□ 廖夏云　黃小云　馮麗敏　聶紅梅　池明亮　譚　強　廣西中醫(yī)藥大學(xué)

甘氨酸的抑菌作用分析

□ 廖夏云黃小云馮麗敏聶紅梅池明亮譚強廣西中醫(yī)藥大學(xué)

甘氨酸可作為營養(yǎng)補充劑和調(diào)味劑應(yīng)用于食品中，還具有一定的抑菌效果。本文通過研究甘氨酸在不同的條件下對大腸桿菌(Escherichia coli，以下簡稱E.coli)和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，以下簡稱Sa）的抑菌活性，確定甘氨酸對這兩種食品中常見的致病菌的最佳的抑制條件。用微量肉湯稀釋法，測定在不同的濃度、不同pH值、不同時間的條件下，甘氨酸對E.coli和Sa的抑菌率，確定最佳的抑菌條件。通過單因素實驗研究表明甘氨酸對E.coli的最佳抑菌條件：濃度為2.0%（g/mL)，pH為7，時間為20 h，抑菌率為100%。甘氨酸對Sa的最佳抑菌條件：濃度為2.5%（g/mL)，pH為5，時間為16 h，抑菌率為100%。甘氨酸對Sa和E.coli均具有良好的抑制作用，對E.coli的抑制效果更好。

甘氨酸，抑菌，微量肉湯稀釋法

甘氨酸（Glycine），又名氨基乙酸（C2H5N O2），在氨基酸中結(jié)構(gòu)最簡單，為人體非必需氨基酸。甘氨酸為白色單斜晶系的晶體或白色性結(jié)晶粉末，無臭、無毒、易溶于水[1]，甜度為蔗糖的0.8倍。大鼠口服半數(shù)致死量LD50是7.93 g/kg[2]。

目前，谷氨酸鈉（味精）和甘氨酸是全世界用量最大的調(diào)味品。甘氨酸因具有抗氧化作用而被添加到奶油、干酪、人造奶油中，能延長保質(zhì)期3～4倍，在火腿、臘腸、魚肉、花生醬等食品中添加1%～2%的甘氨酸能達到防臭和防腐的效果[3]，甘氨酸還用于配制運動員的營養(yǎng)飲料及其氨基酸食品，食用添加甘氨酸的食品對人體胃液酸度的調(diào)節(jié)、肌肉活力的提高有一定作用[4-7]。

我國允許使用的防腐劑有30多種，但安全無毒、經(jīng)濟實用、抑菌廣泛并適用于各種食品的理想防腐劑仍然很少。甘氨酸來源豐富，對動物的毒性很低，同時幾乎不對人體產(chǎn)生毒性，因此可作為一種非特異性防腐劑。石春芝 等[8]對甘氨酸的抑菌作用研究表明，3%的甘氨酸對堅強芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌抑菌的作用非常明顯，甘氨酸與低級脂肪酸合并使用時對引起豆腐腐敗的微生物有顯著的抑菌作用。在席曉嵐 等人的研究報道中，用4-硝基苯甲醛與甘氨酸反應(yīng)合成Schiff堿，抑菌試驗結(jié)果表明，該化合物對紅色毛癬菌、孢子絲菌、白色念珠菌均有不同程度的抑菌活性作用[9]。

如何既防止食品的腐敗變質(zhì)，又滿足消費者對防腐劑安全無毒、經(jīng)濟有效的要求是目前研究的熱點，甘氨酸既具有防腐作用，又有營養(yǎng)和改善食品風(fēng)味等作用，這樣的天然防腐劑的研究和開發(fā)利用是食品科學(xué)工業(yè)的一個新方向。本文采用微量肉湯稀釋法，探究在不同濃度、pH值、時間的條件下甘氨酸對大腸桿菌（E.coli）和金黃色葡萄球菌（Sa）的最佳抑制條件，擴展對甘氨酸抑菌作用的環(huán)境和條件的研究，進一步了解甘氨酸的抑菌作用效果。

