許曉義 宋高臣 何志鵬 孫 健 代海兵 張 波 武蕾蕾

(牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

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H22荷瘤小鼠組織蛋白質(zhì)的雙向電泳比較

許曉義 宋高臣 何志鵬 孫 健 代海兵 張 波1武蕾蕾

(牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

目的 建立H22荷瘤小鼠組織蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳圖譜，初步分析肝癌小鼠組織蛋白質(zhì)的差異表達(dá)。方法 分別取對(duì)照組小鼠正常肝組織和H22荷瘤小鼠瘤組織，利用雙向電泳技術(shù)分離對(duì)照組正常肝組織及荷瘤組瘤組織的蛋白質(zhì)，獲得圖譜后通過(guò)ImageMaster 5.0軟件分析兩組蛋白表達(dá)的差異特性。結(jié)果 組織分析結(jié)果表明，差異明顯的蛋白點(diǎn)有22個(gè)，其中在荷瘤組有16個(gè)點(diǎn)高表達(dá)，6個(gè)低表達(dá)；有19個(gè)點(diǎn)僅在對(duì)照組出現(xiàn)，新增27個(gè)點(diǎn)在荷瘤組表達(dá)。結(jié)論 異常蛋白表達(dá)與細(xì)胞增殖異常、代謝紊亂、腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。

雙向電泳；組織；差異蛋白；肝癌

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素參與的過(guò)程并且復(fù)雜多變，雙向電泳技術(shù)(2-DE)對(duì)蛋白質(zhì)的分析具有整體性和廣泛性，在惡性腫瘤的研究中得到廣泛應(yīng)用，利用2-DE可以分離正常組織細(xì)胞與腫瘤之間的差異蛋白質(zhì)組分，為尋找腫瘤的生物標(biāo)志物和腫瘤的發(fā)病機(jī)制以及開(kāi)發(fā)新的腫瘤治療方式和治療藥物提供大量的理論依據(jù)〔1〕。本研究利用2-DE技術(shù)比較對(duì)照組正常肝組織及荷瘤組瘤組織蛋白表達(dá)的差異特性。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與廇株 昆明種小鼠20只，18～22 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，小鼠轉(zhuǎn)移性腹水型肝癌細(xì)胞株H22，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所引進(jìn)。

1.2 主要試劑與儀器設(shè)備 AgNO3(和光純業(yè)工業(yè)株式會(huì)社)，IPG Buffer(GE)，Tris(Sigma)，DTT(Sigma)，固相pH梯度干膠條(GE)，Ettan DALT twelve電泳系統(tǒng)(GE)，IPGphor3等電聚焦儀(GE)，ImageMaster 5.0分析軟件(GE)等。

1.3 方法

1.3.1 H22荷瘤小鼠模型建立 無(wú)菌條件下抽取接種第6～7天生長(zhǎng)良好的H22肝癌小鼠的腹水(活癌細(xì)胞數(shù)>97%)，用無(wú)菌生理鹽水1∶3稀釋?zhuān){(diào)整細(xì)胞濃度約2×107個(gè)/ml，0.2%臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)活細(xì)胞數(shù)大于95%，無(wú)菌操作。小鼠右前肢腋部皮下接種0.2 ml/只制備實(shí)體瘤模型。設(shè)立對(duì)照組(正常小鼠)與荷瘤組，每組10只，同條件飼養(yǎng)。

1.3.2 組織收集及樣品處理 將各組小鼠處死，分別取對(duì)照組肝組織、荷瘤組瘤組織各約0.4 cm×0.4 cm，無(wú)菌條件下生理鹽水反復(fù)清洗，液氮保存。取凍存組織，各自稱重30～90 mg，研磨勻漿后置于450 μl裂解液中混勻，37℃孵育1 h，10℃，40 000 r/min，離心15 min，吸取上清液。

1.3.3 雙向凝膠電泳 取兩組小鼠組織樣品，按PI進(jìn)行第一向固相pH梯度等電聚焦分離，再根據(jù)分子量進(jìn)行第二向SDS-PAGE分離，獲得兩組蛋白質(zhì)圖譜。

1.4 圖像掃描及分析 運(yùn)用ImageMaster5.0軟件對(duì)兩組組織蛋白質(zhì)圖譜進(jìn)行分析，找出差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)。

