徐榮華，崔 濤，王建才，苗永美，錢立生， 胡慶森

(1 安徽科技學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，安徽鳳陽 233100；2 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，濟(jì)南 250100)

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蒺藜苜蓿DGAT1基因的克隆和功能鑒定

徐榮華1，崔 濤1，王建才2，苗永美1，錢立生1， 胡慶森1

(1 安徽科技學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，安徽鳳陽 233100；2 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，濟(jì)南 250100)

該研究采用RT-PCR與電子克隆的方法，從蒺藜苜蓿cDNA中克隆得到2個編碼二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(diacylglycerol acyltransferase，DGAT)的基因MtDGAT1-1和MtDGAT1-2。MtDGAT1-1長1 620 bp，編碼539個氨基酸；MtDGAT1-2長1 524 bp，編碼507個氨基酸。多序列比對顯示,MtDGAT1-1和MtDGAT1-2編碼蛋白具有典型的植物DGAT1結(jié)構(gòu)域。表達(dá)分析顯示,MtDGAT1-1和MtDGAT1-2在根、莖、葉、花、種子中都有表達(dá)，在種子發(fā)育中高表達(dá),且MtDGAT1-1于種子發(fā)育的中前期高表達(dá)，而MtDGAT1-2于種子發(fā)育的中后期高表達(dá)。酵母互補實驗證實,MtDGAT1-2編碼蛋白具有DGAT酶活性，能夠恢復(fù)H1246的TAG合成和油體形成；而MtDGAT1-1編碼蛋白不能恢復(fù)H1246的TAG合成和油體形成。

二脂酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶；三脂酰甘油；蒺藜苜蓿；油體

三脂酰甘油(triacylglycerol，TAG)是真核生物中儲存能量和結(jié)構(gòu)分子——脂肪酸(fatty acid, FA)的主要方式，也是油料作物種子油脂的主要成份，對于植物的生長、發(fā)育、繁衍具有重要的作用[1]，同時也是人類日常生活中的食物資源和化工原料[2]。TAG的生物合成分為兩步：FA的從頭合成及TAG組裝。FA的初始碳鏈合成和延長是在質(zhì)體內(nèi)進(jìn)行的，以光合作用中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的乙酰輔酶A(acetyl-CoA)為底物，在一系列脂肪酸合成酶復(fù)合體(fatty acid synthase complex，F(xiàn)AS)的共同作用下催化完成的。TAG組裝的胞內(nèi)場所為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，以質(zhì)體輸出的FA(脂酰ACP或脂酰輔酶A的形式)為底物，以三磷酸甘油(glycerol-3-phosphate，G3P)為骨架，在甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶(sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT)、溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶(lysophosphatidic acid acyltransferase，LPAAT)、磷脂酸磷酸酶(phosphatidate phosphatase，PAP)和二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(diacylglycerol acyltransferase，DGAT)的次序催化下合成的。TAG組裝是Kennedy在1961年發(fā)現(xiàn)的，因此也被稱為Kennedy途徑[3]。

DGAT催化的反應(yīng)是TAG合成的最后一步，因此被認(rèn)為是TAG合成過程中的關(guān)鍵酶[4]。目前已發(fā)現(xiàn)的DGAT分為4類：DGAT1、DGAT2、可溶性的DGAT3和雙功能的DGAT4[5]。其中研究較多主要為DGAT1和DGAT2，這兩類DGAT在基因結(jié)構(gòu)、編碼蛋白、進(jìn)化和酶學(xué)活性及特異性等方面都存在巨大差異[5]，然而關(guān)于DGAT1和DGAT2對于種子油含量和油成分的作用如何，目前尚未完全明確。目前研究表明在不含特殊FA的植物中DGAT1對于種子油含量貢獻(xiàn)較大，而在含有特殊FA的植物中，DGAT2對于種子中特殊FA的積累具有較大的貢獻(xiàn)[6]。

蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)因倍性小(2n=16)，基因組小(5×108bp)，自花受粉及種子較多，再生時間較短，具有較高的遺傳轉(zhuǎn)化效率，有大量的突變體和多種生態(tài)型，具有較高的生物多樣性等特點，被認(rèn)為是豆科模式植物[7-8]，從蒺藜苜蓿獲得的信息有助于其它豆科植物的研究。目前已從擬南芥、油菜、煙草、蓖麻、小桐子等多種植物中克隆和鑒定了DGAT1，然而對于蒺藜苜蓿DGAT1基因的功能卻未見報道。本課題以豆科模式植物蒺藜苜蓿A17為研究對象，通過克隆鑒定蒺藜苜蓿中編碼DGAT1的基因，不僅有助于揭示DGAT1基因在蒺藜苜蓿中對TAG合成的影響，同時可以進(jìn)一步豐富植物DGAT1基因的理論研究，對于豆科植物基因發(fā)掘和種質(zhì)創(chuàng)新具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

大腸桿菌TOP10和蒺藜苜蓿A17由本實驗室保存。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)突變株H1246,由瑞典斯堪的納維亞生物技術(shù)研究中心的Sten Stymne教授贈送。

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 將-80 ℃凍存的材料(A17的葉片)在液氮中研磨成粉，采用Trizol法[6]進(jìn)行總RNA提取，RNA沉淀使用適量的DEPC水溶解，用1%甲醛變性瓊脂糖膠電泳法[6]對RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測，用分光光度法[8]對RNA濃度進(jìn)行估算。使用PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒(大連寶生物)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈。

1.2.2MtDGAT1-1和MtDGAT1-2基因克隆及序列分析 以AtDGAT1(NP_179535)為探針?biāo)阉鬏疝架俎；蚪M網(wǎng)站(http://www.jcvi.org/medicago/)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，獲得Medtr2g039940和Medtr4g125980的參考序列，分別命名為MtDGAT1-1和MtDGAT1-2?；趨⒖夹蛄性O(shè)計ORF引物(表1)。以A17的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系按照Ex Taq(大連寶生物)說明配制。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 2 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，32個循環(huán)；72 ℃補充延伸 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測后純化，克隆到pGM-T載體(北京天根生化有限公司)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，通過藍(lán)白斑篩選及菌液PCR鑒定陽性克隆后測序。引物合成由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司完成，測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1 引物信息*

注: *劃線堿基為KpnI或XhoI位點

Note： * The underlined bases encode restriction enzyme site ofKpnI orXhoI

使用ORF finder對獲得的cDNA序列進(jìn)行開放閱讀框分析；ProtParam在線分析蛋白的理化性質(zhì)；TMHMM在線分析跨膜結(jié)構(gòu)； MEGA 6.0進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建[6]； Vector NTI 11軟件包的AlignX模塊構(gòu)建多序列比對[6]。

1.2.3 表達(dá)模式分析和酵母表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化 苜?；騇tDGAT1-1和MtDGAT1-2表達(dá)模式的數(shù)據(jù)來自蒺藜苜蓿基因組Nobel網(wǎng)站的表達(dá)芯片數(shù)據(jù)[8]，使用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用Origin進(jìn)行作圖。