1　實驗材料及方法

1.1材料與儀器

金黃色葡萄球菌CICC 10384，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供；大腸桿菌CICC 10419，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；M ueller-Hinton Broth，北京陸橋技術(shù)有限公司；瓊脂，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甘氨酸，分析級，含量不少于99.0%，天津市光復(fù)精細化工研究所。

752N紫外分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；JJ200電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；LRH-250-S恒溫培養(yǎng)箱，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；DHG-9503A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海柏欣儀器設(shè)備廠；VS-840K-U潔凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；YXQ-LS-50SII立式蒸汽壓力滅菌柜，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；JB-3恒溫定時攪拌器，上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司；XW-80A旋渦混合器，江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；DK-98-11電子調(diào)溫萬用爐，天津市泰斯特儀器有限公司；TP8D300H移液槍，TO PSCIEN；Biotek Epoch全波長酶標(biāo)儀。

1.2實驗方法

1.2.1溶液制備

配制濃度為0.2 g/m L的甘氨酸溶液，分別用醋酸緩沖液調(diào)節(jié)pH至4、5，用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH至6、7、8、9，放入冰箱保存，備用。

1.2.2培養(yǎng)基的制備

M HB固體培養(yǎng)基：稱取M HB培養(yǎng)基12.5 g，加入瓊脂7.5 g，蒸餾水500 m L，溶解，分裝，煮至清澈透明，121 ℃高壓滅菌15 m in，備用。

M HB液體培養(yǎng)基：稱取M HB培養(yǎng)基12.5 g，加入蒸餾水500 m L，溶解，分裝，煮至清澈透明，121 ℃高壓滅菌15 m in，備用。

1.3甘氨酸在不同濃度、pH值、時間下的抑菌作用

1.3.1濃度對抑菌效果的影響

取潔凈無菌的96孔板，8列（1～8）×12行（A～L），pH=7的甘氨酸儲備液和液體培養(yǎng)基、菌液。

96孔板1～8列加入順序見表1，A～D行加入E.coli菌液，E～H行加入Sa菌液，加入完畢后，將96孔板放入恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度為37 ℃，14 h后取出，用酶標(biāo)儀測定O D620值，計算抑菌率。

1.5.2pH值對抑菌效果的影響

以1.5.1中對抑菌效果顯著的最低濃度為最佳抑菌濃度，參照表1在96孔板中加入pH值分別為5、6、7、8、9的該濃度甘氨酸儲備液，加入相應(yīng)的無菌水、液體培養(yǎng)基和菌液，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 h后，取出，用酶標(biāo)儀測定O D620值，計算抑菌率。

1.5.3抑菌時間對抑菌效果的影響

將1.5.2中抑菌效果最佳的處理再放回37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 h測定O D620值，即記錄14、16、18、20 h和22 h時，在最佳抑菌濃度、最佳抑菌pH值條件下，甘氨酸的抑菌率隨時間的變化情況。

1.5.4抑菌率計算方法

抑菌率按照公式（1）計算：

當(dāng)實驗O D值大于陽性對照O D值時，抑菌率記為0.0%；當(dāng)實驗O D值小于陰性對照O D值時，抑菌率記為100.0%。

2　實驗結(jié)果與討論

2.1不同濃度甘氨酸的抑菌效果

濃度為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的甘氨酸對E.coli的抑菌率分別為0.0%、37.4%、76.1%、100.0%和100.0%，如圖1所示。由圖1可知，隨著甘氨酸濃度的增加，對E.coli的抑制作用增強，甘氨酸濃度到達2.0%后，甘氨酸對E.coli的抑菌率達100%。甘氨酸濃度為0.5%時，對E.coli沒有抑菌作用，甘氨酸屬于氨基酸，是E.coli良好的營養(yǎng)物質(zhì)，此時E.coli將甘氨酸作為營養(yǎng)物質(zhì)吸收；濃度為1.0%時，甘氨酸開始抑制E.coli，當(dāng)濃度到2.0%時，抑菌率為100.0%，抑菌效果最佳，濃度升高到2.5%，抑菌率同樣為100%，說明濃度達到2.0%后甘氨酸對E.coli都有很好的抑制作用。

