李晨，肖林剛，胡亞鵬，梁宗鎖，董娟娥，*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命學(xué)院，陜西楊凌712100；2.陜西眾興高科生物科技有限公司，陜西楊凌712100）

金針菇提取物不同組分的抗氧化活性

李晨1，肖林剛2，胡亞鵬2，梁宗鎖1，董娟娥1，*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命學(xué)院，陜西楊凌712100；2.陜西眾興高科生物科技有限公司，陜西楊凌712100）

通過(guò)比較金針菇提取物不同組分（石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相及水相）的總酚含量和抗氧化活性（還原力、DPPH自由基、羥自由基的清除能力和超氧陰離子自由基清除能力），明確高的抗氧化活性組分群。結(jié)果表明，其中乙酸乙酯相的總酚含量（15.8mg/g）、還原力（15.70%）、DPPH自由基清除率（28.30%）、羥自由基清除率（33.53%）和超氧陰離子自由基清除率（33.20%）均為最高，為金針菇的有效組分。金針菇提取物中的總酚含量與抗氧化活性具有極顯著正相關(guān)性（p<0.05）；因此，酚類物質(zhì)是金針菇具有抗氧化能力的物質(zhì)基礎(chǔ)，乙酸乙酯可作為金針菇提取物的萃取劑。

金針菇；多酚；抗氧化活性；提取物

金針菇（Flammulina velutipes）又名毛柄金錢菌、構(gòu)菌和冬菇。隸屬于口蘑科金錢菌屬[1]。金針菇營(yíng)養(yǎng)極其豐富，富含有18種氨基酸和多種維生素其次還含有多糖、粘多糖、構(gòu)菌素等多種活性物質(zhì)；且富含鈣、磷、鐵等多種礦物。目前，以金針菇為原料加工的食品眾多，如金針露、低糖金針菇脯、金針菇蜜餞、金針菇菌油等[2-5]。目前，對(duì)于金針菇的研究主要集中在其多糖、氨基酸、蛋白質(zhì)及其產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)只有少量關(guān)于金針菇總酚類含量的報(bào)道，對(duì)金針菇酚類物質(zhì)不同萃取相及其抗氧化作用的研究幾乎沒(méi)有。酚類物質(zhì)是以醋化或糖普化形式存在的活性酚羥基，賦予酚類物質(zhì)抗氧化性等多種生理功能和藥用價(jià)值[6]。研究金針菇酚類物質(zhì)有利于金針菇的深度開(kāi)發(fā)，有效利用金針菇資源。

本試驗(yàn)通過(guò)乙醇回流法提取金針菇多酚類物質(zhì)，依次用石油醚，乙酸乙酯、正丁醇萃取，并測(cè)定不同萃取相的多酚的含量、還原力、DPPH自由基、羥自由基的清除能力和超氧自由基清除能力，確定抗氧化活性高的組分群。促進(jìn)金針菇產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，提高金針菇生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益和促進(jìn)金針菇資源的綜合利用方面具有重要的實(shí)際意義。研究結(jié)果將為后續(xù)探明金針菇抗氧化的物質(zhì)基礎(chǔ)以及開(kāi)發(fā)相關(guān)食品或保健品提供參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

取適量鮮金針菇于50℃真空干燥箱中烘干至恒重，粉碎，過(guò)20目篩，密封儲(chǔ)存，備用。

1.2 主要試劑及儀器

2，2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）、Folin-Ciocalteu試劑：購(gòu)自Solarbio公司；2-D-脫氧核糖：購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)110831-200904）：中國(guó)藥品生物制品檢定所；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）：購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、鐵氰化鉀、三氯乙酸、過(guò)氧化氫、氯化鐵、硫代巴比妥酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉均為分析純。

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-1800）：上海美譜達(dá)儀器有限公司；分析天平（AG204）：METTLER TOLEDO；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE52AA）：上海亞榮生化儀器廠；離心機(jī)（TGL-16）：高速臺(tái)式冷卻離心機(jī)。

