張素華，邊英男，趙　琪，李成濤（司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200063）

二代測序技術(shù)在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展

張素華，邊英男，趙琪，李成濤
（司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200063）

近幾年二代測序（second generation sequencing，SGS）技術(shù)的快速發(fā)展，使其在通量增大、讀長增加的同時(shí)測序成本大幅降低，給生物學(xué)領(lǐng)域帶來了新的突破，也使法醫(yī)遺傳學(xué)進(jìn)入了一個(gè)新的發(fā)展階段。本文從測序技術(shù)在法醫(yī)遺傳學(xué)的應(yīng)用歷程展開，回顧了測序技術(shù)對(duì)法醫(yī)學(xué)遺傳標(biāo)記檢測的重要性。以已有相關(guān)法醫(yī)學(xué)研究應(yīng)用的Roche、Illumina和Life Technologies三大測序技術(shù)公司推出的二代測序技術(shù)平臺(tái)為例，探討其在法醫(yī)遺傳學(xué)中的應(yīng)用現(xiàn)狀及潛能。目前可依賴這些平臺(tái)完成DNA水平遺傳標(biāo)記（SNP、STR）、RNA水平遺傳標(biāo)記（mRNA、microRNA）及線粒體DNA全基因組的測序。然而，技術(shù)產(chǎn)品的推出及驗(yàn)證、分析軟件的成熟化、與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫的對(duì)接、大數(shù)據(jù)使用中的倫理問題等都是決定該技術(shù)能否替代（或補(bǔ)充）成熟PCR毛細(xì)管電泳技術(shù)以及普遍應(yīng)用于案件檢測的關(guān)鍵。

法醫(yī)遺傳學(xué)；二代測序；綜述［文獻(xiàn)類型］；遺傳標(biāo)記

1　測序技術(shù)在法醫(yī)遺傳學(xué)的應(yīng)用歷程

DNA測序技術(shù)在法醫(yī)學(xué)中最早的應(yīng)用是采用Sanger技術(shù)進(jìn)行線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）高變區(qū)測序［1-3］。在20世紀(jì)80年代末至90年代初，法醫(yī)學(xué)個(gè)人識(shí)別主要依賴限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）遺傳標(biāo)記的檢測，但是RFLP對(duì)DNA質(zhì)量要求高，故無法對(duì)降解或微量的DNA樣本（特別是骨DNA或者脫落毛發(fā)）提供有效的遺傳信息［4-5］，因此，引發(fā)了對(duì)這部分DNA檢材進(jìn)行mtDNA高變區(qū)HVⅠ/HVⅡ的研究熱潮。1999年，歐洲D(zhuǎn)NA分型組織（European DNA Profiling group，EDNAP）建立了mtDNA數(shù)據(jù)庫（EMPOP）［6］，旨在為mtDNA測序建立一個(gè)通用的法醫(yī)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并提供mtDNA在線數(shù)據(jù)庫，用于數(shù)據(jù)的查閱及比對(duì)。截至2013年10月16日，EMPOP中共包含34 617條來自全世界各地的線粒體序列信息，數(shù)據(jù)的獲得主要依賴于傳統(tǒng)的Sanger測序法（也稱為雙脫氧鏈末端終止法）。之后，連接有熒光標(biāo)記基團(tuán)的ddNTP和毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）技術(shù)的發(fā)展，在大大提高測序靈敏度和通量的同時(shí)測序成本大幅下降，使得對(duì)整個(gè)環(huán)狀mtDNA測序變得可能。然而，受引物設(shè)計(jì)和測序通量的限制，該測序過程耗時(shí)長、成本高、結(jié)果分析繁瑣，無法廣泛應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)生物檢材的mtDNA全基因組測序。

隨著CE技術(shù)的成熟和STR、SNP遺傳標(biāo)記在法醫(yī)遺傳學(xué)中的廣泛應(yīng)用，法醫(yī)生物學(xué)領(lǐng)域?qū)τ趍tDNA測序的需求逐步降低。Sanger技術(shù)在STR檢測中主要用于等位基因的發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)；在SNP檢測中進(jìn)行單位點(diǎn)測序，被認(rèn)為是SNP檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但是由于通量低、成本高，在SNP檢測中無法廣泛使用。之后，SNPshot、SNPlex、Taqman、質(zhì)譜檢測、單堿基延伸（single base extension，SBE）和焦磷酸測序（pyrosequencing）等技術(shù)都在法醫(yī)學(xué)SNP檢測中發(fā)揮了重要的作用［7-9］。

隨著人類基因組計(jì)劃（Human Genome Project，HGP）的成功，科學(xué)家們開始了新一代測序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）的研發(fā)，以建立更先進(jìn)、更快速、更高通量的測序技術(shù)，克服第一代測序技術(shù)成本高、通量低及對(duì)人力需求大等缺陷?；诖笠?guī)模平行測序（massively parallel sequencing，MPS）的二代測序（second generation sequencing，SGS）技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。第一臺(tái)SGS平臺(tái)是Roche公司推出的基于焦磷酸測序原理的454基因組測序儀［10］。之后其他SGS測序方法及相關(guān)平臺(tái)的研發(fā)進(jìn)入了新的發(fā)展階段，相關(guān)研究文獻(xiàn)也呈指數(shù)增長。與傳統(tǒng)測序技術(shù)相比，SGS測序無論是測序原理、測序過程、適用范圍還是測序結(jié)果都存在本質(zhì)的不同，給生物學(xué)領(lǐng)域帶來新的突破，對(duì)法醫(yī)遺傳學(xué)這一應(yīng)用性學(xué)科也帶來了沖擊和挑戰(zhàn)。從2012年起，應(yīng)用SGS技術(shù)平臺(tái)對(duì)法醫(yī)學(xué)常用遺傳標(biāo)記（STR和SNP）及mtDNA和RNA的研究進(jìn)入白熱化［10-25］，部分生物公司開始針對(duì)法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研發(fā)適當(dāng)通量的SGS檢測平臺(tái)及相關(guān)商品化試劑盒［22-23］。另外，也有學(xué)者開始關(guān)注第三代測序技術(shù)（單分子測序技術(shù)）在法醫(yī)學(xué)的相關(guān)應(yīng)用［10］。本文就目前常用的SGS平臺(tái)在法醫(yī)遺傳學(xué)中的研究進(jìn)展及展望進(jìn)行綜述。

