吳國(guó)瓊 林 梅 郭菲菲 楊艷群 張 雨 候亞莉 邱 璇 鄧春地 袁惠萍

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢普愛(ài)醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖北 武漢 430034)

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11β-羥基類固醇脫氫酶1型抑制劑對(duì)高脂血癥大鼠肝臟、脂肪和骨骼肌脂代謝基因的影響

吳國(guó)瓊 林 梅 郭菲菲 楊艷群 張 雨 候亞莉 邱 璇 鄧春地 袁惠萍

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢普愛(ài)醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖北 武漢 430034)

目的 探討11β-羥基類固醇脫氫酶1型(11β-HSD1)抑制劑BVT 2733對(duì)高脂血癥大鼠肝臟、脂肪和骨骼肌脂代謝基因表達(dá)的影響。方法 采用高脂飲食喂養(yǎng)建立高脂血癥大鼠模型。將40只高脂血癥大鼠隨機(jī)分為模型組和BVT 2733(20 mg/kg)組，每組20只。另取20只普通飼料喂養(yǎng)的SD大鼠作對(duì)照組。分別觀察BVT 2733對(duì)甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)水平的影響，并測(cè)定肝臟和腎周、大網(wǎng)膜及睪周脂肪組織脂肪含量，測(cè)定腓腸肌組織中Rev-erba、FAT/CD36、SCD1及CPT1 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果 BVT 2733治療后，高脂血癥大鼠的TG、TC和LDL-C明顯低于模型組(P<0.05)，并且肝臟和內(nèi)臟脂肪的脂肪含量明顯低于模型組(P<0.05)，腓腸肌組織中Rev-erba mRNA水平明顯低于模型組(P<0.05)，F(xiàn)AT/CD36、SCD1及CPT1 mRNA水平明顯高于模型組(P<0.05)。結(jié)論 BVT 2733可改善高脂血癥大鼠的血脂及脂蛋白水平紊亂，降低肝臟脂肪含量并穩(wěn)定骨骼肌脂代謝基因表達(dá)，提示抑制11β-HSD1活性對(duì)高脂血癥相關(guān)的肝臟、脂肪組織和骨骼肌異常脂質(zhì)代謝有一定改善作用。

11β-羥基類固醇脫氫酶1型抑制劑；高脂血癥；肝臟脂質(zhì)代謝；骨骼肌脂代謝基因

肥胖人群中高脂血癥的發(fā)病率高達(dá)50%以上〔1〕。高脂血癥可增加冠心病、高血壓、動(dòng)脈硬化性血管病、2型糖尿病的發(fā)生和病死率。肥胖癥的脂代謝異常發(fā)生機(jī)制較多。國(guó)內(nèi)外學(xué)者僅分別就11β-羥基類固醇脫氫酶1型(11β-HSD1)在肥胖癥、2型糖尿病患者及動(dòng)物模型中的作用及相關(guān)機(jī)制做過(guò)初步研究，證實(shí)在脂代謝異常時(shí)11β-HSD1參與高脂血癥的形成〔2～4〕，但11β-HSD1在高脂血癥模型肝臟及骨骼肌脂代謝中的作用尚不清楚。本研究擬探討11β-HSD1抑制劑BVT 2733對(duì)高脂血癥大鼠肝臟脂代謝及骨骼肌脂代謝基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 11β-HSD1抑制劑BVT 2733購(gòu)自美國(guó)MCE公司，油紅 O、蘇木素-伊紅(HE)染色液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，QuantiTect SYBR Green PCR、QuantiTect Probe PCR kits試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，β-actin(NM_013200)、Rev-erbα(NM _145775)、SCD1(NM _139192)、FAT/CD36(NM_031561)、CPT1(NM_013200)引物均購(gòu)自上海生工公司。

1.2 動(dòng)物分組及大鼠模型建立 選取200～220 g SD雄性大鼠40只，采用高脂飲食飼養(yǎng)6 w誘導(dǎo)高脂血癥大鼠模型。將這40只模型大鼠隨機(jī)分為模型組和BVT 2733組，每組20只，其中BVT 2733組每天接受20 mg/kg BVT 2733灌胃處理，連續(xù)4 w，而模型組僅接受等體積生理鹽水灌胃處理。另取20只普通飼料喂養(yǎng)的SD大鼠作對(duì)照組。本研究所用大鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.3 血脂及脂蛋白水平檢測(cè) 治療4 w后腹主動(dòng)脈取血5 ml，加入不含抗凝劑的離心管中，靜置10 min后分離血清，采用Olympus AU 400型全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、載脂蛋白(Apo)AI和 Apo B水平。

