衛(wèi) 昊 許 棟 姚東風 胡 宇 劉繼平

陜西中醫(yī)藥大學(咸陽 712046)

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苦杏仁苷對變應性哮喘小鼠氣道炎癥的影響

衛(wèi) 昊 許 棟 姚東風 胡 宇 劉繼平

陜西中醫(yī)藥大學(咸陽 712046)

目的: 探討苦杏仁苷對變應性哮喘小鼠氣道炎癥的影響。方法：雌性BALB/c小鼠50只，隨機分為5組：分別為空白對照組、模型制造組、給藥高劑量組(20mg/kg)、給藥低劑量組(10mg/kg)和地塞米松磷酸鈉陽性對照組(2mg/kg)。除了對照組以外，于第1、8天將每組的動物，以每只腹腔和皮下都給藥0.1ml的致敏液，第15～28天各組(除了對照組)注射2.5%的OVA霧化激發(fā)，并且根據(jù)小鼠的體重注射相對應劑量的藥物。在經(jīng)過一周的治療時間以后，取肺泡灌洗液(BALF)做一個細胞分類計數(shù)實驗和酶聯(lián)免疫法(ELISA)測BALF中炎癥因子(IL-4，INF-γ)，采取氣道進行病例分析。結(jié)果：苦杏仁苷10mg/kg組及20mg/kg組肺泡灌洗液(BALF)中白細胞總數(shù)、淋巴細胞數(shù)、中性粒細胞數(shù)均比模型組顯著降低,嗜酸性粒細胞降低尤其顯著，病理學檢測結(jié)果顯示，苦杏仁各劑量組氣管黏膜下層嗜酸性細胞，淋巴細胞、巨噬細胞等炎細胞浸潤都有減輕趨勢，且能夠顯著減少肺泡灌洗液中IL-4的含量，提高INF-γ的含量。結(jié)論：10mg/kg和20mg/kg的苦杏仁苷均可對患病小鼠變應性氣道炎癥產(chǎn)生明顯的抑制作用。

哮喘是一種氣道慢性炎癥性疾病，主要受環(huán)境因素和免疫因素等引起，目前被定性為多基因遺傳性疾病，該病是由多種細胞(如嗜酸粒細胞、肥大細胞、中性粒細胞等)及細胞組分參與，其中最常見的變應性哮喘通常是由吸入和食入變應原而誘發(fā)的，其發(fā)病的關鍵因素是患者的特應性素質(zhì)和由其所導致的氣道對變應原的敏感性和反應性增高，而且會使氣道縮窄及氣道炎癥[1]。而免疫失衡是目前哮喘機制研究的熱點，其中Th1/Th2失衡是重要的機制。Th1細胞主要釋放INF-γ，能抵抗過敏反應；Th2細胞主要釋放IL-4，能促進過敏反應。苦杏仁為薔薇科植物杏(Prunus armeniaca L.var.ansu Maxim.)、西伯利亞杏(Prunus sibirica L.)、東北杏[Prunus mandshurica (Maxim.) Koehne]或杏 Prunus armeniaca L.的干燥成熟種子[2]?？嘈尤噬芬约案鞣N炮制品有效成分苦杏仁苷在體內(nèi)分解的氫氰酸能抑制呼吸中樞而起到鎮(zhèn)咳，平喘作用，使呼吸加深，咳嗽減輕，痰易咳出。本文主要通過小鼠模型探討苦杏仁苷對具有病變的小鼠變應性氣道炎癥的影響。

1 材 料

1.1 試 藥 苦杏仁苷(購自中國食品藥品檢定研究院，批號：A1194)地塞米松磷酸鈉(天津藥液股份有限責任公司，批號:102604)。雞蛋清白蛋白(上海生物科技有限責任公司，批號:110909)；氫氧化鋁凝膠(揚州市星斗藥業(yè)有限責任公司，批號:100805)；嗜酸性粒細胞計數(shù)液(北京建成生物工程研究院，批號:20131214)；IL-4及INF-γ ELISA試劑盒(北京凱基生物有限責任公司,批號：20121024)。

1.2 動 物 SPF級BALB/c雌性小鼠50只，6～8周齡，體重18～22g。西安交通大學醫(yī)學院動物實驗中心提供，許可證號:0011740。飼養(yǎng)環(huán)境: 陜西中醫(yī)藥大學動物房溫度維持在 18℃～25℃，相對濕度40%～70%，實驗前適應性飼養(yǎng)3d。