2　常見法醫(yī)學(xué)SGS平臺(tái)及原理

目前市場上SGS平臺(tái)根據(jù)測序原理、測序通量的不同可分為多種類型，適用于不同的科學(xué)研究目的。本文僅以Roche、Illumina和Life Technologies三大測序技術(shù)公司推出的SGS平臺(tái)為例，探討其原理及在法醫(yī)遺傳學(xué)中的應(yīng)用潛能。

2.1Roche 454基因組測序儀

2005年底，Roche 454基因組測序儀的推出開創(chuàng)了高通量測序技術(shù)的先河。454基因組測序儀使用的是一種類似焦磷酸測序的創(chuàng)新測序方法，利用“Pico TiterPlate（PTP）”平板（含有160多萬個(gè)由光纖組成的孔，孔中載有化學(xué)發(fā)光反應(yīng)所需的各種酶和底物），在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用下，將每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)釋放偶聯(lián)起來，并利用乳液PCR（emulsion PCR，emPCR）對(duì)DNA文庫進(jìn)行放大，通過檢測熒光信號(hào)釋放的有無和強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)、大規(guī)模并行測定DNA序列的目的。測序反應(yīng)中以磁珠為反應(yīng)載體，每個(gè)磁珠上連接一個(gè)文庫，采用CCD相機(jī)進(jìn)行信號(hào)收集，并通過FLX系統(tǒng)進(jìn)行分析，平均讀長在400bp［10］。之后推出的Roche 454 GS FLX+最大讀長可達(dá)到1000bp，測序準(zhǔn)確性高達(dá)99%，與Sanger測序相當(dāng)，可謂集一代測序讀長及質(zhì)量優(yōu)勢與二代測序高通量的特點(diǎn)于一身。然而，由于該平臺(tái)基于焦磷酸測序原理，對(duì)同聚物檢測的準(zhǔn)確性會(huì)受影響［22-23］。

基于其較長讀長的特點(diǎn)，主要應(yīng)用的領(lǐng)域?yàn)槲⑸锶郝涠鄻有苑治?、微生物基因組的de novo測序、宏基因組學(xué)研究、轉(zhuǎn)錄組測序，此外還可應(yīng)用于外顯子測序、病原菌檢測、目標(biāo)區(qū)域捕獲分析等研究。在遺傳標(biāo)記檢測方面，植物遺傳學(xué)家利用該平臺(tái)進(jìn)行了SNP相關(guān)研究［11］；法醫(yī)學(xué)者們則進(jìn)行了STR［12］、mtDNA［13］及法醫(yī)微生物學(xué)［10］等研究。由于測序讀長長，這一平臺(tái)是最早進(jìn)行STR遺傳標(biāo)記研究的測序儀。但由于市場運(yùn)營原因，454基因組測序儀將在2016年被逐步淘汰，Roche公司屆時(shí)將停止454儀器、零部件、試劑和耗材的相關(guān)服務(wù)和支持。

2.2Illumina測序儀

2007年，Illumina公司收購了Solexa，使得Genome Analyzer（GA）測序儀商品化。該測序儀擁有DNA簇（DNA cluster）、橋式 PCR（bridge PCR）、可逆阻斷（reversible terminator）等核心技術(shù)，具有高通量、低成本、低錯(cuò)誤率和短讀長等優(yōu)點(diǎn)，在基因組重測序中成為首選平臺(tái)。之后，Illumina又推出了GAⅡx、MiSeq 和HiSeq 2000合成測序儀，并針對(duì)法醫(yī)客戶發(fā)行了MiSeq FGx平臺(tái)（最大讀長可達(dá)300bp，預(yù)計(jì)2016年進(jìn)入市場）。所采用的原理為邊合成邊測序（sequencing by synthesis，SBS），在dNTP上連接熒光基團(tuán)和阻斷基團(tuán)，通過“去阻斷-延伸-激發(fā)熒光-切割熒光基團(tuán)-去阻斷”的循環(huán)方法進(jìn)行DNA序列信息的依次讀取，因此對(duì)單個(gè)堿基的讀取準(zhǔn)確性高。每次延伸反應(yīng)時(shí)，4種dNTP的濃度均勻，故可自然有效地避免摻入錯(cuò)誤［10］。目前，Illumina測序平臺(tái)已廣泛應(yīng)用于基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和表觀組學(xué)研究。不過，該平臺(tái)也存在一些缺陷，如隨著測序過程中熒光信號(hào)的減弱，靠后堿基的準(zhǔn)確性會(huì)受一定程度的影響，這也是影響該平臺(tái)測序讀長的主要因素。

法醫(yī)學(xué)者利用Illumina GAⅡx、MiSeq或HiSeq 2000平臺(tái)進(jìn)行了 STR遺傳標(biāo)記［14］和mtDNA的研究［15-16］，或?qū)蜻x基因［17］、外顯子［18］進(jìn)行測序以幫助死因診斷及法醫(yī)微生物學(xué)研究［10］等。這些研究均表明Illumina公司推出的SGS平臺(tái)對(duì)法醫(yī)學(xué)相關(guān)研究具有較大吸引力。