1.4 肝臟組織病理學(xué)觀察 取新鮮肝臟組織3～4塊，修剪成1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm的組織塊，采用OTC包埋劑包埋，常規(guī)油紅O染色后，采用Image-Pro Plus 5.0圖像處理和分析軟件分析肝臟脂肪含量。

1.5 脂肪組織重量與HE 染色觀察 采集腎周、大網(wǎng)膜和睪周脂肪組織，采用濾紙吸干表面附著組織液后稱量各部分重量。將取得的脂肪組織，用 4%多聚甲醛緩沖液固定后，依次經(jīng)脫水、透明、包埋及染色后，采用Image-Pro Plus 5.0軟件計(jì)算脂肪細(xì)胞平均面積。

1.6 骨骼肌組織中脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況 分離大鼠腓腸肌，將其置于EP管(1.5 ml)中，置于液氮中研磨，提取骨骼肌組織中總RNA，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)Rev-erbα、SCD1、FAT/CD36及CPT1 mRNA的表達(dá)情況。按照QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)操作擴(kuò)增。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠的血脂水平比較 與對(duì)照組比較，模型組的TG、TC及LDL-C水平均升高，HDL-C水平降低(P<0.05)；BVT 2733處理后TG、TC及LDL-C水平均低于模型組，HDL-C水平高于模型組(P<0.05)，且與對(duì)照組仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠的載脂蛋白水平比較 與對(duì)照組比較，模型組的Apo AI、Apo AI/Apo B水平降低，Apo B水平升高(P<0.05)；BVT 2733處理后的Apo AI、Apo AI/Apo B高于模型組，Apo B水平低于模型組(P<0.05)，但與對(duì)照組仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 各組大鼠的肝臟脂肪含量比較 對(duì)照組的肝臟脂肪含量比為(0.17±0.03)%，低于模型組的(32.59±4.23)%(P<0.05)；BVT 2733處理后肝臟脂肪含量比為(19.82±2.47)%，低于模型組(P<0.05)，但仍高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.4 各組大鼠脂肪分布比較 與對(duì)照組比較，模型組的腎周、大網(wǎng)膜、睪周脂肪墊重量及脂肪總量均升高(P<0.05)；BVT 2733處理后腎周、大網(wǎng)膜、睪周脂肪墊重量及脂肪總量均低于模型組(P<0.05)，且與對(duì)照組仍有差異(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.5 各組大鼠脂肪細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 模型組的脂肪細(xì)胞面積為(15.72±0.87)×104μm2，高于對(duì)照組的(11.39±1.26)×104μm2(P<0.05)；BVT 2733組的脂肪細(xì)胞面積為(12.93±1.53)×104μm2，低于模型組，但仍高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.6 各組大鼠骨骼肌代謝基因表達(dá)情況比較 與對(duì)照組比較，模型組骨骼肌中Rev-erba mRNA水平降低，F(xiàn)AT/CD36、SCD1及CPT1 mRNA水平升高(P<0.05)；BVT 2733處理后Rev-erba mRNA水平高于模型組，其余3個(gè)基因的mRNA水平低于對(duì)照組(P<0.05)；除CPT1外，BVT 2733組骨骼肌的Rev-erba、FAT/CD36及SCD1 mRNA水平與對(duì)照組仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表1 各組大鼠的血脂水平比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

表2 各組大鼠Apo水平比較

表3 各組大鼠各部位脂肪墊重量及脂肪組織總量比較

表4 各組大鼠骨骼肌代謝基因的表達(dá)情況±s,n=20)

3 討 論

11β-HSD1是機(jī)體中重要的糖皮質(zhì)激素代謝酶，可使無(wú)活性的可的松轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘臍浠傻乃桑瑥亩{(diào)節(jié)多種物質(zhì)代謝〔5〕。我們前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高血糖可以直接促進(jìn)胰島β細(xì)胞上的11β-HSD1表達(dá)增加，與在肝細(xì)胞上作用類似，這種葡萄糖對(duì)11β-HSD1的直接作用提示葡萄糖可能是一個(gè)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)合成皮質(zhì)酮的重要代謝信號(hào)，具有啟動(dòng)局部組織糖皮質(zhì)激素代謝的作用〔6〕。研究表明11β-HSD1在調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞活動(dòng)及脂肪代謝中發(fā)揮重要〔7～9〕，故針對(duì)11β-HSD1的治療策略可能有一定效果。