將所得MtDGAT1-1和MtDGAT1-2基因通過KpnI和XhoI(Fermentas)雙酶切克隆到酵母表達(dá)載體pWXY3.1上，分別構(gòu)建酵母表達(dá)載體pWXY3.1- MtDGAT1-1和pWXY3.1-MtDGAT1-2。按照醋酸鋰-PEG法[6]轉(zhuǎn)化酵母菌株H1246,使用缺少尿嘧啶的合成培養(yǎng)基(synthetic minimal defined medium lacking uracil，SCU-)篩選陽性克隆，同時以空質(zhì)粒pWXY3.1和含有釀酒酵母ScDGA1基因質(zhì)粒pWXY3.1-ScDGA1做對照。在SCU-平板培養(yǎng)基上28 ℃生長2～4 d，挑取酵母菌斑進(jìn)行PCR驗證。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因酵母油脂分析和油體觀察 將轉(zhuǎn)基因酵母接種10 mL SCU-液體培養(yǎng)基(2%葡萄糖)，250 r/min、30 ℃培養(yǎng)過夜，測OD600，離心收集菌體，用SCU-液體培養(yǎng)基重懸菌體至OD600為 0.4，250 r/min、30 ℃重新開始培養(yǎng)。24 h后，進(jìn)行尼羅紅染色觀測酵母油體。84 h后離心收集酵母細(xì)胞，使用酸熱法破碎細(xì)胞，使用正己烷∶異丙醇(3∶2)法提取酵母油脂進(jìn)行TLC分析和油脂百分含量測定。轉(zhuǎn)基因酵母的油體觀察、油脂抽提、TLC層析按照參考文獻(xiàn)[3,6]記載的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 MtDGAT1-1和MtDGAT1-2的克隆和序列分析

以蒺藜苜蓿野生型A17的葉片為材料進(jìn)行RNA抽提，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進(jìn)行MtDGAT1-1和MtDGAT1-2基因克隆的PCR擴(kuò)增，分別得到約1.5 kb目的條帶(圖1)，測序結(jié)果與預(yù)期序列完全一致。MtDGAT1-1開放閱讀框為1 620 bp，編碼蛋白長度為539個氨基酸，預(yù)測分子量為61.6 kD，理論等電點為8.27。MtDGAT1-2開放閱讀框為1 524 bp，編碼蛋白長度507個氨基酸，預(yù)測分子量為58.4 kD，理論等電點為9.00。MtDGAT1-1和MtDGAT1-2在cDNA水平的序列相似性為70.5%，在蛋白質(zhì)水平的序列相似性為73.5%。

M. Marker 2501； 1～2. MtDGAT1-1； 3～4. MtDGAT1-2圖1 MtDGAT1-1和MtDGAT1-2的克隆Fig.1 Amplification of MtDGAT1-1and MtDGAT1-2

BlastP結(jié)果顯示MtDGAT1-1和MtDGAT1-2均與其他植物DGAT1高度同源，與GmDGAT1(AAS78662)相似性分別為78.3%(MtDGAT1-1)和79.2%(MtDGAT1-2)，與LjDGAT1(AAW51456)的相似性分別為70.9%(MtDGAT1-1)和78.4%(MtDGAT1-2)，與RcDGAT1(AAR11479)的相似性分別為65.4%(MtDGAT1-1)和75.4%(MtDGAT1-2)?？缒そY(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示MtDGAT1-1和MtDGAT1-2均含有9個跨膜結(jié)構(gòu)域，推測MtDGAT1-1和MtDGAT1-2屬于膜蛋白。將MtDGAT1-1和MtDGAT1-2與AtDGAT1進(jìn)行多序列比對分析，發(fā)現(xiàn)MtDGAT1-1和MtDGAT1-2具有典型的植物DGAT結(jié)構(gòu)域，MtDGAT1-1、MtDGAT1-2和AtDGAT1的序列差異主要表現(xiàn)在N端，而C端區(qū)域和中間區(qū)域的氨基酸序列則相對保守(圖2)。比較MtDGAT1-1和MtDGAT1-2的序列，可以發(fā)現(xiàn)MtDGAT1-1相對MtDGAT1-2在兩處出現(xiàn)較大的插入，一是MtDGAT1-2的Q74和N75之間插入KTDHAEGIVDDDDDNAVKK，二是S81和S82之間插入NDRENVA片段，推測這兩處插入可能與MtDGAT1-1和MtDGAT1-2在蒺藜苜蓿中的功能分化相關(guān)。同時發(fā)現(xiàn)MtDGAT1-1和MtDGAT1-2均存在植物DGAT1中已知的結(jié)構(gòu)域[6]：(1)脂酰輔酶A結(jié)合域(acyl-CoA binding motif)；(2)蔗糖非發(fā)酵相關(guān)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域(sucrose non-fermenting related protein kinase motif)；(3)硫酰酶中間體結(jié)合域(thiolase acyl-enzyme intermediate-binding motif)；(4)DGAT結(jié)構(gòu)域；(5)脂肪酸結(jié)合域(fatty acid binding protein signature)；(6)二酰甘油或佛波酯結(jié)合域(DAG/phorbol ester binding motif)；(7)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(ER retrieval motif)。在MtDGAT1-1和MtDGAT1-2的C端均發(fā)現(xiàn)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號遵循-Φ-X-X-K/R/D/E-Φ-COOH的規(guī)則[6]。系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖3)顯示，雙子葉植物的DGAT1聚為一支，單子葉植物DGAT1聚為一支，MtDGAT1-1和MtDGAT1-2與同屬豆科植物中大豆的GmDGAT1以及百脈根LjDGAT1聚在一起。