2.3Life Technologies測序儀

2007年，Life Technologies公司推出了其第一臺(tái)二代測序儀——SOLiD（Solid by Oligo Ligation Detection）［10］。該平臺(tái)采用寡聚物連接檢測測序，通過結(jié)合到經(jīng)乳液PCR（emulsion PCR，emPCR）擴(kuò)增的DNA簇上的通用引物與堿基單鏈探針之間的連接反應(yīng)進(jìn)行測序?；谶@一原理，目標(biāo)序列的所有堿基均被讀取了兩遍，因而SOLiD平臺(tái)最大的優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確性高。另外，由于該平臺(tái)不是基于PCR反應(yīng)進(jìn)行DNA合成與測序，對(duì)于高GC含量的樣本具有很大的技術(shù)優(yōu)勢。之后，又革命性地推出了不需圖像技術(shù)的離子流半導(dǎo)體芯片DNA測序技術(shù)——Ion Proton和Ion PGM平臺(tái)，其技術(shù)核心是半導(dǎo)體芯片上的離子流測序，類似焦磷酸測序，核苷酸依次流過半導(dǎo)體芯片，通過對(duì)DNA復(fù)制過程中產(chǎn)生的離子流進(jìn)行實(shí)時(shí)測定來反映DNA的延伸及性質(zhì)，每一步合成僅需數(shù)秒。半導(dǎo)體芯片采用大規(guī)模并行的半導(dǎo)體傳感器陣列，直接將DNA信息轉(zhuǎn)換成數(shù)字信息，實(shí)現(xiàn)了快速可擴(kuò)展的測序，無須修飾核酸，無須化學(xué)級(jí)聯(lián)酶促反應(yīng)，無須熒光和化學(xué)發(fā)光。不過，該系統(tǒng)對(duì)多聚物的檢測準(zhǔn)確性不及Illumina平臺(tái)［10］。

離子流半導(dǎo)體芯片平臺(tái)根據(jù)芯片種類的不同可以進(jìn)行數(shù)據(jù)量的自由拓展，以Ion PGM平臺(tái)為例，芯片種類分為314、316和318，產(chǎn)出數(shù)據(jù)量分別為100M、500M和1G。對(duì)于法醫(yī)學(xué)遺傳標(biāo)記的檢測而言，這一平臺(tái)通量合適，測序速度快，讀長可滿足需求。目前，研究人員就法醫(yī)學(xué)常用遺傳標(biāo)記 STR［19-21］、SNP［21-23］、mtDNA［21，24］和microRNA［25］展開了相關(guān)研究。

3　SGS技術(shù)在法醫(yī)遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀

SGS測序最為關(guān)鍵的一步是進(jìn)行測序文庫的構(gòu)建。制備DNA（或RNA）文庫的主要步驟包括：片段化/篩分指定長度的目標(biāo)序列；將目標(biāo)片段轉(zhuǎn)化成雙鏈DNA；在片段末端連上寡核苷酸接頭；對(duì)最終的文庫進(jìn)行定量［26］。DNA片段化主要是通過物理方法（如超聲破碎）、酶學(xué)方法（即非特異的核酸內(nèi)切酶處理）或化學(xué)反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)，最為經(jīng)典的是鳥槍法（Shot gun）。但鳥槍法無法用于法醫(yī)學(xué)遺傳標(biāo)記的文庫構(gòu)建，主要由于其對(duì)DNA量的要求（數(shù)克）對(duì)于大多數(shù)生物檢材而言很難達(dá)到；其次，該法是將DNA隨機(jī)處理成大小不同的片段，結(jié)果的重復(fù)會(huì)不盡相同；另外，對(duì)片段化DNA測序信息進(jìn)行數(shù)據(jù)整合分析，由于測序平臺(tái)及分析軟件的不同（測序深度不一樣，比對(duì)及組裝方法不同），導(dǎo)致最終得到的分析結(jié)果可能會(huì)不同，這對(duì)于法醫(yī)學(xué)樣本的結(jié)果解釋是很大的考驗(yàn)。

對(duì)于法醫(yī)學(xué)中涉及的DNA樣本而言，檢驗(yàn)的主要目的是進(jìn)行個(gè)人識(shí)別或者對(duì)親緣關(guān)系進(jìn)行刻畫，這并不需要全基因組信息，只需要DNA（RNA）水平遺傳標(biāo)記或mtDNA信息的檢測。隨著復(fù)合擴(kuò)增體系中各個(gè)組分的優(yōu)化，尤其是酶的優(yōu)化，目前可以依賴超多重PCR技術(shù)對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行文庫構(gòu)建，通過emPCR實(shí)現(xiàn)文庫放大，使SGS技術(shù)在外顯子測序、基因研究和遺傳標(biāo)記的檢測中廣泛應(yīng)用［26］。Life Technologies公司創(chuàng)新性地提出了AmpliSeq技術(shù)，可以對(duì)多達(dá)數(shù)千個(gè)目標(biāo)片段同時(shí)進(jìn)行文庫構(gòu)建，對(duì)DNA量的要求低；另一個(gè)片段文庫構(gòu)建技術(shù)由美國RainDance公司研發(fā)，主要是使用微滴PCR，這種方法可以顯著降低PCR擴(kuò)增中帶入的偏差［26］。

目前法醫(yī)學(xué)遺傳標(biāo)記的檢測主要依賴于成熟化的PCR-CE技術(shù)和相應(yīng)的試劑盒，檢測快速、分析簡單、成本低、質(zhì)控簡單、具有龐大的數(shù)據(jù)庫，可實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)共享，這些優(yōu)勢使得該技術(shù)將被繼續(xù)運(yùn)用相當(dāng)長的時(shí)間。但是，SGS技術(shù)及相應(yīng)平臺(tái)的進(jìn)一步成熟還是給法醫(yī)遺傳學(xué)帶來了巨大的沖擊，科研人員均圍繞這一技術(shù)展開了對(duì)各類遺傳標(biāo)記的相關(guān)研究，探討其應(yīng)用潛能及前景。

