沙才華，汪文輝，黃海超，廖秀云，楊　素（珠海出入境檢驗檢疫局，廣東珠?！?19000）

Taqman熒光PCR法檢測肉制品中牛源性成分及定量研究

沙才華，汪文輝，黃海超，廖秀云，楊素
（珠海出入境檢驗檢疫局，廣東珠海519000）

本研究通過以牛線粒體保守基因序列設(shè)計的特異性引物和探針，建立了肉制品中牛源性成分Taqman熒光PCR檢測方法，并對方法的特異性、靈敏度和穩(wěn)定性進行了評價；通過模擬濃度標準曲線，完成了對牛源性成分的相對定量檢測。結(jié)果顯示，本方法具有特異性強、靈敏度高（檢出限為0.001%）的特點，適用于肉制品中牛源性成分及含量的快速檢測。

牛源性成分；線粒體；Taqman熒光 PCR

近年來，“假牛肉事件”屢屢曝光，牛肉制品中造假摻雜幾乎成為公開的秘密。這些不法行為不僅擾亂了正常的市場秩序，而且造成了食品安全隱患，其影響不容忽視。因此，建立一種對肉制品中牛源性成分進行快速鑒定和定量分析的準確檢測方法具有非常重要的意義。

Taqman熒光 PCR技術(shù)應(yīng)用于食品中肉類種源鑒別，這在保證鑒別準確性前提下，使定量檢測成為可能。由于Taqman熒光PCR擴增的目的片段較短，所以尤其適用于加工食品的檢測。根據(jù)被釋放的熒光基團數(shù)目與PCR產(chǎn)物數(shù)量的一對一關(guān)系，直接探測PCR過程中熒光信號的變化，以獲得定量結(jié)果，進而利用該技術(shù)對模板進行準確定量[1]。本研究選定高保守的牛線粒體基因作為靶基因，設(shè)計特異引物及探針，旨在建立快速、簡便、靈敏、特異的牛源性成分熒光PCR檢測方法，從而實現(xiàn)對肉制品中牛源性成分的鑒定和定量，為打擊牛肉制品造假摻雜行為提供技術(shù)支撐。

1　材料和方法

1.1樣品

黃牛肉、水牛肉、牦牛肉、羚羊肉、山羊肉、綿羊肉、馬肉、驢肉、雙峰駝肉、馴鹿肉、豬肉、貓肉、狗肉、雞肉、鴨肉為本實驗室留存樣品。以上樣品均已使用本實驗室脊椎動物通用引物（經(jīng)過CNAS認可）對PCR產(chǎn)物進行了測序，確定了其種屬。

1.2主要試劑

DNA提取試劑盒E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit，美國OMEGA公司產(chǎn)品；Premix Ex Taq qPCR Mastermix，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.3主要儀器

7500 FAST熒光定量PCR儀，美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品；Sigma 3-18 K高速冰凍臺式離心機，德國Sartorius公司產(chǎn)品；NanoDrop ND-1000紫 外 分 光 光 度 計， 美 國 NanoDrop Technologies 公司產(chǎn)品。

1.4方法

1.4.1PCR引物、探針的設(shè)計與合成。檢索GenBank中公布的大量不同種屬的牛（包括黃牛、水牛、牦牛）DNA序列，最終選用牛線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）上的特異性序列作為設(shè)計引物與探針的序列。利用生物學(xué)軟件DNAMAN將其比對后，在高度保守區(qū)域用Oligo7.0設(shè)計一組牛特異性PCR引物和探針，由大連寶生物科技有限公司合成。引物、探針序列見表1。

表1　牛引物、探針序列

1.4.2樣品的DNA提取。按照DNA提取試劑盒說明書提取樣品DNA，利用Nanodrop 1 000微量紫外分光光度計測定樣品DNA濃度和純度。按照所測濃度，將樣品DNA 含量稀釋至100 ng/μL左右，存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×Taq PCR Master mix 12.5 μL、10 μmol/L上下游引物各2 μL、10 μmol/L探針1 μL、DNA模版2.0 μL，補水至25 μL。反應(yīng)程序：95℃4 min；95℃15 s，50℃1 mins，40個循環(huán)。FAM熒光通道搜集信號，在每個循環(huán)的退火階段收集熒光信號。結(jié)果判定：Ct值小于35，且曲線有明顯的對數(shù)增長，判為陽性；Ct值大于35，判為陰性。