本研究結(jié)果提示高脂血癥模型制備成功。經(jīng)BVT 2733處理后TG、TC、LDL-C水平降低，而HDL-C水平升高，提示抑制11β-HSD1活性具有良好的降血脂效果。脂蛋白在血脂調(diào)控中發(fā)揮重要作用，Apo B主要存在LDL-C表面，在介導(dǎo)細(xì)胞識(shí)別和攝取LDL-C中發(fā)揮重要作用〔10〕，而Apo AI為HDL-C的主要結(jié)構(gòu)蛋白，Apo B及Apo AI水平可用于反映LDL-C和HDL-C水平〔11〕。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)抑制11β-HSD1活動(dòng)對(duì)降低高脂血癥大鼠Apo B水平及升高Apo AI水平有較好的效果，更加證實(shí)了11β-HSD1參與調(diào)控高脂血癥大鼠脂質(zhì)代謝的作用。

脂質(zhì)代謝紊亂可引起肝臟細(xì)胞內(nèi)脂肪過(guò)度蓄積，如不及時(shí)控制可引起肝臟脂肪化〔12〕。高脂血癥大鼠接受BVT 2733處理后，肝臟脂肪比例降低，提示抑制11β-HSD1 可促進(jìn)肝臟脂質(zhì)代謝合成，改善脂質(zhì)降解紊亂。此外，BVT 2733處理后高脂血癥大鼠的各部位脂肪墊重量及脂肪組織總量較模型大鼠均降低，且脂肪細(xì)胞面積減少，為11β-HSD1調(diào)控高脂血癥脂質(zhì)代謝提供了直接證據(jù)。

骨骼肌是能量物質(zhì)儲(chǔ)存的主要外周組織，也是脂肪酸氧化代謝最活躍的部位之一。在骨骼肌脂質(zhì)代謝過(guò)程，多個(gè)與脂代謝有關(guān)的基因參與其中。有研究〔13〕表明，骨骼肌中的11β-HSD1有代謝疾病緩解的作用，高血糖KK/Ta小鼠中，11β-HSD1抑制骨骼肌胰島素受體底物mRNA表達(dá)增加，減少參與脂質(zhì)代謝的基因。Rev-erba是脂代謝調(diào)節(jié)的核心作用因子，將其敲除后小鼠可出現(xiàn)脂代謝異?！?4〕。FAT/CD36是脂肪酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)體，可將循環(huán)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)至肌細(xì)胞，促進(jìn)胞內(nèi)脂質(zhì)合成及脂肪的氧化代謝〔15〕。SCD1為多不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化成單不飽和脂肪酸反應(yīng)的關(guān)鍵限速酶，該反應(yīng)可為肌細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成提供底物〔16〕。CPT1是脂肪酸β氧化的限速酶，在長(zhǎng)鏈脂酰CoA的酯酰基轉(zhuǎn)移至肉堿合成脂酰肉堿過(guò)程中發(fā)揮催化作用，最終轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)膜參與β氧化〔17〕。本研究發(fā)現(xiàn)高脂血癥大鼠肌細(xì)胞中脂質(zhì)過(guò)載導(dǎo)致代謝異常，同時(shí)也增加了誘發(fā)胰島素抵抗的風(fēng)險(xiǎn)；抑制11β-HSD1后以上指標(biāo)獲得改善，進(jìn)一步提示11β-HSD1在維持肌細(xì)胞脂質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡中起到重要作用，可能與其調(diào)節(jié)脂肪跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及氧化代謝等環(huán)節(jié)有關(guān)。

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〔2015-11-13修回〕

(編輯 徐 杰)

武漢市衛(wèi)生局科技課題(WX13C16)

林 梅(1970-)，女，博士，主要從事糖尿病、甲狀腺疾病、骨質(zhì)疏松及肥胖等研究。

吳國(guó)瓊(1975-)，女，在讀碩士，主治醫(yī)師，主要從事內(nèi)分泌疾病研究。

R589.2

A

1005-9202(2016)22-5527-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.015