3.1SGS技術(shù)用于SNP檢測

SGS技術(shù)在法醫(yī)遺傳學(xué)中最初的研究圍繞SNP位點(diǎn)展開。Life Technologies公司在2014年正式發(fā)布了兩個(gè)基于Ion PGM平臺(tái)開發(fā)的SNP檢測試劑盒：（1）HID-Ion AmpliSeqTMSNP-124個(gè)人識(shí)別試劑盒，該試劑盒包含124個(gè)SNP位點(diǎn)（90個(gè)常染色體SNP和34個(gè)Y-SNP）。90個(gè)常染色體SNP中，有43個(gè)來自IISNP［27］，48個(gè)來自SNPforID［28］，兩者之間具有一個(gè)相同SNP位點(diǎn)。在該試劑盒正式推出市場之前，有兩個(gè)測試版本，由國際知名法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成評(píng)估測試，評(píng)估報(bào)告詳見文獻(xiàn)［22-23］。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)該試劑盒進(jìn)行了試用，發(fā)現(xiàn)高于0.5ng DNA進(jìn)行文庫構(gòu)建時(shí)即可獲得理想分型效果；6個(gè)SNP位點(diǎn)（rs7520386、rs4530059、rs214955、rs1523537、rs2342747和rs576261）檢測到雜合子不均衡現(xiàn)象，2個(gè) SNP位點(diǎn)（rs2342747和rs12997453）測序深度小于100；5個(gè)常染色體SNP位點(diǎn)在中國漢族人群中的MAF值小于0.1［29］。（2）HIDIon AmpliSeq SNP先祖推斷試劑盒。該試劑盒含有Seldin和Kidd研究中篩選出的大部分SNP位點(diǎn)［30-31］。Churchill等［21］在12個(gè)盲樣DNA檢測中使用以上兩個(gè)試劑盒進(jìn)行了個(gè)人信息及先祖信息的分析。這兩個(gè)檢測試劑盒均可擴(kuò)增120個(gè)以上SNP位點(diǎn)的文庫，檢測靈敏度與傳統(tǒng)PCR-CE（0.5～1 ng）相當(dāng)，準(zhǔn)確性高，對(duì)混合物分析具有優(yōu)勢（可以在1∶100混合樣本中檢測低含量組分）。另外，在SGS檢測過程中還可發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)側(cè)翼序列上的變異信息，從而提供更多的遺傳信息。

Illumina公司針對(duì)MiSeq平臺(tái)推出了ForenSeq DNA Signature Prep試劑盒測試版，該試劑盒包含63個(gè)STR基因座和95個(gè)用于個(gè)人識(shí)別的常染色體SNP位點(diǎn)（IISNP［27］和SNPforID［28］），并可以選擇性地加入56個(gè)先祖SNP和22個(gè)表型信息SNP（HIrisPlex［32］）。Churchill等［33］完成了測試評(píng)估，結(jié)果顯示1 ng DNA即可獲得完整的分型結(jié)果，在1∶19的混合物檢測中表現(xiàn)良好。之后，公司針對(duì)這一試劑盒進(jìn)行了相應(yīng)調(diào)整，希望在針對(duì)法醫(yī)客戶推出的MiSeq FGx平臺(tái)上進(jìn)行應(yīng)用，目前尚無正式試劑盒的推出及數(shù)據(jù)報(bào)道。

除商業(yè)化檢測試劑盒外，基于SGS檢測平臺(tái)對(duì)自行篩選的SNP位點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)研究也是熱點(diǎn)之一。Ralf等［34］采用AmpliSeq技術(shù)對(duì)432個(gè)Y染色體上最大單倍型SNP位點(diǎn)進(jìn)行了文庫構(gòu)建，并在Ion PGM平臺(tái)上完成了測序檢測，結(jié)果表明采用這一技術(shù)可以一次性完成數(shù)百個(gè)Y-SNP位點(diǎn)的并行測序，DNA最低檢測限為100 pg，且對(duì)降解檢材的分型效果優(yōu)于傳統(tǒng)PCR-CE技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)室結(jié)合SNP公共數(shù)據(jù)庫及已有研究文獻(xiàn)、工作基礎(chǔ)，篩選了279個(gè)在中國漢族人群中多態(tài)性好、通用性高且相互獨(dú)立的SNP位點(diǎn)，建立了相關(guān)的分型系統(tǒng)，并完成了在Ion PGM平臺(tái)的檢測評(píng)估，結(jié)果表明該系統(tǒng)靈敏度高、測序數(shù)據(jù)可靠，適用于個(gè)體身份信息的刻畫（數(shù)據(jù)待發(fā)表）。

3.2SGS技術(shù)用于STR測序

STR是法醫(yī)學(xué)中最為常用的一類遺傳標(biāo)記，目前國內(nèi)外相關(guān)的法醫(yī)學(xué)DNA數(shù)據(jù)庫主要圍繞STR基因座建立（主要是常染色體STR和Y-STR）。因此，若要將SGS技術(shù)推廣應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，就要求該平臺(tái)能成功地對(duì)STR進(jìn)行測序檢測，當(dāng)前必須攻克如下技術(shù)難點(diǎn)：一是測序讀長的限制，從第一臺(tái)SGS測序儀研發(fā)啟用開始，大多數(shù)SGS測序平臺(tái)的讀長對(duì)于STR重復(fù)結(jié)構(gòu)的測序而言都過短；二是STR重復(fù)結(jié)構(gòu)的這一特征使得序列信息的讀取及比對(duì)困難。可喜的是，隨著測序平臺(tái)技術(shù)的不斷進(jìn)步，目前平均測序讀長已經(jīng)可以滿足部分STR基因座測序片段的大小要求。

2012年，Bornman等［14］利用Illumina GAⅡx測序儀研究了DNA聯(lián)合索引系統(tǒng)（CODIS）13個(gè)STR基因座的序列多態(tài)性，顯示了SGS技術(shù)在STR檢測中的優(yōu)勢，在得到序列信息的同時(shí)大大豐富了等位基因信息，提供了更為全面的遺傳數(shù)據(jù)。目前，Illumina公司推出了SGS-STR檢測試劑盒，宣稱PCR-SGS技術(shù)可以代替PCR-CE。在MiSeq平臺(tái)上，除ForenSeq DNA Signature Prep試劑盒測試版［32］外，Promega公司還開發(fā)了一個(gè)含有23個(gè)STR基因座用于SGS檢測的試劑盒（PowerSeqTMAuto System［35］），初步的評(píng)估數(shù)據(jù)表明，62 pg DNA就可以得到完整的分型結(jié)果；在混合物比例為1∶19時(shí)，次要組分在部分STR基因座上可以得到分型結(jié)果，且在STR基因座側(cè)翼序列及重復(fù)結(jié)構(gòu)內(nèi)部發(fā)現(xiàn)的SNP多態(tài)性位點(diǎn)可以進(jìn)一步幫助解釋混合樣本的結(jié)果。