1.4.4熒光PCR方法特異性試驗。以黃牛肉、水牛肉、牦牛肉等3份牛源性樣品和羚羊肉、山羊肉、綿羊肉、馬肉、驢肉、雙峰駝肉、馴鹿肉、豬肉、貓肉、狗肉、雞肉、鴨肉等12份非牛源動物樣品提取的DNA為模板，進行熒光PCR擴增，驗證所建立的熒光PCR方法的特異性。

1.4.5熒光PCR方法靈敏度和穩(wěn)定性試驗。以新鮮牛肉去脂肪后切片，經(jīng)烘箱60 ℃ 72小時烘干，然后研磨成牛肉粉，稱取30 mg牛肉粉按照1.4.2所述方法提取牛DNA模板，用滅菌雙蒸水10倍比稀釋至10-9，每個梯度的樣品取5個平行進行熒光PCR擴增，計算各稀釋度樣品Ct平均值（）和相對標準偏差（RSD）評價該方法靈敏度及穩(wěn)定性。

1.4.6模擬混合樣熒光PCR方法靈敏度和穩(wěn)定性試驗。使用1.4.5制備的純牛肉粉和純魚粉按10倍比稀釋混合至10-9，稱取30 mg混合粉提取DNA模板，每個梯度的樣品取5個平行進行熒光PCR擴增，計算各稀釋度樣品Ct平均值和相對標準偏差（RSD）評價該方法靈敏度及穩(wěn)定性。

1.4.7標準曲線的建立及模擬混合樣品中牛源性成分定量檢測。使用1.4.5制備的純牛肉粉和純魚粉按不同比例混合，制成牛源性成分含量分別為100%、50%、25%、10%、5%及1%（m/m）的系列濃度標準樣本，標準樣品取5個平行。同時模擬加工混合肉樣的檢測，對牛肉粉含量分別為2%、4%、8%、20%、40%和80%的混合樣品進行定量體系檢測，每個樣品取2個平行。每份樣品稱取30 mg混合粉提取DNA模板，進行熒光PCR擴增，通過ABI熒光PCR儀軟件設(shè)定標準對照，反應(yīng)結(jié)束后，直接點擊“analysis”進行分析，軟件自動給出標準曲線（包括線性關(guān)系、斜率、擴增效率等）及各樣品計算濃度。也可以每個濃度的值為橫坐標，log2（濃度）的絕對值為縱坐標繪制散點圖，生成標準曲線，推導(dǎo)公式并計算各模擬加工混合肉樣含量。

1.4.8市售商品的檢測。應(yīng)用本方法和國標

GB/T 20190—2006（普通PCR）中的方法，同時對收集的10份標稱為牛肉制品的商品開展牛源性成分檢測。

2　結(jié)果與分析

2.1牛源性成分熒光PCR方法特異性試驗

上述16種不同物種的檢測結(jié)果顯示：僅黃牛肉、水牛肉和牦牛肉有典型的“S”型擴增曲線且Ct值小于35，而其他樣品及空白對照均未有擴增曲線或Ct值大于35，具體結(jié)果見圖1。

圖1　牛源性成分熒光PCR方法特異性試驗

2.2牛源性成分熒光PCR靈敏度試驗和穩(wěn)定性試驗

對稀釋度為100～10-9樣品進行熒光PCR試驗，結(jié)果顯示：樣品在稀釋度在100～10-6稀釋度時，Ct值均小于35，且曲線有明顯的對數(shù)增長，擴增結(jié)果具有良好的重復(fù)性，其相對標準偏差RSD＜3.5%，當樣品在稀釋度10-7仍有擴增曲線，但樣品Ct值大于35，且相對標準偏差RSD＞3.5%。因此本方法建立的熒光PCR方法靈敏度高達10-6（即0.000 1%，對應(yīng)的為33.94），也與理論推導(dǎo)出來Ct值吻合。最低檢測到的牛肉DNA含量為0.2 pg。本方法的靈敏度和穩(wěn)定性試驗見圖2，相關(guān)數(shù)據(jù)見表2。以稀釋度對值作圖，其線性關(guān)系如圖3所示。線性相關(guān)系數(shù)R2 = 0.999 6，線性范圍為10-6～100（即0.000 1%～100%）。