表1　甘氨酸的抑菌濃度

圖1　pH為7的甘氨酸對E.coli的抑制作用

測定濃度為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%的甘氨酸對Sa的抑制作用，得到抑菌率分別為0.0%、0.0%、2.6%、55.9%、100.0%、100.0%，如圖2所示。由圖2可知，隨著甘氨酸濃度的增加，對Sa的抑制作用增強，當(dāng)甘氨酸濃度達到2.5%時，甘氨酸對Sa的抑菌率達到100%。甘氨酸濃度為0.5%、1.0%時，對Sa沒有抑菌作用，此時Sa以甘氨酸為營養(yǎng)物質(zhì)；濃度為1.5%時，甘氨酸開始對Sa產(chǎn)生抑制作用，當(dāng)濃度到2.5%時，抑菌率為100.0%，抑菌效果最佳，濃度升高到3.0%，抑菌率同樣為100.0%，說明當(dāng)濃度到達2.5%時，甘氨酸對Sa有很好的抑制作用。

圖2　pH為7甘氨酸對Sa的抑制作用

甘氨酸可作為微生物的良好氮源，對E.coli和Sa是營養(yǎng)物質(zhì)，因此甘氨酸濃度過低則無法很好地抑制E.coli和Sa的生長，濃度過高則成本增加，并且對于氨基酸含量豐富的食品，添加的甘氨酸過量還可能會導(dǎo)致人體對營養(yǎng)吸收不平衡，因此甘氨酸對E.coli的最佳抑制濃度應(yīng)選擇2.0%，對Sa的最佳抑制濃度應(yīng)選擇2.5%。

2 2 不同pH值甘氨酸的抑菌效果

設(shè)置濃度為2.0%，pH值分別為5、6、7、8和9的甘氨酸溶液，測定其對E.coli的抑制作用效果，抑菌率分別為95.2%、98.1%、100.0%、100.0%、96.7%，如圖3所示。由圖3可知甘氨酸在pH 5～9范圍內(nèi)對E.coli都有良好的抑菌效果，且抑菌率差異不明顯，表明甘氨酸在pH 5～9的范圍內(nèi)都有抑菌作用。

圖3　2.0%甘氨酸對E.coli的抑制作用

設(shè)置濃度為2.5%，pH值分別為5、6、7、8和9的甘氨酸溶液，測定其對Sa的抑制作用效果，抑菌率分別為100.0%、92.4%、98.1%、97.0%、86.9%，如圖4所示。由圖4可知，甘氨酸在pH 5～9的范圍內(nèi)對Sa都有較好的抑菌效果，除pH=9的甘氨酸外，其他甘氨酸抑菌均抑菌率超過90.0%，且差異不明顯，表明甘氨酸在pH 5～8的范圍內(nèi)對Sa有良好抑菌作用，pH=9的甘氨酸抑菌效果稍差。

圖4　2.5%甘氨酸對Sa的抑制作用

甘氨酸在pH值為5～9的范圍內(nèi)對E.coli的抑制率均達到95.0%以上，對Sa的抑制率均達到85.0%以上，表明甘氨酸在較寬的pH值范圍內(nèi)對E.coli和Sa有廣泛的抑制作用。由圖3可知，甘氨酸在pH值為7或8時，對E.coli的抑菌效果最佳，由圖4可知甘氨酸在pH為7時抑菌率為98.1%，pH值為8時為97.0%，pH為7比pH為8抑菌更好，綜合考慮，甘氨酸對E.coli的最佳抑菌的pH應(yīng)為7。由圖4可知甘氨酸的pH值為5時對Sa的抑菌效果最佳，因此甘氨酸對Sa的最佳抑菌pH為5。