Ion PGM平臺(tái)第一個(gè)推出了從建庫到最后數(shù)據(jù)分析的完整解決方案［10］。Fordyce等［19］對(duì)HID STR 10-plex進(jìn)行了評(píng)估（含性別牙釉質(zhì)位點(diǎn)、CSF1PO、D16S539、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、TH01、TPOX和vWA），研究結(jié)果表明，低至50pg DNA就可以得到完整的分型結(jié)果；對(duì)于1∶20混合樣本的檢驗(yàn)結(jié)果理想，只是次要組分的分型需要手動(dòng)進(jìn)行；對(duì)于采用CE檢測不能得到完整分型的降解檢材，利用該平臺(tái)可以得到完整結(jié)果（文庫設(shè)計(jì)均在 170 bp之內(nèi)）。Churchill等［21］也采用該試劑盒對(duì)12個(gè)盲樣進(jìn)行了上述STR基因座的檢測，結(jié)果與PCR-CE檢測一致，但是在相同片段長度等位基因發(fā)現(xiàn)了多樣化的序列信息（長度一致的情況下存在序列上的不同），得到了比PCR-CE更豐富的信息。在這一結(jié)果的鼓舞之下，Life Technologies公司于2015年推出了一個(gè)含有24個(gè)STR基因座的試劑盒測試版，在原有基礎(chǔ)上增加了部分miniSTR［36］。

除商業(yè)化STR-SGS試劑盒的推出，借助SGS平臺(tái)進(jìn)行復(fù)雜STR基因座核心序列結(jié)構(gòu)的探討也是研究熱點(diǎn)之一。與PCR-CE的片段長度分析相比，SGS測序更多地揭示了序列的內(nèi)部變異情況，可以發(fā)現(xiàn)新的等位基因及更多的變異位點(diǎn)。Gelardi等［37］對(duì)D12S391基因座在197個(gè)丹麥人中的多態(tài)性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了53個(gè)等位基因，而采用PCR-CE檢測僅發(fā)現(xiàn)15個(gè)等位基因，這主要是由于含有相同片段長度的等位基因?qū)嶋H上具有不同的序列結(jié)構(gòu)信息，如等位基因21可檢測到8種不同的序列結(jié)構(gòu)，在這一研究中還發(fā)現(xiàn)采用PCR-CE進(jìn)行分型得到的純合子中有30%存在序列結(jié)構(gòu)上的不同，這一結(jié)果也從側(cè)面反映了采用SGS平臺(tái)進(jìn)行STR基因座研究的優(yōu)勢。其次，SGS測序?qū)TR基因座的檢測可以簡化混合樣本的結(jié)果分析，如混合樣本中不同身源者的等位基因即使具有相同的片段長度但是序列結(jié)構(gòu)卻可能是不同的。本實(shí)驗(yàn)室目前的研究結(jié)果表明，在低至1∶100的混合比例中，次要組分的STR基因型可以通過SGS測序獲得，而采用傳統(tǒng)的PCR-CE技術(shù)無法實(shí)現(xiàn)（結(jié)果待發(fā)表）。

3.3SGS技術(shù)用于線粒體全基因組測序

人類mtDNA位于細(xì)胞質(zhì)中，是一套獨(dú)立于核染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙鏈閉合環(huán)狀分子，全長16569bp，可分為編碼區(qū)和控制區(qū)。其中編碼區(qū)較為保守，因而大多數(shù)研究均圍繞線粒體高變區(qū)展開。mtDNA由于拷貝數(shù)多、母系遺傳等特點(diǎn)在法醫(yī)遺傳學(xué)中常用于補(bǔ)充檢驗(yàn)，而有些情況下卻是唯一可以檢驗(yàn)的遺傳標(biāo)記［1，3，13，15-16，21，24］。 相對(duì)于傳統(tǒng)Sanger測序技術(shù)，采用SGS技術(shù)對(duì)mtDNA全序列進(jìn)行快速便捷的檢測對(duì)法醫(yī)學(xué)應(yīng)用具有巨大的吸引力。人類mtDNA具有異質(zhì)性，即使是同一個(gè)體，其不同組織來源細(xì)胞中的mtDNA亦可能有較大差異，且mtDNA易受到污染，這些因素均會(huì)導(dǎo)致測序結(jié)果的解釋變得困難。而SGS測序則會(huì)給出每一個(gè)位點(diǎn)上主要堿基與次要堿基的reads數(shù)，能夠提供除高變區(qū)外的單倍體類型，獲得更為全面的mtDNA單倍群信息，同時(shí)還能夠?qū)M織特異性進(jìn)行檢測［13，15-16，21，24］。

深市港股通方面，前十大活躍標(biāo)的分別為騰訊控股、招商銀行、融創(chuàng)中國、東陽光藥、中興通訊、農(nóng)業(yè)銀行、吉利汽車、豐盛控股、石藥集團(tuán)和建設(shè)銀行。

mtDNA全基因組測序研究中，文庫的有效構(gòu)建是難點(diǎn)之一。針對(duì)條件理想的mtDNA，可以采用二段或者三段PCR進(jìn)行長PCR擴(kuò)增，在得到長PCR擴(kuò)增子后，可以使用酶切試劑盒或物理手段進(jìn)行片段化處理。Life Technologies公司推出的SequalPrepTMLong PCR Kit with dNTPs試劑盒可專門用于這一類PCR的擴(kuò)增。但是，由于法醫(yī)學(xué)檢材大部分為降解檢材，為提高其檢出率，文庫構(gòu)建的策略應(yīng)盡量采用較小的PCR擴(kuò)增片段，并且為避免擴(kuò)增片段間的相互干擾，還應(yīng)該減少不必要的擴(kuò)增子數(shù)目。另外，對(duì)于mtDNA而言，因其序列中包含較多變異位點(diǎn)，且存在與核染色體高度同源的序列，使得針對(duì)mtDNA測序小片段引物的設(shè)計(jì)有一定難度。目前，Life Technologies公司在Ion PGM平臺(tái)上推出了一個(gè)針對(duì)mtDNA全基因組測序的測試版HID-Ion AmpliSeqTMMitochondrial Tiling Path Panel。在這個(gè)Panel中，共分成兩個(gè)Pool 對(duì)mtDNA進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)Pool中含有81對(duì)引物。