1.3 儀 器 S-888F型超聲波霧化器(中外合資南京道芬電子有限責任公司)；FAH04N電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；LDZS-2自動平衡離心機(北京醫(yī)用離心機廠)。

2 方 法

2.1 患病小鼠模型的建立及給藥方式 將50只正常小鼠隨機分為5組：分別為模型組、試藥高劑量組(10mg/kg) 組、試藥低劑量組(20mg/kg)組、空白對照組、陽性對照組，每組10只小鼠。除對照組外，每組動物于第1、8天，每只皮下給藥0.1ml致敏液，并腹腔注射0.1 ml致敏液(0.2 ml致敏液含OVA 0.1 mg，氫氧化鋁0.02 mg)，第15～28天 2.5%OVA溶液霧化激發(fā)，霧化20 min。把相同劑量放入生理鹽水代替致敏液給藥于對照組，并采用生理鹽水霧化。13～29d霧化，灌胃給藥時間于每次霧化前30 min。

2.2 肺泡灌洗液(BALF)細胞學研究 在手術臺上放置已處理的動物，將胸腔打開，用細繩把左支氣管肺門部結(jié)扎；將氣管小心分離開來，在不破壞周圍組織的情況下,在氣管環(huán)狀軟骨下方剪一V型切口，將針頭前端磨平的2.5ml注射器插入，并且固定，1.5 ml生理鹽水以每次0.5ml分3次灌洗。取一滴液體滴入血細胞計數(shù)池當中，待其靜置以后在顯微鏡下讀取白細胞的總數(shù)。1 000 r/min室溫下離心15 min，將上清液傾出，取沉淀涂片固定，染液染色，在鏡下讀取300個白細胞，計算各種白細胞數(shù)目，計算各類白細胞所占白細胞百分比。綜合白細胞的總數(shù)和各類白細胞的百分比最終換算得到BALF中各類白細胞數(shù)。

2.3 氣道病理學檢查 取小鼠氣道組織，一般制備病理切片，進行病理檢測采用HE染色，鞏固液選用4%中性甲醛溶液，

2.4 ELISA法 測定肺部洗液(BALF)中 IL-4及INF-γ含量 取小鼠測定肺部洗液適量，按照ELISA試劑盒說明書進行操作測定IL-4及INF-γ含量。

3 結(jié) 果

3.1 苦杏仁苷對患病小鼠支氣管炎癥細胞計數(shù)的影響 與對照組相比較，模型組各種致病細胞數(shù)有顯著性差異(P<0.01)，中性粒細胞有統(tǒng)計學的差異(P<0.05)；而與模型組比較，與陽性對照組相比、苦杏仁苷組給藥后白細胞總數(shù)顯著減少(P<0.01)；陽性對照組中的淋巴細胞有顯著性差異(P<0.01)，苦杏仁苷組有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；陽性對照組中的中性粒細胞，較模型組顯著減少(P<0.01)，其他各給藥組給藥后較模型組相比較無明顯差異；單核細胞數(shù)，陽性對照組較模型組顯著減少(P<0.01)；嗜酸性粒細胞，陽性對照組，苦杏仁苷給藥后顯著降低(P<0.01)，苦杏仁苷組有所降低(P<0.05)，結(jié)果見表1。

表1 苦杏仁苷對支氣管肺泡灌洗液中白細胞總數(shù)以及各炎癥細胞的影響

3.2 氣道病理學檢測 可見對照組黏膜上皮完好，未見顯著的脫落、壞死，固有層及黏膜下層中沒有看見充血、水腫及炎細胞浸潤細胞，外膜可見完整的透明軟骨支架。模型組可見氣管黏膜下層中度炎細胞浸潤，主要包括嗜酸性細胞，淋巴細胞、巨噬細胞及少量漿細胞。與模型組相比較，各個給藥組的病變都有減輕趨勢，尤其地塞米松磷酸鈉陽性對照組、苦杏仁苷組減輕趨勢均略優(yōu)于對照組以及模型組,結(jié)果見圖1。

3.3 苦杏仁苷對哮喘小鼠BALF 中B細胞生長因子及INF-γ含量的影響 與對照組相比較，模型組BALF 中B細胞生長因子含量顯著上升(P<0.05)，INF-γ含量顯著下降(P<0.05)；苦杏仁苷組及地塞米松磷酸鈉組BALF 中B細胞生長因子含量顯著下降(P<0.05)，INF-γ含量顯著上升(P<0.05)，說明苦杏仁苷能調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫失衡。結(jié)果見表2。

表2 BALF 中IL-4及INF-γ含量(n=10)