2.3模擬混合樣熒光PCR方法靈敏度和穩(wěn)定性試驗

對稀釋度為100～10-9樣品進行熒光PCR試驗，結(jié)果顯示：樣品在稀釋度在100～10-5稀釋度時，Ct值均小于35，且曲線有明顯的對數(shù)增長，擴增結(jié)果具有良好的重現(xiàn)性，其相對標準偏差RSD＜3.5%。當樣品在稀釋度10-6時，樣品Ct值大于35，因此本方法建立的熒光PCR方法靈敏度高達10-5（即0.001%，對應(yīng)的為32.39）。本方法的靈敏度和穩(wěn)定性試驗見圖4，相關(guān)數(shù)據(jù)見表3。以稀釋度對值作圖，其線性關(guān)系如圖5所示。線性相關(guān)系數(shù)R2 = 0.991 4，線性范圍為10-5～100（即0.001%～100%）。

表2　牛源性成分熒光PCR 反應(yīng)的靈敏度和穩(wěn)定性試驗數(shù)據(jù)

圖2　牛源性成分熒光PCR方法靈敏度和穩(wěn)定性試驗

圖3　牛源性成分熒光PCR方法線性關(guān)系

圖4　模擬混合樣牛源性成分熒光PCR方法靈敏度和穩(wěn)定性試驗

表3　模擬混合樣牛源性成分熒光PCR 反應(yīng)的靈敏度和穩(wěn)定性試驗數(shù)據(jù)

圖5　模擬混合樣牛源性成分熒光PCR方法線性關(guān)系

2.4標準曲線的建立及模擬混合樣品中牛源性成分定量檢測

應(yīng)用PCR儀自帶軟件分析顯示：線性相關(guān)系數(shù)R2= 0.986，線性范圍為1%～100%。對牛肉粉含量分別為2%、4%、8%、20%、40%和80%的混合樣品進行定量體系檢測所得牛肉粉含量平均值分別為2.8%、4.2%、9.1%、21.1%、46.0%和79.7%（圖6）。以值為橫坐標，以log2（濃度）的絕對值為縱坐標繪制散點圖，制備標準曲線，并推導(dǎo)出牛源性成分的含量。公式中的y為牛源性成分含量，x為檢測的Ct值。應(yīng)用公式計算出牛肉粉含量分別為2.9%、4.2%、9.2%、21.0%、45.4%和78.1%，線性相關(guān)系數(shù)R2= 0.989，線性范圍為1%～100%，其線性關(guān)系如圖7所示。兩種方法的定量結(jié)果均與實際結(jié)果相近，相關(guān)數(shù)據(jù)及定量結(jié)果見表4。

圖6　標準曲線及模擬混合樣品中牛源性成分定量檢測

表4　牛源性成分熒光PCR定量結(jié)果

2.5市售商品的檢測

對10份標稱為牛肉的制品同時應(yīng)用本方法和國標GB/T 20190—2006（普通PCR）進行牛源性成分檢測。兩種方法的定性檢測結(jié)果完全吻合，其中6份樣品檢出牛源性成分，另4份樣品未檢出牛源性成分。應(yīng)用本方法進行定量分析，6份檢出牛源性成分的樣品，其中有5份樣品牛肉含量約100%，另1份樣品含量約為40%。而普通PCR方法凝膠電泳條帶亮度和清晰度基本一致，無法區(qū)分樣品牛源性成分含量。熒光定量PCR檢測結(jié)果見圖8，普通PCR檢測結(jié)果見圖9。

