李 潔 陸仲斐 童 銳 李向偉 周 凌（上海凡測質(zhì)量檢測有限公司，上海市長寧區(qū) 005；上海必諾檢測技術(shù)服務(wù)有限公司，上海市靜安區(qū) 0046；上海市閔行區(qū)疾病預(yù)防控制中心 00）

動物源性成分鑒別的樣品制備方法研究
——應(yīng)用于PCR及熒光定量PCR方法的樣品制備

李 潔1陸仲斐2童 銳3李向偉1周 凌1（1上海凡測質(zhì)量檢測有限公司，上海市長寧區(qū) 200335；2上海必諾檢測技術(shù)服務(wù)有限公司，上海市靜安區(qū) 200436；3上海市閔行區(qū)疾病預(yù)防控制中心 201101）

為減少因樣本選擇引起的誤差，把抽樣可能存在的片面性問題的風險降到最低，確保制備后的DNA質(zhì)量，對動物源性成分鑒別樣品的前處理方法進行了研究，將用同樣采集方法得到的粗樣品，經(jīng)四分法均勻化和非均勻化的不同預(yù)處理后，以同樣的提取和檢測方法，與制備的標準對照品一起進行了檢測。結(jié)果表明，市售的32份樣品經(jīng)均勻化后的檢測結(jié)果符合率在93.7%以上。表明本實驗研究及建立的動物源性成分鑒別樣品的取樣及預(yù)處理方法是有效可行的，能滿足實時熒光PCR實驗對樣品均勻性的要求。

動物源性成分鑒別樣品；熒光定量PCR；取樣；預(yù)處理；方法

熒光定量PCR作為一種檢測食品中細菌及其他成分的方法，具有簡便、快速、敏感性高、特異性強等優(yōu)點，自20世紀90年代以來，就被廣泛應(yīng)用于食品及臨床和環(huán)境樣品的檢測。熒光定量PCR方法用于肉類成分鑒別時，在靈敏度、準確性和重復(fù)性等重要性能參數(shù)上，具有無可比擬的優(yōu)勢，不僅是該領(lǐng)域的主流檢測技術(shù)，還是仲裁方法和司法鑒定的理想技術(shù)類型，更是現(xiàn)行國家和行業(yè)標準中指定的方法之一。在檢測實踐中發(fā)現(xiàn)，多種因素會對PCR的檢測結(jié)果造成影響，且關(guān)于送測樣品的取樣和預(yù)處理方法對其影響較大，但目前卻尚未有研究報道。為此，通過對目前熒光定量檢測中有關(guān)肉類與肉制品（動物源性成分鑒別樣品）的抽樣方法及相關(guān)標準的調(diào)查，結(jié)合實驗測試，根據(jù)肉類與肉制品的特點，就肉類與肉制品樣品的取樣及預(yù)處理方法進行了研究，并提出了比較有效可靠的熒光定量檢測方法中動物源性成分樣品取樣及預(yù)處理的操作方法，以供相關(guān)檢測同行參考。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

主要試劑為蛋白酶K、RNA酶、dNTPs、10×PCR緩沖液、MgCl2、Taq DNA聚合酶、2000bp ladder DNAmarker、血液/細胞/組織基因組DNA。提取試劑盒、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒等均購自愛思進生物技術(shù)（杭州）有限公司；鴨、牛、羊源性成分實時熒光試劑盒均由上海凡測質(zhì)量檢測有限公司提供；引物、探針的合成及序列測定均由上海立菲生物技術(shù)有限公司完成。

主要儀器為CZ-18全自動打漿機（廣州晨雕機械設(shè)備有限公司）、JFYZ分樣器（西安唯信檢測設(shè)備有限公司）、ABI梯度PCR擴增儀、熒光PCR擴增儀(Life Technologies公司)、GenoSens1880凝膠成像系統(tǒng)(上海勤翔科學儀器有限公司)、電泳系統(tǒng)(伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司)、Sigma臺式離心機（上海珂淮儀器有限公司)。

1.2 取樣方法

1.2.1 原始樣品的采集[1、2]

依據(jù)GB/T 9695.19-2008[1]和CCGF 113-2010進行肉類（鮮肉、凍肉）及肉制品原始樣品采樣。具體操作如下：（1）鮮肉。若為成堆產(chǎn)品，根據(jù)貨物堆放的形狀可在四角＋中間設(shè)采樣點，依據(jù)每點分上、中、下三層或上、中上、中、中下、下或/和“W”5點方式或梅花點方式等，確定取樣位置，取若干小塊混為一份樣品；若為零散產(chǎn)品，則隨機從3～5片胴體上取若干小塊混為一份樣品。每份樣品重量500～1 500 g。（2）凍肉。小包裝凍肉同批同質(zhì)隨機取3～5包混合，每份樣品總重量不得少于1 000 g。凍肉取樣方法參見鮮肉。（3）肉制品。大片肉制品的取樣方法參見鮮肉；每件重量500 g以上的產(chǎn)品，同批同質(zhì)隨機從3～5件上取若干小塊混合，每份樣品重量500～1 500 g；每件重量500 g以下的產(chǎn)品，同批同質(zhì)隨機取3～5件混合，每份樣品總重量不得少于1 000 g；小塊碎肉，從堆放平面的四角和中間取樣混合，每份樣品重量500～1 500 g。