3.4SGS技術(shù)用于RNA檢測

RNA在法醫(yī)學(xué)上可用于體液（斑）或者組織類型的鑒定。研究主要圍繞信使RNA（message RNA，mRNA）和微小核糖核酸（microRNA，miRNA）進(jìn)行。mRNA的研究開展較早，目前已有部分推薦位點(diǎn)供選擇。Zubakov等［20］率先利用Ion PGM平臺(tái)對(duì)DNA和RNA標(biāo)記同時(shí)進(jìn)行研究，共涉及12個(gè)成熟mRNA標(biāo)志，用于6種常見組織類型的鑒定，對(duì)降解檢材的分析能力優(yōu)越，但是RNA建庫與DNA建庫需要分開進(jìn)行。近幾年，miRNA作為一類長度在18～25個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，其表達(dá)具有高保守性、時(shí)序性和組織特異性［25］，相比mRNA更適合進(jìn)行體液（斑）的鑒定。之前常用的研究方法為實(shí)時(shí)定量PCR和生物芯片技術(shù)等，但僅局限于獲取已知序列信息的miRNA，而SGS平臺(tái)可以一次性獲得數(shù)百萬條miRNA序列信息，能夠快速鑒定出不同組織、不同發(fā)育階段甚至不同疾病狀態(tài)下miRNA及其表達(dá)差異，給法醫(yī)學(xué)和遺傳醫(yī)學(xué)等提供了有力的解決工具。Wang等［25］基于Ion PGM平臺(tái)，針對(duì)血液和唾液樣本miRNA檢測，給出了一套成熟的檢測流程。

3.5SGS技術(shù)對(duì)多種遺傳標(biāo)記的聯(lián)合檢測

對(duì)多種遺傳標(biāo)記進(jìn)行聯(lián)合檢測是SGS技術(shù)的優(yōu)勢之一。目前Illumina公司已經(jīng)針對(duì)常見遺傳標(biāo)記（SNP 和STR）進(jìn)行了整合試劑盒的開發(fā)及測試（ForenSeq DNA Signature Prep）。然而，將核DNA水平的遺傳標(biāo)記與mtDNA或RNA遺傳標(biāo)記整合在一個(gè)panel中尚不可行，主要是由于拷貝數(shù)差異過大。針對(duì)不同的檢測目標(biāo)區(qū)域選用不同的建庫手段，然后將文庫混合進(jìn)行后續(xù)檢測則可以實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。Zubakov等［20］采用AmpliSeq技術(shù)對(duì)9個(gè)常染色體STR基因座和12個(gè)mRNA標(biāo)記分別構(gòu)建文庫，單獨(dú)進(jìn)行測序和在同一張芯片進(jìn)行測序的結(jié)果相一致。其次，將這些不同水平的遺傳標(biāo)記整合在一起，在實(shí)際案件工作中是否具有可行性及必要性，目前尚無定論［10］，主要原因在于大部分案件其實(shí)并不需要mtDNA或RNA水平信息，而整合后這兩類遺傳標(biāo)記在測序panel中必將占用一定的測序空間，使得每次測序反應(yīng)中所能容納的樣本數(shù)減少，導(dǎo)致檢測成本相對(duì)增加。先祖信息SNP或表型特征SNP是否納入也面臨同樣的處境。因此，針對(duì)不同的案件類型，靈活地選擇位點(diǎn)定制Panel，即在必須檢測的遺傳標(biāo)記基礎(chǔ)上自由選擇加入其他種類的遺傳標(biāo)記，這種方式或許更具實(shí)際意義。

3.6SGS技術(shù)在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的拓展研究

法醫(yī)微生物學(xué)作為法醫(yī)學(xué)中的新興學(xué)科，在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域受到越來越多科研人員的關(guān)注［10，38-41］。Brenig等［38］對(duì)生物痕跡進(jìn)行深度測序和宏基因組分析，證實(shí)該方法可以用于生物痕跡中微生物成分的檢驗(yàn)；Tridico等［39］對(duì)人類頭發(fā)中的微生物菌群進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)該方法可以為部分性侵類案件（未發(fā)現(xiàn)任何有價(jià)值的生物檢材）的偵破提供參考信息；Franzosa等［40］的研究則表明可以利用宏基因組編碼進(jìn)行人體微生物的識(shí)別。另外，對(duì)犯罪現(xiàn)場土壤中微生物的鑒定也有了新的研究進(jìn)展［10］。在生物反恐方面，Broomall等［41］利用SGS平臺(tái)對(duì)經(jīng)γ射線處理后的信件進(jìn)行微生物測序，獲得有效數(shù)據(jù)。

4　SGS數(shù)據(jù)分析及軟件開發(fā)需求

SGS技術(shù)對(duì)法醫(yī)學(xué)未來的發(fā)展起著至關(guān)重要的作用，相應(yīng)平臺(tái)及配套試劑的開發(fā)也帶動(dòng)了科研人員新一輪的研究熱潮。然而，如何科學(xué)地利用這些數(shù)據(jù)，如何合理地解釋這些數(shù)據(jù)以及如何形成一套有公信力的數(shù)據(jù)采信標(biāo)準(zhǔn)是面臨的最大難題。

