沈繼朵　胡春月　魏玉　王蕾

【摘 要】 目的：觀察黃芩苷對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)抑郁小鼠海馬中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素（Neurotrophins， NT）-3的mRNA表達(dá)水平的影響。方法：連續(xù)21d皮下注射皮質(zhì)酮（40mg/kg）建立抑郁小鼠模型，采用糖水實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠抑郁樣行為，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)小鼠海馬內(nèi)NT-3的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：皮質(zhì)酮組小鼠糖水?dāng)z取比例顯著下降，強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，海馬內(nèi)NT-3的表達(dá)顯著增高；黃芩苷逆轉(zhuǎn)了皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的抑郁樣行為，并降低海馬NT-3的表達(dá)水平。結(jié)論：降低海馬內(nèi)NT-3的表達(dá)，可能是黃芩苷的抗抑郁機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞】 抑郁癥；黃芩苷；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3

【中圖分類號(hào)】R2855 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2016）20-0013-03

抑郁癥是一種常見(jiàn)的精神性疾病。傳統(tǒng)的抑郁癥以及抗抑郁藥物研究多集中于單胺類神經(jīng)遞質(zhì)領(lǐng)域。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究支持了抑郁癥的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子假說(shuō)。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是一類主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分子，為神經(jīng)元的生長(zhǎng)、存活和功能完整性提供必須的支持作用。已有大量研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者血清神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素（Neurotrophins， NT）-3水平顯著高于正常人[1]，提示NT-3可能參與了抑郁癥的發(fā)病過(guò)程，但兩者關(guān)系研究還較少。

在前期研究中，筆者采用連續(xù)注射皮質(zhì)酮的方法建立了小鼠抑郁模型，并給予黃芩苷治療，發(fā)現(xiàn)黃芩苷可顯著逆轉(zhuǎn)皮質(zhì)酮小鼠的抑郁樣行為，并上調(diào)海馬中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Brain derived neurotrophic factor，BDNF）的表達(dá)水平[2]，提示黃芩苷的抗抑郁作用可能與增強(qiáng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)與再生有關(guān)，但黃芩苷對(duì)NT-3的表達(dá)是否有影響尚不清楚。因此，本文主要研究了黃芩苷對(duì)小鼠海馬內(nèi)NT-3表達(dá)水平的影響，期望以此解釋黃芩苷的神經(jīng)保護(hù)以及抗抑郁機(jī)制。

1 材料與方法

11 藥品 黃芩苷（981%）購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)為ZL111024；皮質(zhì)酮購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，生產(chǎn)批號(hào)為B130537；鹽酸氟西汀購(gòu)自常州四藥制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)為20100623No144。

12 動(dòng)物 雄性ICR小鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，18～22g。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前動(dòng)物預(yù)先適應(yīng)環(huán)境一周，可自由進(jìn)食和飲水。環(huán)境溫度為（22±1）℃，每天12h光照（8：00-20：00）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循河南中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定進(jìn)行。

13 動(dòng)物模型 適應(yīng)1周后，所有小鼠隨機(jī)分為5組（每組10只）：正常組、皮質(zhì)酮模型組、黃芩苷組（劑量分別為10、20mg/kg）、陽(yáng)性對(duì)照氟西汀組（劑量為20mg/kg）。除正常組外，其他組每天皮下注射皮質(zhì)酮（40mg/kg），連續(xù)21d。黃芩苷和氟西汀混懸于生理鹽水中，于注射皮質(zhì)酮前30min灌胃給藥，劑量為10ml/kg。

14 糖水實(shí)驗(yàn) 末次給藥24h后，進(jìn)行糖水實(shí)驗(yàn)。所有小鼠均提前斷水?dāng)嗉Z24 h，每只小鼠置于單獨(dú)的籠子中，分別給予1瓶1%的蔗糖水和一瓶自來(lái)水，兩個(gè)瓶子隨機(jī)放置，24h后收取瓶子，量取小鼠的蔗糖水和自來(lái)水的攝入量，通過(guò)以下公式來(lái)計(jì)算糖水偏愛(ài)百分比：糖水偏愛(ài)百分比=糖水?dāng)z入量/（糖水?dāng)z入量+水?dāng)z入量）×100%。

15 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 糖水實(shí)驗(yàn)24h后進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)。將小鼠放在一個(gè)垂直玻璃缸內(nèi)（直徑15cm，高30cm），玻璃缸內(nèi)水深10cm，溫度為24±1℃。每只小鼠游泳6min，用攝像機(jī)進(jìn)行錄像，記錄每只小鼠的最后4min內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間。

16 組織獲取 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)24h后，摘眼球采血并脫頸椎處死小鼠，快速分離海馬組織，立即放入液氮中冷凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存待測(cè)。

