基因Csp2039的表達均被顯著誘導(dǎo)[18],與本研究結(jié)果基本一致。低溫可誘導(dǎo)極地適冷菌冷激蛋白的表達以適應(yīng)外界溫度的變化[11,17]。已有研究發(fā)現(xiàn),溫度從37 ℃下降到8 ℃時,大腸桿菌中CspA基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達量顯著增加,在隨后的4 h內(nèi)表達量保持穩(wěn)定[16]。這些結(jié)果均表明CspA蛋白家族在微生物抵御低溫脅迫中起著重要的作用。

將從北極細(xì)菌PolaribacterirgensiiKOPRI 22228中克隆出的CspA基因經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn),該基因編碼的蛋白序列含有2個在CspA蛋白中高度保守的RNA結(jié)合位點RNP1和RNP2[24-25];且將CspA基因?qū)氲蜏孛舾械拇竽c桿菌Csp四重缺失型菌株BX04后,使該菌株獲得了低溫存活的能力,表明該CspA基因在菌株KOPRI 22228的低溫適應(yīng)性中起著重要的作用[24]。Schmid等[13]在對ListeriamonocytogenesEGD-e 的溫度脅迫中發(fā)現(xiàn),在37 ℃時,冷激蛋白基因CspA的表達量很低,在4 ℃時表達量明顯升高,是37 ℃時的23倍,這說明低溫誘導(dǎo)明顯增強了冷激蛋白的表達。Jung等[25]發(fā)現(xiàn),當(dāng)CspAPa基因沒有導(dǎo)入大腸桿菌中時,對含有質(zhì)粒pAED4的大腸桿菌進行1次凍融實驗,發(fā)現(xiàn)僅有不足2%的細(xì)胞存活;而將從北極細(xì)菌PsychromonasarticaKOPRI 22215中克隆到的CspAPa基因?qū)氪竽c桿菌后,使宿主的耐寒能力增強了10倍以上,經(jīng)1次凍融后發(fā)現(xiàn)有多于20%的細(xì)胞存活,表明CspAPa蛋白能有助于北極細(xì)菌適應(yīng)極地的低溫環(huán)境。以上研究結(jié)果均表明溫度脅迫時,冷激蛋白的表達量在被低溫誘導(dǎo)后增加,這與本文研究結(jié)果是基本一致的,即冷激蛋白的表達是被低溫誘導(dǎo)的,冷激蛋白有助于南極細(xì)菌適應(yīng)極地的低溫環(huán)境。

鹽度脅迫對基因Csp2039在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的表達的影響并不完全一致。在轉(zhuǎn)錄水平上,低鹽(0)脅迫下,基因Csp2039的表達先受誘導(dǎo)然后被抑制,在鹽度為15的脅迫下,基因Csp2039的表達均被誘導(dǎo),高鹽(90,120)時基因Csp2039的表達只在6 h被抑制;而在蛋白水平上,在低鹽(0,15)脅迫下,基因Csp2039的表達均被誘導(dǎo),高鹽(90)脅迫下,Csp2039蛋白的表達先被抑制,然后逐漸升高。這說明冷激蛋白可能在菌株G對滲透壓變化的適應(yīng)性中可能起著重要作用。Schmid等[13]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)向培養(yǎng)基BHI中加入3%的NaCl后,菌株ListeriamonocytogenesEGD-e的CspA基因的表達會顯著升高,即高鹽會促進CspA基因的表達,這與本文的研究結(jié)果基本相同。對基因Csp2039先前的研究中發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)錄水平上低鹽(0,15)脅迫下,基因Csp2039的表達除在12 h(0)鹽度外均被抑制,高鹽(90,120)時基因Csp2039的表達量在12 h升高[18],表明低鹽抑制了冷激蛋白的表達,與本研究在轉(zhuǎn)錄水平對鹽度脅迫的應(yīng)答特征并不完全一致。這些結(jié)果表明冷激蛋白在細(xì)胞對鹽度脅迫性中的作用目前仍沒有定論,可能原因是冷激蛋白的分子伴侶可以提高鈉離子轉(zhuǎn)運蛋白的含量,加快了鈉離子的運輸,它們可以促進轉(zhuǎn)錄和翻譯的進行,來參與細(xì)胞對滲透壓的適應(yīng)[13]。

盡管CspA基因作為典型的冷激蛋白基因,受低溫誘導(dǎo),但本研究研究表明,該基因的表達在30 ℃、6 h時也被顯著誘導(dǎo),這與Ivancic等的研究結(jié)果相類似,其研究也表明,大腸桿菌CspA基因在8~37 ℃溫度波動范圍內(nèi)也可以被誘導(dǎo)[16]。通過對基因Csp2039在鹽度條件下的表達特征的研究表明,在轉(zhuǎn)錄水平上,低鹽(0,15)對其表達量有顯著的影響,在鹽度為15的脅迫下,基因Csp2039的表達均被誘導(dǎo),高鹽(90,120)時基因Csp2039的表達只在6 h被抑制;然而在翻譯水平上,在低鹽(0,15)脅迫下,基因Csp2039的表達均被誘導(dǎo),高鹽 (90) 脅迫下,Csp2039蛋白的表達先被抑制,然后逐漸升高,這其中的機理仍需進一步探究。在轉(zhuǎn)錄水平上,溫度和鹽度分別脅迫時,溫度對Csp2039基因的誘導(dǎo)表達明顯高于鹽度對基因的誘導(dǎo)增加倍數(shù)表達,在溫鹽協(xié)同脅迫時,低溫占據(jù)了主導(dǎo)作用;而在翻譯水平上,鹽度對Csp2039蛋白表達的影響作用明顯高于溫度,其中的機理也需進一步的研究。