圖7　牛源性成分熒光定量PCR標準曲線線性關(guān)系

圖8　市售商品熒光定量PCR檢測

圖9　市商樣品普通PCR檢測

3　討論

動物產(chǎn)品的質(zhì)量安全涉及畜牧業(yè)健康發(fā)展、公共衛(wèi)生、宗教信仰、進出口貿(mào)易等諸多領(lǐng)域。傳統(tǒng)的感官檢驗和免疫學(xué)方法僅能鑒別生鮮肉的種屬。肉制品經(jīng)加工后，因其感官性狀、蛋白質(zhì)成分和其他免疫原性物質(zhì)被破壞而難以鑒別。DNA比蛋白質(zhì)的耐熱性強，高溫處理過的食品中仍能提取出DNA。有資料表明，肉制品經(jīng)過加工后，即使溫度達到141℃，也有足夠的DNA可通過實時熒光PCR技術(shù)檢測到，所以對于經(jīng)過加工的食物仍具有較強的鑒別能力[2-3]。本次建立的熒光PCR方法擴增曲線具有典型的“S”型，特異性強，穩(wěn)定性較好，混合肉粉中牛源性成分的熒光PCR方法最低檢出限為10-5（即0.001%），高于國標法最低檢出限（0.1%）100倍。這與相關(guān)報道一致，說明所設(shè)計的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件較好[4-6]。

本研究主要針對國內(nèi)消費量較高且價格昂貴的牛肉作為研究對象，通過設(shè)計特異引物和探針，建立定性及相對定量檢測體系，將構(gòu)建標準曲線的Ct值分別代入公式，得出樣品中牛肉含量，以達到甄別惡意造假和摻假的目的[7]。構(gòu)建標準曲線和日常檢測樣品的所用方法和實驗條件必須完全相同。標準曲線建立后可供多次使用，更改DNA提取方法、更換熒光PCR反應(yīng)試劑，更新熒光PCR儀或儀器關(guān)鍵配件，必須重新制作標準曲線。也可通過PCR儀自帶軟件設(shè)定標準曲線參數(shù)分析各樣品計算濃度。在線性范圍1%～100%內(nèi)對6個不同濃度的模擬樣品進行定量檢測，兩種分析方法的定量結(jié)果均與實際結(jié)果相近，證實該定量體系可以用來檢測牛肉粉的含量。

應(yīng)用Taqman熒光PCR檢測方法對抽檢的10份標稱牛肉的制品進行牛源性成分定量檢測，發(fā)現(xiàn)5份有摻假造假現(xiàn)象。經(jīng)使用本實驗室脊椎動物通用引物進行擴增，并對PCR產(chǎn)物測序，確定其種屬，其中4份含有豬源性成分，1份含有鴨源性成分，說明市場上確實存在以低價肉類加工而成的假牛肉。

本研究建立的牛源性成分Taqman熒光 PCR檢測方法特異性強、靈敏度高，可以快速、準確檢測畜肉食品中含有的牛源性成分及其含量，能夠為質(zhì)檢部門打擊不法商販、維護消費者合法利益提供有力的科學(xué)依據(jù)。

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[4] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.飼料中牛羊源性成分的定性檢測定性聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）法：GB/T 20190—2006[S] . 北京：中國標準出版社，2006.

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Detection of Bovine-derived Materials in Meat Products by Real-time Fluorescent PCR with TaqMan Probe and Its Quantitative Research

Sha Caihua，Wang Wenhui，Huang Haichao，Liao Xiuyun，Yang Su
（Zhuhai Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhuhai，Guangdong519000）

According to the conserved sequence of the gene in bovine mitochondria，the specific primers and probes were designed，a real-time fluorescent PCR with TaqMan probe for detecting bovine-derived materials existing in meat products was developed. Then its specificity，sensitivity and stability were evaluated. Through the simulated concentration standard curve，the relative quantitative detection of bovine-derived materials was conducted. Results showed that this method had the characteristics of strong specificity and high sensitivity，by which the lowest detection limit was 0.001%. As a summary，the established method was suitable for rapid detection of bovine-derived materials and content in meat products.

bovine-derived materials；mitochondria；real-time fluorescent PCR with TaqMan probe

TS251.5

A

1005-944X（2016）12-0089-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.12.024

珠海出入境檢驗檢疫局科技計劃項目（ZH2014-21）

汪文輝