17 qPCR 冰凍的海馬組織中加入10倍體積Trizol試劑勻漿后，加入氯仿劇烈震蕩15s，靜置5min 后于12000g離心15min，取上層相加入等量異丙醇混勻，靜置10min 后于12000g 離心10min，棄上清。白色沉淀中加入1mL 75%乙醇洗滌，7500g 離心5min后棄上清，沉淀風(fēng)干5min，加入40 μL DEPC水溶解，紫外分析儀測(cè)定OD260和OD280后等量稀釋模板RNA。采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。采用qPCR試劑盒（染料法），加入相應(yīng)引物后進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，采用2-ΔΔCT法分析結(jié)果。引物序列：NT-3：上游引物5-GCGAGACTGAATGA CCGAACT-3；下游引物：5- GCCACGGAGATAAGCAAGAAA-3。內(nèi)參β-actin：上游引物：5-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3；下游引物：5- TTTAATGTCACGCACGATTTC-3。

18 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS200進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差（x[TX-*3]±s）表示，單因素方差分析比較組間差異，P<005表差異示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

21 黃芩苷對(duì)小鼠抑郁樣行為的影響 如圖1和圖2所示，與正常組相比，模型組小鼠糖水偏愛(ài)百分比顯著下降（P<001），強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。黃芩苷可顯著提高糖水偏愛(ài)百分比（P<005， P<005），并縮短強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中小鼠的不動(dòng)時(shí)間，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005，P<001）。

22 黃芩苷對(duì)海馬中NT-3水平的影響 如圖3所示，與正常組相比，模型組小鼠海馬中NT-3的mRNA表達(dá)水平顯著增高（P<001）。黃芩苷可顯著降低NT-3 的表達(dá)與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005，P<001）。氟西汀對(duì)NT-3的表達(dá)水平無(wú)明顯影響。

3 討論

自抑郁癥的“神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子假說(shuō)”提出以來(lái)，有關(guān)抑郁癥的研究逐漸進(jìn)入了神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子領(lǐng)域。該假說(shuō)認(rèn)為，抑郁癥患者腦內(nèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子功能的不足導(dǎo)致神經(jīng)元突觸可塑性受損，進(jìn)而導(dǎo)致大腦功能紊亂和抑郁癥的發(fā)生[3]。目前發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子主要有神經(jīng)生長(zhǎng)因子（Nerve growth factor，NGF）、BDNF、NT-3和NT-4等。其中BDNF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子中含量最多的，也是研究最充分的。多種抗抑郁藥物可以通過(guò)增加腦內(nèi)BDNF含量，促進(jìn)神經(jīng)元的存活，并提高突觸可塑性而發(fā)揮抗抑郁作用[4-5]。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)了黃芩苷可上調(diào)海馬BDNF的表達(dá)發(fā)揮抗抑郁作用。其他眾多的研究，也發(fā)現(xiàn)了黃芩苷具有良好的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)，這提示黃芩苷的抗抑郁作用可能涉及調(diào)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子以及對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。

除了BDNF，NT-3也是一種重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布[6]。與BDNF不同的是，BDNF在抑郁癥動(dòng)物腦內(nèi)的含量顯著減少，表明神經(jīng)元缺乏足夠的營(yíng)養(yǎng)支持而受到損傷，但NT-3在抑郁癥動(dòng)物腦內(nèi)卻大量增加，尤其在海馬內(nèi)，表明這是動(dòng)物機(jī)體應(yīng)對(duì)神經(jīng)損傷的一種有效補(bǔ)償措施，NT-3的增加有利于神經(jīng)元的存活和功能修復(fù)[7-8]。NT-3通過(guò)Trk受體活化誘導(dǎo)突觸結(jié)構(gòu)和功能的改變，對(duì)損傷的突觸進(jìn)行修復(fù)，促進(jìn)神經(jīng)元分化并誘導(dǎo)軸突生長(zhǎng)[9]。在臨床抑郁癥患者中，也發(fā)現(xiàn)了血清NT-3含量顯著高于正常人[10]。本研究中發(fā)現(xiàn)在皮質(zhì)酮處理組的小鼠海馬內(nèi)NT-3的mRNA表達(dá)水平顯著增高，表明長(zhǎng)期的皮質(zhì)酮注射導(dǎo)致海馬神經(jīng)元受到損傷，NT-3代償性的大量表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)。黃芩苷組小鼠海馬的NT-3表達(dá)顯著下降，提示黃芩苷通過(guò)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，對(duì)損傷的神經(jīng)突觸作出一定的功能修復(fù)，從而恢復(fù)了NT-3的正常表達(dá)，這可能是黃芩苷抗抑郁機(jī)制之一。

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（編輯：陶希睿）