多種環(huán)境壓力在自然條件下同時脅迫南極細(xì)菌的生長,常見的有海水的鹽度變化伴隨著溫度變化[26],因此本文對Csp2039基因在溫度/鹽度協(xié)同脅迫下的表達情況也進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)錄水平上,溫度為0 ℃時,無論鹽度高低,基因Csp2039在轉(zhuǎn)錄水平的表達均顯著上升;而高溫(30 ℃)時,除在2 h低鹽被誘導(dǎo)以外,其余條件下均顯著被抑制,Csp2039基因在溫度/鹽度協(xié)同脅迫時的表達情況與溫度協(xié)迫時的表達情況相似,表明在轉(zhuǎn)錄水平上Csp2039基因表達的變化更容易受溫度影響。而在翻譯水平上,低溫(0℃)時,低鹽(15)時,Csp2039蛋白的表達均被誘導(dǎo),高鹽(90)時,Csp2039蛋白的表達量明顯被抑制;而高溫(30 ℃)時,該基因在鹽度15時6 h的表達量最大,鹽度90時于6 h蛋白表達顯著抑制,表明在翻譯水平上鹽度對Csp2039蛋白表達的影響作用大于溫度,這其中的機理仍需更深入的研究。對基因Csp2039先前的研究中發(fā)現(xiàn)[18],在轉(zhuǎn)錄水平上基因Csp2039的表達均被抑制,這可能與不同的實驗條件有關(guān),在以后的實驗中對溫鹽協(xié)同作用進行研究時可采用正交試驗進行互交性分析,實驗結(jié)果將更具說服力。

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Received: April 8, 2015

Expression Characteristics of Cold Shock Protein Gene Csp2039 of the Antarctic Psychrotrophic Bacterium Psychrobacter sp. G

LI Yang1,2, CHE Shuai1,2,WANG Zhen1,2, LIN Xue-zheng1,2

(1.TheFirstInstituteofOceanography,SOA, Qingdao 266061, China;2.KeyLabofMarineBioactiveSubstances,SOA, Qingdao 266061, China)

To clarify the adaption mechanism of microorganisms in the severe environment of Antarctica, a cold shock protein geneCsp2039 was cloned from the Antarctic psychrotrophic bacterium Psychrobacter sp. G. qRT-PCR and Western blot were used to investigate the expression characteristics ofCsp2039 under different temperature/salinity stresses at the level of both transcriptional and translational. At the transcriptional level, qRT-PCR showed that the expression ofCsp2039 gene was significantly affected by the temperature shift and remarkably enhanced at 6 h by low temperature (0 ℃, 10 ℃), and high temperature (30 ℃). Under low salinity (0) stress, the expression ofCsp2039 gene was first induced, and then was suppressed; at the salinity of 15, the gene expressions were all increased at different times (2, 6 and 12 h); At high salinity (90, 120), the expression was enhanced at 6 h. Under the combined temperature and salinity stress, the expression ofCsp2039 gene was significantly increased at low temperature (0 ℃) regardless of salinity; on the contrary, the expression ofCsp2039 gene was inhibited by high temperature (30 ℃) except at 2 h. In the translational pattern, Western blot indicated that the expression of Csp2039 protein was remarkably enhanced by low temperature (0℃, 10 ℃), and obviously inhibited by high temperature (30 ℃). Under the low salinity (0, 15) stress, the expression of Csp2039 protein was enhanced; at the high salinity (90, 120), the expression ofCsp2039 gene was gradually increased after being suppressed. Under the combined temperature and salinity stresses, at low temperature (0 ℃), the expression of Csp2039 protein was improved under the salinity of 15 while decreased under the salinity of 90; however, at the high temperature (30 ℃), it had a high expression at 6 h under the salinity of 15 while a low expression at 6 h under the salinity of 90. In summary, the expression ofCsp2039 gene was more likely to be affected by temperature at the transcriptional level; and while in the translational pattern, the influence of salinity onCsp2039 gene was greater than that of temperature; the response time at the translational level ofCsp2039 gene was later than that in the transcriptional level.

Psychrobacter; cold shock protein geneCsp2039; qRT-PCR; Western blot; expression analysis

2015-04-08

國家自然科學(xué)基金項目——南極適冷菌Psychrobactersp. G溫度與鹽度脅迫下基因表達譜分析及冷/熱激基因應(yīng)答機制研究(41176174);南北極環(huán)境綜合考察與評估專項——北極海域海洋生物和生態(tài)考察(CHINARE2015-03-05)

李 陽(1990-),女,山東濰坊人,碩士研究生,主要從事極地微生物學(xué)方面研究. E-mail: liyang@fio.org.cn*

林學(xué)政(1971-),男,山東棲霞人,研究員,博士,主要從事海洋極端環(huán)境微生物學(xué)方面研究. E-mail: linxz@fio.org.cn

(王佳實 編輯)

Q751

A

1671-6647(2016)01-0085-10

10.3969/j.issn.1671-6647.2016.01.008

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