2 研究方法

2.1 提取物不同組分的制備

稱取一定量金針菇粉，用石油醚脫脂后，以料液比1∶10（g/mL）的比例，加入80%的乙醇-水溶液，在80℃下回流提取3次，每次1 h，合并提取濾液，45℃旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)濃縮至干，得提取物。配置成0.1mg/mL的水溶液用于測(cè)定多酚含量及抗氧化活性。

取提取物100 g，充分分散于500mL蒸餾水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，得不同極性的萃取相和萃余相（水相）。分別將各萃取相和萃余相低溫抽真空濃縮，干燥，得提取物的不同組分；分別將各極性部位配制成0.1mg/mL的水溶液，進(jìn)行多酚含量和抗氧化活性測(cè)定。

2.2 多酚含量測(cè)定

按照Turkmen等[7]的方法。精確吸取1mL提取物及各極性部位的水溶液，加入0.5mL Folin-Ciocalteu（福林酚）試劑混勻，靜置5min后加入7.5%碳酸鈉溶液4mL，室溫下避光反應(yīng)2 h，在725 nm下測(cè)吸光值。以沒(méi)食子酸（0.1mg/mL～5.0mg/mL）作為標(biāo)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多酚含量（mg/g）。本研究計(jì)算得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=8.673 8x-0.095 68，R2=0.999 48。式中：y為濃度；x為吸光值。

2.3 還原力測(cè)定

采用Oyaizu[8]的方法。精確吸取1mL上述提取物和各極性部位（0.1mg/mL）溶液，加0.5mL磷酸鹽緩沖液（0.2mol/L，pH 6.6）和0.5mL 1%鐵氰化鉀溶液，50℃水浴20min。迅速冷卻，加入0.5mL 10%三氯乙酸（TCA），混合均勻，12 000 r/min離心10min，取上清液1.0mL加2.0mL蒸餾水和0.2mL 0.1%氯化鐵溶液反應(yīng)10min，700 nm下測(cè)定吸光值。樣品還原力表示為0.1mg/mL抗壞血酸的還原力的百分比。以蒸餾水為空白。

2.4 DPPH自由基清除率測(cè)定

按照Brand等[9]的方法，略有修改。取1mL不同濃度提取物或各相（0.1mg/mL），加入3mL 0.2mmol/L的DPPH自由基乙醇溶液，混勻，加入4.0mL乙醇溶液，于室溫下避光反應(yīng)30min后，在波長(zhǎng)517 nm下測(cè)定吸光值，蒸餾水代替提取液作為對(duì)照。按公式計(jì)算樣品對(duì)DPPH自由基的清除率。式中AC為空白樣品的吸光值，AS為不同濃度樣品的吸光值?？箟难崤cBHT的濃度為0.1mg/mL。

2.5 羥自由基清除率測(cè)定

按照Ren等[10]的方法，取1mL提取物或各相，加入0.1mL（10mmol/L）FeSO4·7H2O，0.1mLEDTA（10mmol/L），0.5mL 10mmol/L 2-D-脫氧核糖溶液，0.9mL磷酸鹽緩沖溶液（0.1mol/L，pH 7.4）混勻，加入0.2mL H2O2（10mmol/L），37℃反應(yīng)60min。加入1.0mL 2.8%TCA終止反應(yīng)，再加入1.0mL 1.0%硫代巴比妥酸，沸水浴15min。冷卻后于532 nm下測(cè)吸光值。以磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）為空白對(duì)照。按下列公式計(jì)算樣品對(duì)羥自由基的清除率?？箟难崤cBHT的濃度為0.1mg/mL。式中AC為空白樣品的吸光值，AS為不同濃度樣品的吸光值。

2.6 清除超氧陰離子自由基（O2-·）能力的測(cè)定

按照Randall等[11]的方法，略有修改。精確吸取0.5mL各待測(cè)液，每支試管加入3mL 0.1mol/L Tris-HCl磷酸鹽緩沖液（pH 8.2），水浴平衡20min，加入0.3mL 7mmol/L的鄰苯三酚準(zhǔn)確反應(yīng)4min，加入1mL 10mol/LHCl終止反應(yīng)，在波長(zhǎng)420nm處測(cè)吸光度，按下式計(jì)算清除率?？箟难崤cBHT的濃度為0.1mg/mL。式中Ac為空白對(duì)照液的吸光度（以蒸餾水代替樣品液的吸光度）；As為不同濃度樣品的吸光值。