對(duì)獲取的SGS原始數(shù)據(jù)而言，將文庫（35～400bp）序列信息進(jìn)行精確的比對(duì)和組裝是難點(diǎn)之一。法醫(yī)學(xué)研究大多選擇人類參考基因組，但需要注意的是，隨著時(shí)間的推移，數(shù)據(jù)庫信息會(huì)時(shí)常更新，比如人類基因組信息現(xiàn)在就有多個(gè)版本：2003年6月的NCBI34/hg16，2004年5月的 NCBI35/hg17，2006年3月的NCBI36/hg18，2009年2月的GRCh37/hg19以及2013年12月的GRCh38/hg38?，F(xiàn)在最為常見的是GRChg38及GRChg19。所以，將原始序列文件比對(duì)到哪個(gè)版本的基因組是事先必須明確的，常用的工具有Bowtie/Bowtie2、BWA、SOAP1/SOAP2等。此外，需要注意所獲得的序列信息是源于基因組測序（DNA-Seq）還是轉(zhuǎn)錄組測序（mRNA-Seq）。對(duì)于真核生物而言，mRNA序列與DNA序列并不完全相同，在經(jīng)歷后剪切之后，成熟的mRNA可能是原基因的一部分，順序及個(gè)別堿基會(huì)產(chǎn)生變化。如果是mRNA測序，比對(duì)工作就會(huì)在DNA測序比對(duì)的基礎(chǔ)上再多一步，需比對(duì)到轉(zhuǎn)錄組上去［25-26］。所以比較流行的做法是使用Bowtie進(jìn)行DNA測序信息比對(duì)，使用TopHat進(jìn)行RNA測序信息比對(duì)。目前的測序平臺(tái)都相對(duì)成熟，可以借助服務(wù)器自帶插件進(jìn)行序列信息的初步比對(duì)及組裝，獲取BAM/SAM文件［19-25］。

其次，如何對(duì)已獲得的BAM/SAM文件進(jìn)一步分析，形成可以供法醫(yī)學(xué)實(shí)際使用的數(shù)據(jù)是目前SGS數(shù)據(jù)分析的最大難點(diǎn)。Life Technologies和Illumina公司針對(duì)其推出的相關(guān)遺傳標(biāo)記檢測試劑盒匹配了相應(yīng)的分析工具。本實(shí)驗(yàn)室嘗試用這些工具進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)主要存在以下幾個(gè)缺陷：（1）分析軟件均針對(duì)已開發(fā)試劑盒，參數(shù)的設(shè)置相對(duì)固定，但是由于前期文庫構(gòu)建過程無法全自動(dòng)化，人員操作及實(shí)驗(yàn)室條件等差異均會(huì)造成不同實(shí)驗(yàn)室即使采用同一DNA樣本也無法得到一致的測序結(jié)果（主要表現(xiàn)在文庫構(gòu)建質(zhì)量、SGS有效數(shù)據(jù)量、位點(diǎn)覆蓋度、樣本間檢測的均一性等）。其中Life Technologies公司推出的插件無法對(duì)STR和SNP同時(shí)進(jìn)行分析且不能對(duì)樣本進(jìn)行選擇性分析；Illumina公司推出的工具可以對(duì)兩者同時(shí)完成分析，但是設(shè)置了相同的標(biāo)準(zhǔn)，修改參數(shù)空間不大，限制了數(shù)據(jù)分析功能。（2）對(duì)混合樣本進(jìn)行分析時(shí)，次要組分的測序信息與stutter峰（STR基因座檢測中出現(xiàn)）及噪音的測序信息無法進(jìn)行有效區(qū)分。（3）遺傳標(biāo)記側(cè)翼序列若存在變異位點(diǎn)，分析系統(tǒng)不能自動(dòng)給出提示。（4）對(duì)實(shí)驗(yàn)質(zhì)控的信息無法很好地體現(xiàn)。（5）對(duì)測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制不全面。（6）呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)格式過于復(fù)雜，不利于法醫(yī)學(xué)實(shí)際應(yīng)用。

2014年，Van Neste等［43］針對(duì)Illumina MiSeq平臺(tái)開發(fā)了一套生物信息算法，稱為My-Forensic-Lociqueries（MyFLq），用于對(duì)原始SGS數(shù)據(jù)進(jìn)行STR和SNP的分析；2015年，Warshauer等［44］針對(duì)Ion PGM平臺(tái)更新了其基于Linux操作系統(tǒng)開發(fā)的STRait Razor軟件，目前該軟件可以用于86個(gè)STR基因座的分析。因而，開發(fā)出一套可以快速、便捷、準(zhǔn)確地進(jìn)行SGS數(shù)據(jù)分析的工具是該技術(shù)能夠被法醫(yī)學(xué)工作者快速接受的前提之一。對(duì)于最常用遺傳標(biāo)記STR基因座而言，由于同一長度等位基因內(nèi)部序列結(jié)構(gòu)有異導(dǎo)致新等位基因的大量檢出，使得原有針對(duì)STR片段長度的命名方式已不能滿足實(shí)際需求。國際法醫(yī)遺傳學(xué)學(xué)會(huì)（ISFG）專門就SGS-STR測序信息的通用命名原則組織了相關(guān)的工作小組。目前SGS-STR測序研究中普遍參考的是Gelardi等［37］的命名原則。但這一命名原則僅能滿足具有簡單重復(fù)結(jié)構(gòu)的STR基因座。另外，對(duì)于SGS-STR測序數(shù)據(jù)分析，應(yīng)該讓用戶可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果自定義基因型分析需要的最小覆蓋度、可以接受的stutter范圍及背景噪音和合理的等位基因均衡度。

