蘇 峰，郝少君，孫建華，馬珍珍，李文俊，黎丹東，張正臣

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·論著·

復(fù)方黃櫨口服液對小鼠黃疸型肝炎模型血清中指標(biāo)的影響

蘇 峰，郝少君，孫建華，馬珍珍，李文俊，黎丹東，張正臣*

目的 觀察復(fù)方黃櫨口服液對異硫氰酸-萘酯致小鼠黃疸型肝炎模型的影響。方法 將72只KM小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、護(hù)肝寧片組(1.012 5 g/kg)及大、中、小劑量復(fù)方黃櫨口服液組(30、15、30 mL/kg)，每組12只，空白組和模型組灌胃相同體積生理鹽水，其余組連續(xù)灌胃相應(yīng)藥物10 d。各組于實(shí)驗(yàn)第8天，灌胃ANIT造模，48 h后取血，分離血清，取血清并檢測血清ALT、AST、TNF-α等生化指標(biāo)，觀察肝臟病理組織學(xué)改變。結(jié)果 小鼠黃疸型肝炎模型造模成功；與模型組相比，大、中、小劑量復(fù)方黃櫨口服液組血清中ALT、AST、TNF-α水平均顯著降低(P<0.01)。結(jié)論 復(fù)方黃櫨口服液對ANIT誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷具有很好的保護(hù)作用。

復(fù)方黃櫨口服液；小鼠；異硫氰酸-萘酯；急性肝損傷

0 引言

黃櫨(Continuscoggygriascop.)具有治療黃疸性肝炎的作用。371醫(yī)院及相關(guān)人員對黃櫨進(jìn)行了制劑及藥理研究[1]，并進(jìn)行了臨床觀察。為增強(qiáng)其療效，我們在其基礎(chǔ)上研制了復(fù)方黃櫨口服液，該制劑由黃櫨[2]、五味子、垂盆草、梔子[3]、枸杞、大棗等六味中藥組成。諸藥合用具有除濕清熱[4]、退黃降酶、保肝等作用，臨床用于急性黃疸型肝炎[5]，慢性肝炎及丙肝等引起的黃疸偏高、轉(zhuǎn)氨酶高等療效較好。為驗(yàn)證其作用，并探討其作用特點(diǎn)，筆者觀察其對黃疸型肝炎小鼠血清中的各項(xiàng)生化指標(biāo)及肝臟組織形態(tài)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 小鼠，種系：KM，等級：SPF級，雌雄各半，18～22 g，合格證號：37009200000791，提供單位：山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司。小鼠飼養(yǎng)在河南中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SYXK(豫)2015-0005。消毒飼料、消毒墊料均由河南省實(shí)驗(yàn)動物中心提供。飲水為消毒蒸餾水。飼養(yǎng)條件：溫度20～25 ℃，相對濕度40%～60%，自然光照，每籠6只，常規(guī)飼養(yǎng)，隔天更換墊料。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品和試劑 復(fù)方黃櫨口服液，解放軍第三七一醫(yī)院，批號：20150420，內(nèi)服，20 mL/次,3次/d；護(hù)肝寧片，廣東寶丹制藥有限公司，批號:20150701；橄欖油，西班牙億芭橄欖油公司生產(chǎn)，批號:20150701；Mouse AST Elisa kit，DG，批號：23037906；Mouse ALT Elisa kit，DG，批號：23037907；Mouse TNF-α Elisa kit，DG，批號：23037905。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 FA(N)/JA(N)系列電子天平，上海民橋精密儀器有限公司；HWS12型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；KDC-160HR高速冷凍離心機(jī)，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；680型酶標(biāo)儀，美國BIO-RAD公司；可調(diào)式移液器，上海雷勃分析儀器有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 取小鼠72只，隨機(jī)分為6組，每組12只，雌雄各半，隨機(jī)分為空白組，模型組，護(hù)肝寧片組(1.012 5 g/kg，相當(dāng)于臨床用量的15倍，0.3 mL/20 g)，大、中、小劑量復(fù)方黃櫨口服液組(30、15、7.5 mL/kg，相當(dāng)于臨床用量的30、15、7.5倍，0.3 mL/20 g)，每天給藥1次，連續(xù)給藥10 d。于第8天給藥后2 h，各給藥組及模型組灌服0.4% ANIT橄欖油溶液(100 mg/kg),空白組給予同體積的橄欖油，48 h后取材,取材前禁食不禁水12 h。全部小鼠摘眼球取血并處死，離心、分離血清，所采血液室溫靜置后3 000 r/min 4 ℃離心15 min，取留血清用于生化檢查，按試劑盒說明分別測血清AST、ALT、TNF-α水平。剝離肝臟，取肝臟正中葉相同部位的組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方黃櫨口服液對小鼠黃疸型肝炎模型血清中指標(biāo)ALT、AST、TNF-α的影響 與空白組比較，模型組血清中ALT、AST、TNF-α水平顯著升高(P<0.01)，說明造模成功。與模型組比較，大、中、小劑量復(fù)方黃櫨口服液組和護(hù)肝寧片組均可顯著降低血清中ALT、AST、TNF-α水平(P<0.01)。見表1。