1.2.2 DNA抽提前的樣品采集

將送測的500～1 500 g樣品用生理鹽水清洗后，在粉碎打漿機中充分攪拌并打成肉漿后備用。

1.3 預(yù)處理方法

1.3.1 均勻化樣本的制備[3]

（1）將上述肉漿充分攪拌均勻備用。（2）把分樣器內(nèi)部清理干凈，關(guān)上漏斗開關(guān)，放好承接器，將（1）樣品從高于分樣器口5 cm處均勻地注入漏斗內(nèi)，刮平樣品后打開漏斗開關(guān)，樣品即分別流入，兩個承接器內(nèi)的樣品同時倒入漏斗內(nèi)，繼續(xù)混合2次，然后取出一個承接器，仍按上述操作方法繼續(xù)分樣，直至一個承接器的樣品接近所需試樣的重量為止（設(shè)定為總重量的1/16，即30～100 g）。每個樣品分樣完畢后，清洗干凈分樣器內(nèi)外部后再進行第2個樣品的制備。（3）將（2）制備好的樣品，稱取20 g，再平分成10份，其中3份檢測、3份復(fù)檢、4份備查。

1.3.2 非均勻化樣品的采集及制備[3]

將1.2.1的樣品隨機稱取100 g左右，打成肉漿，再稱取20 g，平分成10份，其中3份檢測、3份復(fù)檢、4份備查。1.3.3 樣本的抽提和檢測

樣品抽提及檢測參照SN/T 2051-2008、SN/T 2727-2010進行。

1.4 前處理方法的應(yīng)用比較

采用市售牛、羊和豬肉，按照一定比例混合，依據(jù)上述1.2及1.3方法進行樣品前處理制備，制備方案（見表1）[4～6]。

表1 標準樣品制備方案

為進一步驗證建立的取樣和預(yù)處理方法的有效性及準確性， 對上海各區(qū)進行了樣品的隨機采集。對小吃攤、超市、火鍋店、市場的羊肉卷、牛排、豬排等進行隨機取樣。對采集的樣品采用1.2及1.3方法進行前處理以及未進行四分法前處理的，分別提取DNA，其中采集羊肉制品12份、牛肉制品12份、豬肉制品8份。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準樣品的檢測結(jié)果

檢測結(jié)果表明（見表2），采用表1方案制備的樣品檢測結(jié)果接近真實添加量，證實采用本研究的前處理方法確實可行。

2.2 抽檢樣品不同前處理方法的檢測結(jié)果

檢測結(jié)果表明（見表3），兩種前處理方法的樣品檢測結(jié)果差異顯著(P＞0.05)[7]。

綜合表2、3可知，檢測結(jié)果的差異并不是由于抽樣誤差所造成的，而是由于樣品前處理方法的不同所致。

3 結(jié)論與討論

檢測結(jié)果表明：（1）采用1.2和1.3的樣品前處理方法，樣品間沒有顯著性差異，且樣品的均勻性較好，能滿足實時熒光PCR實驗對樣品均勻性的要求。（2）某些平行樣品之間的檢測結(jié)果相差較大，說明可能還有其他因素影響PCR的檢測結(jié)果。如附著在牛羊豬肉制品表面或中間的淀粉等非動物源性物質(zhì)，會影響到實際取得的樣品重量，從而影響抽提效果，但這些非動物源性物質(zhì)的影響有多在還有待今后進一步研究探討。同時，對本次實驗來說，測定樣品、操作人員、操作手法均相同，因此，對PCR結(jié)果的影響是隨機的，對本次統(tǒng)計學結(jié)果沒有影響。（3）目前針對食品的PCR檢測中，樣品前處理方法尚無相應(yīng)的國家標準，且在行業(yè)標準中也未見明確規(guī)定，在實際操作過程中如何前處理長期存在意見不統(tǒng)一現(xiàn)象，因此，筆者提出的動物源性成分鑒別樣品前處理方法可為今后此類國家標準的出臺提供參考。

表3 市場抽檢樣品不同前處理方法的檢測結(jié)果分析

[1] GB/T 9695.19-2008肉與肉制品 取樣方法[S].2008.

[2] 楊君娜,李家鵬,周彤,等.適于肉種摻雜比例實時熒光PCR測定的樣品前處理方法[J].肉類研究,2011(12):25-28.

[3] 盧行安,鄭江,曹志軍,等.微生物能力驗證樣品均勻性試驗的研究[J].中國微生態(tài)學雜志,2003,l5(1):33-34.

[4] SN/T 2727-2010飼料中禽源性成分檢測方法 實時熒光PCR方法[S].2010.

[5] SN/T 2051-2008 食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法 實時PCR法[S].2008.

[6] 郭鳳柳,熊蕊,劉曉慧,等.應(yīng)用PCR技術(shù)檢測摻假肉類[J].食品安全質(zhì)量檢測學報,2014(2):541-545.

[7] 王欽德,楊堅.食品試驗設(shè)計與統(tǒng)計分析[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學出版社.2005.

2016-07-04