2.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS18.0軟件進(jìn)行ANVOA統(tǒng)計(jì)分析，采用SNK法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（p<0.05），其中酚類物質(zhì)含量與抗氧化活性的關(guān)系運(yùn)用Pearson相關(guān)性分析。每個(gè)樣品重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 金針菇提取物與不同組分的多酚含量

采用福林酚法測(cè)定金針菇提取物不同組分中多酚含量，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 金針菇提取物不同組分多酚的含量Fig.1 Totalphenolcontentof F.velutipes w ith differentpolarities

結(jié)果顯示，提取物不同組分中均含有一定量的酚類物質(zhì)，且含量有顯著差異（p<0.05）。其中，乙酸乙酯相中多酚含量為15.8mg/g，顯著高于其它萃取相，其次為正丁醇相，顯著高于水相和石油醚相。說(shuō)明金針菇中的酚類物質(zhì)在中等級(jí)性的有機(jī)溶劑中溶解度較大。因此，乙酸乙酯可作為金針菇中酚類物質(zhì)的萃取溶劑。

另外，根據(jù)常規(guī)提取方法，一般在提取前對(duì)金針菇粉末進(jìn)行石油醚脫脂處理。本文考察了石油醚脫脂是否可以導(dǎo)致酚類物質(zhì)損失。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脫脂的石油醚中的確含有酚類物質(zhì)，因此在提取金針菇多酚類化合物時(shí)不應(yīng)該對(duì)金針菇粉末進(jìn)行石油醚脫脂操作。

3.2 金針菇提取物不同組分還原力測(cè)定

還原力大小用0.1mg/mL抗壞血酸還原力的百分比表示，金針菇提取物不同組分還原力的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。

結(jié)果表明，各極性部位均有一定的還原力，不同組分之間還原力有顯著差異（p<0.05）。其中乙酸乙酯相的還原力為15.7%，其次為提取物，均顯著高于其他萃取相，說(shuō)明不同組分還原力與多酚物質(zhì)含量有一定的正相關(guān)性。

圖2 金針菇提取物不同組分還原力的測(cè)定Fig.2 Reducing power of F.velutipes with different polarities

3.3 金針菇提取物不同組分DPPH自由基清除能力測(cè)定

金針菇不同組分均有一定的DPPH自由基清除能力結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 金針菇提取物不同組分DPPH自由基清除能力Fig.3 DPPH radicalscavenging capacity of F.velutipes with different polarities

結(jié)果顯示，不同組分清除能力不同，且差異顯著（p <0.05）。其中乙酸乙酯相的DPPH自由基清除能力最高28.3%，顯著高于其他萃取相，為DPPH自由基清除的有效部位，其次為提取物、水相和正丁醇相。水相與正丁醇相的DPPH自由基清除能力基本相同，可能是因?yàn)檎〈寂c水出現(xiàn)了一定的互溶。

3.4 不同組分羥自由基清除能力

金針菇不同組分的羥自由基清除能力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 金針菇提取物不同組分羥自由基清除能力Fig.4 Hydroxyl radicalscavenging capacity of F.velutipes with different polarities

結(jié)果顯示不同組分清除能力不同，且差異顯著（p <0.05）。其中乙酸乙酯相的羥自由基清除能力最高33.53%，是清除羥自由基的有效部位，其次為提取物26.22%，與酚類物質(zhì)的含量呈正相關(guān)。盡管乙酸乙酯相的羥自由基清除能力低于陽(yáng)性對(duì)照抗壞血酸和BHT，但仍然具有很強(qiáng)的羥自由基清除能力，由于抗壞血酸和BHT均為高純度的分析純，而金針菇的不同提取組分是由多種物質(zhì)組成的混合物，如將其進(jìn)一步提純，其羥自由基清除能力可能將大幅度提升。

3.5 不同組分總超氧陰離子自由基清除能力

金針菇不同組分的超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)5。

圖5 金針菇提取物不同組分超氧陰離子自由基清除能力Fig.5 Superoxideanion radicalscavenging capacity of F.velutipes w ith differentpolarities