表1 復(fù)方黃櫨口服液對小鼠黃疸型肝炎模型血清中指標(biāo)的影響

注：與模型組比較，**P<0.01

2.2 黃櫨口服液對肝臟組織形態(tài)的影響[6-8]各組肝臟組織學(xué)觀察顯示，空白對照組小鼠肝組織的肝小葉分界清晰，肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細(xì)胞正常。模型組小鼠肝組織肝小葉分界不清晰，肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞出現(xiàn)局灶性壞死和嗜酸性變及點(diǎn)狀壞死，可見有膽栓形成。護(hù)肝寧片組小鼠肝組織的肝小葉分界不清晰，可見肝細(xì)胞出現(xiàn)局灶性壞死和點(diǎn)狀壞死，匯管區(qū)出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤，及少量膽栓形成。大劑量復(fù)方黃櫨口服液組小鼠肝組織肝小葉分界欠清晰，可見部分肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列，部分排列紊亂；肝細(xì)胞出現(xiàn)局灶性壞死和點(diǎn)狀壞死，同時(shí)可見部分再生的肝細(xì)胞，膽栓明顯減少。中劑量復(fù)方黃櫨口服液組小鼠肝組織的肝小葉分界較為清晰，肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列，可見少個(gè)肝細(xì)胞局灶性壞死，以及大量的再生的肝細(xì)胞。小劑量復(fù)方黃櫨口服液組小鼠肝組織的少部分肝小葉分界清晰，而大部分分界不清楚；肝細(xì)胞出現(xiàn)局灶性壞死和點(diǎn)狀壞死及少個(gè)膽栓形成，可見大量的再生肝細(xì)胞。見圖1。

3 討論

復(fù)方黃櫨口服液由黃櫨、五味子[9]、垂盆草[10]、梔子、枸杞[11]、大棗等六味中藥組成。該方劑由藥械科、感染科合作結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)中醫(yī)理論和現(xiàn)代藥理研究成果擬定的院內(nèi)協(xié)定處方。諸藥合用具有除濕清熱、退黃降酶、護(hù)肝等作用。經(jīng)臨床觀察，復(fù)方黃櫨口服液治療黃疸型和無黃疸型肝炎具有降酶、保肝的作用，療效顯著。本研究觀察大、中、小劑量復(fù)方黃櫨口服液組對小鼠黃疸型肝炎模型血清中指標(biāo)的影響，并觀察其是否存在量效關(guān)系。