2 結(jié) 果

對(duì)照組和荷瘤組組織的2-DE圖譜見(jiàn)圖1，圖2。對(duì)照組與荷瘤組差異蛋白點(diǎn)分析見(jiàn)表1，表2。組織分析結(jié)果表明，差異明顯的蛋白點(diǎn)有22個(gè)，其中在荷瘤組有16個(gè)點(diǎn)高表達(dá)，6個(gè)低表達(dá)；有19個(gè)點(diǎn)僅在對(duì)照組出現(xiàn)，新增27個(gè)點(diǎn)在荷瘤組表達(dá)。

圖1 對(duì)照組和荷瘤組蛋白表達(dá)圖譜

圖2 對(duì)照組與荷瘤組的差異蛋白點(diǎn)

IDPIMW(D)表達(dá)情況差異程度(倍)6045095114601+2170348098668116324-1513482551606811395+15134113053160720636+14173725586643833369-1149635881560817534+11474629152124735894+9302515638953525167+5420610346094118013+540542270808710911+5271911171733618605+5187922951976731785+5102511966479919483+4734236669957742201+4549086778615215353-41587524259968333046-39854114344762222702+36750526079244233648-3568729081390117165+35603374798133625+3493272998168636548+34718819278652229119-344262

“+”表示在荷瘤組高表達(dá)；“-”表示在荷瘤組低表達(dá)

表2 對(duì)照組與荷瘤組特有的蛋白質(zhì)點(diǎn)

3 討 論

肝癌是臨床上常見(jiàn)的一種惡性度極高、診治困難、發(fā)生發(fā)展迅速、預(yù)后極差的腫瘤〔2〕。在非洲、東南亞和我國(guó)，肝癌發(fā)病率已位于腫瘤發(fā)病率的前五位，是全球癌癥相關(guān)性死亡的主要原因之一。根據(jù)2001年我國(guó)衛(wèi)生部惡性腫瘤死亡率統(tǒng)計(jì)資料顯示，我國(guó)城市地區(qū)肝癌居死因順位的第2位，在農(nóng)村地區(qū)居死因順位的首位〔3，4〕。

2-DE是按照蛋白質(zhì)分子量與等電點(diǎn)的差別最終將各蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的技術(shù)〔5，6〕。近年來(lái)，隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，2-DE技術(shù)因具有高靈敏度、高分辨率、重復(fù)性好及高通量，可利于計(jì)算機(jī)對(duì)其進(jìn)行圖像處理分析，具有較好地與質(zhì)譜等鑒定方法相匹配的優(yōu)點(diǎn)，使其在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中成為最常見(jiàn)的用于分離蛋白質(zhì)的技術(shù)手段〔7～9〕。

機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用平衡的穩(wěn)定性決定著機(jī)體正常功能的維持，如果失衡可導(dǎo)致細(xì)胞增殖異常、代謝紊亂等，從而引起腫瘤的發(fā)生。H22肝癌特有蛋白質(zhì)組分的存在說(shuō)明他們可能與肝癌的發(fā)生相關(guān)，而且其中部分蛋白質(zhì)可能是肝癌的標(biāo)志性蛋白，有可能作為腫瘤特異而敏感的標(biāo)志物用于早期特異性診斷。本研究為進(jìn)一步研究肝癌的發(fā)病機(jī)制、特異性標(biāo)志物、早期診斷和選擇合理治療等相關(guān)研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

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4 Wu CY，Lin JT.The changing epidemiology of Asian digestive cancers：from etiologies and incidences to preventive strategies〔J〕.Best Pract Res Clin Gastroenterol，2015；29(6)：843-53.

5 Gygi SP，Corthals GL，Zhang Y，etal.Evaluation of two-dimensional gel electrophoresis-based proteome analysis technology〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2000；97(17)：9390-5.

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7 尹 穩(wěn)，伏 旭，李 平.蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用研究進(jìn)展〔J〕.生物技術(shù)通報(bào)，2014；(1)：32-8.

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9 何渝軍，牟芝蓉，黎萬(wàn)玲，等.利用2DE-MS技術(shù)篩選和鑒定大腸癌血清標(biāo)志物〔J〕.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012；34(18)：1835-8.

〔2016-06-13修回〕

(編輯 郭 菁)

黑龍江省普通高等學(xué)校青年學(xué)術(shù)骨干支持計(jì)劃項(xiàng)目(1251G066)；牡丹江市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(Z2014s031)

武蕾蕾(1981-)，女，實(shí)驗(yàn)師，主要從事中醫(yī)藥抗腫瘤分子生物學(xué)機(jī)制研究。

許曉義(1981-)，男，講師，主要從事中醫(yī)藥抗腫瘤分子生物學(xué)機(jī)制研究。

R73

A

1005-9202(2016)22-5515-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.009

1 牡丹江市腫瘤醫(yī)院