結(jié)果顯示，不同組分清除能力不同，且差異顯著（p<0.05）。其中乙酸乙酯相的超氧陰離子自由基清除能力為33.20%，其次為提取物、正丁醇相和水相，最后為石油醚相。乙酸乙酯相是清除超氧陰離子自由基清除的有效部部位。乙酸乙酯相的超氧陰離子自由基清除能力雖不能與抗壞血酸相媲美，但其超氧陰離子自由基清除的能力與陽(yáng)性對(duì)照BHT相比無(wú)顯著差異。

4 結(jié)論與討論

金針菇是世界第三大食用菌，具有高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[12]。近年研究表明，金針菇含有多糖、蛋白、氨基酸、火菇素、黃酮等多種生理活性物質(zhì)[13]。目前的研究主要集中在金針菇栽培、多糖的提取及抗氧化活性[14]，對(duì)酚類物質(zhì)的研究報(bào)道較少。多酚類化合物具有多種生理活性，如抗氧化、抗腫瘤、預(yù)防心血管疾病、緩解疲勞、抗炎等功效[14-16]。本文通過(guò)檢測(cè)金針菇提取物不同組分酚類物質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯萃取相的酚類物質(zhì)含量最高，說(shuō)明其在乙酸乙酯等中等極性的有機(jī)溶劑中的溶解度最大。另外發(fā)現(xiàn)，金針菇在提取前用石油醚進(jìn)行脫脂處理，會(huì)使一些溶于石油醚的極性較小的酚類物質(zhì)溶出，造成損失，因此在提取金針菇多酚類化

合物時(shí)不宜進(jìn)行石油醚脫脂操作。

對(duì)金針菇提取物不同組分的抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn)，不同組分的抗氧化活性與酚類成分的含量存在極顯著的正相關(guān)，其中乙酸乙酯相的還原力（15.70%）、DPPH自由基清除率（28.30%）、羥自由基清除率（33.53%）和超氧陰離子自由基清除率（33.20%）均高于其他萃?。ㄓ啵┫?，表明金針菇酚類物質(zhì)是抗氧化的活性成分，乙酸乙酯萃取相為金針菇提取物的活性部位。

綜上所述，金針菇提取物不同組分均有抗氧化活性，其中乙酸乙酯萃取相的總酚含量及抗氧化活性最強(qiáng)，因此，乙酸乙酯可作為金針菇的萃取劑，為金針菇的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供了一定的理論基礎(chǔ)；為研究金針菇抗氧化的物質(zhì)基礎(chǔ)以及開(kāi)發(fā)相關(guān)食品或保健品提供參考依據(jù)。

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Antioxidant Activity of Flmmulina velutipes w ith Different Polarities

LIChen1，XIAOLin-gang2，HUYa-peng2，LIANGZong-suo1，DONG Juan-e1，*
（1.Collegeof Life Sciences，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，Shaanxi，China；2.Shaanxi Zhongxing High-tech Biological Technology Co.，Ltd.，Yangling712100，Shaanxi，China）

In this study，by comparing the Flmmulina velutipes extract and different polar parts（petroleum ether，ethylacetate，n-butanolphase and water phase）wasevaluated based on the detection of the contentof total phenols，reducing power，DPPH radical scavenging activity，hydroxyl radical scavenging rate and superoxide anion radical scavenging rate in order to find themost effective ones with higher antioxidant activity as wellas total phenols.Results show that the total phenol contentofethylacetate phase（15.8mg/g），reducing power（15.70%）and DPPH radical scavenging rate（28.30%），hydroxyl radical scavenging rate（33.53%）and superoxideanion radicalscavenging rate（33.20%），totalphenol contentand antioxidantactivity have significantcorrelation（p＜0.05）；In summary，phenolic compounds resulted in antioxidantactivity of F.velutipes. Ethylacetate can beused asa crudeextractings from Flmmulinavelutipes extraction agent.

Flmmulina velutipes；totalphenols；antioxidantactivity；extractive

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.002

2016-02-26

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃（No.2015KTTSNY03-07）

李晨（1994—），女（漢），碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物提取分離。

*通信作者：董娟娥，女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：天然產(chǎn)物提取分離。