A：空白對照組；B：模型組；C：地塞米松組；D：苦杏仁苷(10mg/kg)；E：苦杏仁苷(20mg/kg)

4 討 論

哮喘是由多種炎性細胞、細胞因子和炎性介質(zhì)共同參與的慢性非特異性炎癥疾病，慢性炎癥導致氣道的高反應性，是哮喘患者臨床遷延難愈，反復發(fā)作的重要原因[3]。其關鍵的效應細胞是嗜酸性粒細胞和Th細胞[4]。炎癥細胞(尤其是嗜酸性粒細胞)在氣道的局部聚集、炎癥介質(zhì)和細胞因子的釋放等是形成和維持氣道炎癥并進而引起組織損傷和氣道功能障礙的主要原因。哮喘發(fā)病的重要原因是由于體內(nèi)的Th1/Th2比例失衡[5]。IL-4 是重要的Th2 型細胞因子，在黏液分泌，細胞及浸潤等過程起著重要的作用；INF-γ為Th1型細胞的特征性細胞因子，主要作用是抑制IgE 的合成和Th2型細胞因子的分化[6-7]。Th2型細胞效應增強，同時Th1型細胞效應減弱，尤其是IL-4/IFN-γ的比例與哮喘的進展密切相關，因而人們常以此比例來間接反映Th1/Th2的比例。因此，改變Th1和Th2細胞的免疫失衡狀態(tài)，使免疫反應由Th2 型向Th1 型逆轉(zhuǎn)，在治療支氣管哮喘患者中起著重要意義。 臨床上采用治療哮喘的藥物主要是β2受體激動劑、抗膽堿藥、茶堿類等。這些藥物都是針對單一靶點進行治療，所以亟待尋找更有效的藥物。哮喘屬中醫(yī)學的“哮病”范疇，中醫(yī)藥是尋找有效藥物的寶庫，而且中醫(yī)藥具有多靶點、多作用的特點。很多中藥已經(jīng)報道具有抗哮喘的作用，杏仁是有效的止咳藥物，苦杏仁苷是其中主要成分，本實驗對苦杏仁的抗哮喘作用及其機制進行了研究。

本研究發(fā)現(xiàn)高劑量苦杏仁苷可依賴性地升高INF-γ水平，減少患病小鼠BALF 中IL-4水平，降低IL-4/INF-γ的比值，由這個數(shù)據(jù)可得到苦杏仁苷可調(diào)節(jié)Th1/Th2比例的平衡，從而達到抑制炎性介質(zhì)的發(fā)出和聚集、減輕哮喘氣道炎癥的目的。近幾年來，中草藥用于治療各種疾病已是越來越常見且有很大的療效，苦杏仁常常被稱作維生素B17，已成為中醫(yī)上常用的祛痰止咳劑，常用來輔助治療癌癥。但是誤服過量的苦杏仁可導致機體中毒，利用純天然藥物治療各種疑難雜癥已成為新型治療疾病的一種趨勢。

[1] 李勇軍．珠貝定喘丸聯(lián)合布地奈德治療哮喘發(fā)作期52例[J]．陜西中醫(yī)，2014，34(3)：310-311．

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部) [M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015，201．

[3] 王超紅，張鳳宇，郭文新，等．玉屏風滴丸聯(lián)合福莫特羅布地奈德治療哮喘持續(xù)期臨床觀察[J]．陜西中醫(yī)，2015，36(9)：1126-1127．

[4] 徐 姍，蘇夢琪，呂偉紅，等．異丁斯特對支氣管哮喘豚鼠Th2型細胞因子白介素4、白介素13及嗜酸粒細胞趨化因子的影響[J]．中華哮喘雜志(電子版)，2009，3(5)：346-350．

[5] 張慧平，李元霞，龐隨軍，等．嬰幼兒哮喘53例外周血Leptin、Eotaxin、總IgE檢測及其臨床意義[J]．陜西醫(yī)學雜志，2013，42(1)：99-101．

[6] David H B，F(xiàn)red F，Bruce S B，et al．Advances in mechanisms of asthma，allergy and immunology in 2010[J]．J Allergy Clin Immunol，2011，127(3)：689-695．

[7] 呂志宇，李曉紅，榮本兵，等.實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎豚鼠外周血單個核分泌IL-4[J]．陜西醫(yī)學雜志，2010,39(3)：295-297.

(收稿2016-08-10；修回2016-08-29)

哮喘 動物，實驗 大鼠 @苦杏仁苷

R256.12

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10.3969/j.issn.1000-7369.2016.12.055