由于STR基因座是法醫(yī)學(xué)最常用的遺傳標(biāo)記，且現(xiàn)有法醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫均圍繞該遺傳標(biāo)記建立，并且在未來的很長時(shí)間內(nèi)將持續(xù)豐富及更新，如何將SGSSTR基因座數(shù)據(jù)信息與CE-STR基因座信息相對(duì)接，是這一技術(shù)應(yīng)用的最大難題。第26屆ISFG會(huì)議提出了以下幾個(gè)主要觀點(diǎn)：（1）SGS測序分析的軟件需要可以將測序STR基因座核心區(qū)域及側(cè)翼序列的FASTA信息導(dǎo)出并形成數(shù)據(jù)庫，從而獲取新等位基因的頻率信息；（2）目前對(duì)CE-STR命名時(shí)參考的基因組信息均為GRChg19，千人基因組計(jì)劃提供的變異位點(diǎn)信息也均參考GRChg19，是否需要將所有命名全部按照最新參考序列GRCh38進(jìn)行命名，以及如何將這部分信息與最新的人類基因座版本相統(tǒng)一是關(guān)鍵之一；（3）CE-STR命名時(shí)部分STR基因座參考的是反向序列信息，在目前對(duì)STR基因座進(jìn)行序列深度測序的情況下，建議全部采用正向參考序列；但是若按照ISFG之前的命名原則，以序列中最先開始的基序（motif）進(jìn)行命名，那么在這個(gè)過程中必然會(huì)遇到基序與之前不一致的情況，如何解決這一問題，需要有明確方案；（4）如果全部采用正向，那么之前采用反向序列命名的STR基因座核心序列的起始和終止位置會(huì)發(fā)生改變，需要對(duì)這部分信息給予更新；（5）關(guān)于具有復(fù)雜序列結(jié)構(gòu)的STR基因座是否需要納入SGS-STR檢測，以及如何對(duì)這部分等位基因進(jìn)行命名，值得商榷。目前推薦的一種命名方式，以D13S317基因座的等位基因12為例，命名如下：D13S317［12］-Chr13-GRCh38 82148025-82148068［TATC］12 82148001-A；82148069-T。這一命名方式中的次序?yàn)椋夯蜃Q、等位基因大小、染色體位置、參考基因組版本號(hào)、核心序列起始和終止位置、重復(fù)結(jié)構(gòu)及次數(shù)、側(cè)翼序列的變異信息。這一命名方式要求對(duì)STR基因座的側(cè)翼序列信息也進(jìn)行解讀（目前常見的做法是對(duì)上下游側(cè)翼序列15bp進(jìn)行解讀）［45］。

軟件還應(yīng)該具備混合樣本分析模塊，SGS技術(shù)的優(yōu)勢之一就是可以為法醫(yī)學(xué)常見混合檢材提供更全面、更豐富的遺傳信息。同時(shí)，還應(yīng)配備mtDNA分析、Y染色體單倍型分析、X染色體遺傳標(biāo)記分析、組織來源分析及表型分析等模塊［43-45］。

5　SGS技術(shù)在法醫(yī)學(xué)的應(yīng)用展望

SGS技術(shù)的應(yīng)用使法醫(yī)遺傳學(xué)進(jìn)入了一個(gè)新的發(fā)展階段，與傳統(tǒng)的PCR-CE技術(shù)相比，可以同時(shí)進(jìn)行數(shù)百甚至數(shù)千個(gè)遺傳標(biāo)記的檢測；與Barcode技術(shù)相結(jié)合，可以對(duì)多個(gè)樣本并行檢測；不借助熒光標(biāo)記系統(tǒng)，可以將文庫構(gòu)建片段設(shè)計(jì)得極短，對(duì)降解檢材的分析能力大大提高；序列等位基因的大量檢出，使得系統(tǒng)效能大大增加；對(duì)序列內(nèi)部堿基的深度讀取，使得混合樣本分析能力大幅提高。基于這些優(yōu)勢，我們有理由相信這一技術(shù)將能在各個(gè)法醫(yī)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室得以應(yīng)用。但是，SGS測序平臺(tái)及相關(guān)試劑的成本、相關(guān)技術(shù)產(chǎn)品的推出及驗(yàn)證、分析軟件的成熟化、與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫的對(duì)接等都是決定該技術(shù)能否替代（或補(bǔ)充）成熟PCR-CE技術(shù)以及普遍應(yīng)用于案件檢測的關(guān)鍵。同時(shí)，如何看待大數(shù)據(jù)測序中可能出現(xiàn)的倫理問題也是法醫(yī)學(xué)者應(yīng)用這一技術(shù)需要考慮的問題。

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（本文編輯：李莉）

Review of Second Generation Sequencing and Its Application in Forensic Genetics

ZHANG Su-hua，BIAN Ying-nan，ZHAO Qi，LI Cheng-tao
（Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine，Shanghai Forensic Service Platform，Institute of Forensic Science，Ministry of Justice，P.R.China，Shanghai 200063，China）

The rapid development of second generation sequencing（SGS）within the past few years has led to the increasement of data throughput and read length while at the same time brought down substantially the sequencing cost.This made new breakthrough in the area of biology and ushered the forensic genetics into a new era.Based on the history of sequencing application in forensic genetics，this paper reviews the importance of sequencing technologies for genetic marker detection.The application status and potential of SGS in forensic genetics are discussed based on the already explored SGS platforms of Roche，Illumina and Life Technologies.With these platforms，DNA markers（SNP，STR），RNA markers（mRNA，microRNA）and whole mtDNA can be sequenced.However，development and validation of application kits，maturation of analysis software，connection to the existing databases and the possible ethical issues occurred with big data will be the key factors that determine whether this technology can substitute or supplement PCR-CE，the mature technology，and be widely used for cases detection.

forensic genetics；second generation sequencing；review［publication type］；genetic markers

·教育與管理·

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2016.04.012

1004-5619（2016）04-0282-08

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81302620）；中央級(jí)科研院所公益專項(xiàng)（GY2014G-4）；上海市標(biāo)準(zhǔn)研制項(xiàng)目（14DZ 0502500）；上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)資助項(xiàng)目（16DZ 2290900）

張素華（1985—），女，助理研究員，主要從事法醫(yī)遺傳學(xué)研究；E-mail：zsh-daisy@163.com

李成濤，男，研究員，博士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)遺傳學(xué)研究；E-mail：lichengtaohla@163.com

2016-02-24）