圖1 復(fù)方黃櫨口服液對黃疸型肝炎模型小鼠肝組織形態(tài)的影響

本研究采用0.4% α-萘異硫氰酸酯(ANIT)橄欖油溶液(100 mg/kg)建立模型。ANIT是一種間接肝毒劑[12]，主要損傷肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞，引起毛細(xì)膽管增生及小葉間膽管周圍產(chǎn)生炎癥，從而造成膽管阻塞，形成明顯的膽汁淤積，并伴以點(diǎn)狀壞死為主的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損害，產(chǎn)生膽汁淤積性黃疸，出現(xiàn)高膽紅素血癥和膽汁分泌減少。目前常用黃疸動物模型為灌胃給予實(shí)驗(yàn)動物ANIT造成[13]，通常實(shí)驗(yàn)動物為小鼠[14]和大鼠[15]。ANIT誘發(fā)的小鼠肝損傷的生物化學(xué)和病理形態(tài)學(xué)改變類似于人類肝內(nèi)膽汁淤積病變，本實(shí)驗(yàn)采用先給藥后造模的方法觀察復(fù)方黃櫨口服液對小鼠黃疸型肝炎的預(yù)防作用。

ALT[16]與AST主要分布在肝細(xì)胞內(nèi)，肝細(xì)胞壞死，則ALT和AST升高，且升高程度與肝細(xì)胞受損程度相一致，是最常用的肝功能指標(biāo)。ANIT灌服后，先發(fā)生膽管周圍微環(huán)境的改變，巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞受刺激后觸發(fā)其免疫、吞噬及細(xì)胞毒作用,導(dǎo)致膽管上皮細(xì)胞和肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞受損或壞死，繼之以膽紅素、膽酸和膽鹽的代謝紊亂，最終導(dǎo)致膽汁淤積性肝損傷。TNF-α是一種重要的前炎性因子[17]，適量時(shí)可發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能,分泌過多或調(diào)節(jié)失控時(shí)，則引起免疫病理損傷。TNF-α與肝損傷密切相關(guān)。

本研究表明，復(fù)方黃櫨口服液可以顯著降低血清中ALT、AST、TNF-α水平，表明其有明顯的降酶作用。黃疸型肝炎動物實(shí)驗(yàn)中常用的陽性藥為護(hù)肝寧片，護(hù)肝寧片對實(shí)驗(yàn)動物具有保肝降酶作用。復(fù)方黃櫨口服液對黃疸模型小鼠具有退黃降酶作用，在治療肝病方面有良好的開發(fā)應(yīng)用前景，其作用機(jī)制可能與保護(hù)肝細(xì)胞、加強(qiáng)膽紅素結(jié)合與排泄、降低毛細(xì)膽管壓、促進(jìn)膽汁的排泄有關(guān)。本試驗(yàn)為臨床提供了應(yīng)用依據(jù)，可作為增加藥源的參考，但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Effects of compound sumac oral liquid on serum indexes of mouse model of icterohepatitis

SU Feng，HAO Shao-jun，SUN Jian-hua，MA Zhen-zhen，LI Wen-jun，LI Dan-dong，ZHANG Zheng-chen*

(The 371st Central Hospital of the Chinese People′s Liberation Army，Xinxiang 453000,China)

Objective To observe the effect of compound sumac oral liquid on cotinusisothiocyanate-naphthyl acetate induced mouse model of icteric hepatitis.Methods Totally 72 KM mice were randomly divided into control group,model group,Huganning tablets group (1.012 5 g/kg) and large,medium and small dose of compound sumac oral liquid group (30,15,30 mL/kg),12 rats in each group.Control group and model group were given intragastric administration of the same volume of saline;continuous intragastric administration of corresponding drugs was performed in the other groups for 10 d. After 8 days of experiment,the model of ANIT was made by filling the stomach,blood was taken after 48 h,the serum was separated and taken,and the serum ALT,AST,TNF-α and other biochemical indexes were detected. The pathological changes of liver were observed. Results The building of icterohepatitis model of mouse was successful.Compared with the model group,large,medium and small dose of compound sumac oral liquid could obviously reduce the levels of serum ALT,AST,TNF-α (P<0.01).Conclusion Compound sumac oral liquid can obviously protect mouse liver damaged by ANIT.

Compound sumac oral liquid;Mouse；Isothiocyanate-naphthyl;Acute liver damage

2016-05-06

中國人民解放軍第三七一中心醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453000

河南新鄉(xiāng)重點(diǎn)科技攻關(guān)(ZG14012)

10.14053/j.cnki.ppcr.201611001

*通信作者