2.3不同時間甘氨酸的抑菌效果

選擇甘氨酸濃度為2.0%，pH值為7，設(shè)置14、16、18、20 h和22 h 5個不同的培養(yǎng)時間，測定甘氨酸對E.coli的抑制效果，得到的抑菌率分別為100.0%、95.4%、100.0%、100.0%、98.3%，如圖5所示。由圖5可知，甘氨酸對E.coli的抑制作用隨著培養(yǎng)時間的增加，甘氨酸對E.coli的抑菌率沒有明顯變化，即甘氨酸在5個培養(yǎng)時間里對E.coli都有良好的抑制效果，且5個時間里的抑菌率差異不明顯，表明甘氨酸在14～22 h內(nèi)對E.coli有良好的抑菌效果。

圖5　濃度為2.0%，pH值為7的甘氨酸對E.coli的抑制作用

選擇濃度為2.5%，pH值為5的甘氨酸，設(shè)置14、16、18、20 h和22 h 5個不同的培養(yǎng)時間，測定甘氨酸對Sa的抑制效果，得到的抑菌率分別為100.0%、100.0%、96.4%、91.1%、92.0%，如圖6所示。由圖6可知，甘氨酸對Sa的抑制作用隨著培養(yǎng)時間的增加逐漸減弱，當(dāng)時間到16 h時，抑菌率為100.0%，16 h后抑菌率降低，說明培養(yǎng)時間在16 h內(nèi)甘氨酸對Sa的抑制效果很好。甘氨酸在設(shè)置的5個培養(yǎng)時間里對Sa都有良好的抑制效果，并且五個時間里的抑菌率差異不明顯，表明甘氨酸在14～16 h內(nèi)對Sa有良好的抑菌效果。

圖6　濃度為2.5%，pH值為5的甘氨酸對Sa的抑制作用

甘氨酸在較長的時間內(nèi)對E.coli和Sa的抑制作用達到90.0%以上，呈現(xiàn)出較好的抑菌效果，表明甘氨酸能在較長的時間范圍內(nèi)起到良好的抑菌作用。

3　結(jié)論

通過測定不同濃度、pH值和時間的甘氨酸對E.coli和Sa這兩種細菌的抑菌率，確定甘氨酸濃度為2.0%，pH為7，培養(yǎng)14～22 h時，對E.coli的抑制作用最佳；甘氨酸濃度為2.5%，pH值為5，培養(yǎng)時間在16 h內(nèi)對Sa的抑制最佳。甘氨酸對E.coli和Sa都有較好的抑制作用。

對比不同濃度甘氨酸對E.coli和Sa的抑制作用，較低的甘氨酸濃度即可抑制E.coli的生長繁殖，說明E.coli對甘氨酸更為敏感。對比甘氨酸在pH值在5～9的范圍內(nèi)對E.coli和Sa的抑制作用，pH的變化對E.coli和Sa的抑制效果影響不大。對比培養(yǎng)時間對E.coli和Sa的抑制作用，在22h內(nèi)甘氨酸對E.coli的抑制效果變化較小，在16 h后對Sa的抑制作用隨著時間的延長而減弱，說明甘氨酸對E.coli的抑制時間更為長久。

4　結(jié)語

大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，甘氨酸對這兩種細菌都有良好的抑制作用，并在較寬的pH值范圍和時間范圍內(nèi)其抑菌率沒有顯著差異。

甘氨酸可作為一種安全無害的防腐劑應(yīng)用于易被E.coli和Sa污染的食品中，如米粉，糕點。甘氨酸既具有防腐作用，又具有營養(yǎng)和改善食品風(fēng)味等作用，其研究和開發(fā)利用有著廣闊的前景。

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中藥制劑共性技術(shù)研發(fā)重點實驗室子課題（編號：J16093）。

廖夏云（1985-）,女,博士。研究方向：食品質(zhì)量與安全。