同源氨基酸殘基以黑色背景顯示，相似的氨基酸殘基以灰色顯示。脂酰輔酶A結(jié)合域、SnRK1蛋白激酶結(jié)構(gòu)域、硫酰酶中間體結(jié)合域、DGAT功能域、脂肪酸結(jié)合蛋白簽名、DAG或佛波酯結(jié)合域和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號分別使用藍(lán)色方框標(biāo)出。關(guān)鍵的絲氨酸、脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和組氨酸分別以●、★、■、▲和◆標(biāo)出。AtDGAT1. 擬南芥DGAT1圖2 MtDGAT1-1編碼蛋白、MtDGAT1-2編碼蛋白和AtDGAT1的多序列比對Identical residues are shaded black, and similar residues are shaded grey. Conserved motifs or putative signatures are blue boxed, such as the acyl-CoA binding motif, sucrose non-fermenting related protein kinase motif, thiolase acyl-enzyme intermediate-binding motif, DGAT motif, fatty acid binding protein signature, DAG/phorbol ester binding motif, and ER retrieval motif. Critical serine, proline, tyrosine, phenylalanine and histidine were marked by ●，★，■，▲and ◆, respectively. AtDGAT1. Arabidopsis thaliana DGAT1Fig.2 Multiple sequence alignment of deduced amino acid sequences of MtDGAT1-1, MtDGAT1-2 with AtDGAT1

括號內(nèi)為氨基酸登錄號；分支上的數(shù)字為Bootstrap驗證中基于1 000 次重復(fù)該節(jié)點的可信度的百分比圖3 MtDGAT1-1和 MtDGAT1-2與其他植物DGAT1的進(jìn)化樹分析The accession No. was given in bracket; The numbers on the branches represent the reliability percent of bootstrap values based on 1 000 replicationsFig.3 Phylogenetic relationships of MtDGAT1-1, MtDGAT1-2 with other plant DGAT1s

圖4 MtDGAT1-1和MtDGAT1-2基因的表達(dá)模式Fig.4 Expression pattern of MtDGAT1-1 and MtDGAT1-2

2.2 MtDGAT1-1和MtDGAT1-2基因的表達(dá)分析

以Nobel網(wǎng)站的基因芯片數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，構(gòu)建了MtDGAT1-1和MtDGAT1-2基因的表達(dá)模式(圖4)，圖4顯示MtDGAT1-1和MtDGAT1-2在蒺藜苜蓿的根、莖、葉、花和種子等組織中均有表達(dá)，MtDGAT1-1和MtDGAT1-2在花、芽和莖中的表達(dá)差異不大。在根和葉中，MtDGAT1-2表達(dá)量高于MtDGAT1-1的表達(dá)量，MtDGAT1-2的表達(dá)量分別是MtDGAT1-1的2.3和1.8倍。在果中，MtDGAT1-2表達(dá)量低于MtDGAT1-1的表達(dá)量，MtDGAT1-2是MtDGAT1-1表達(dá)量的0.59倍。在種子中MtDGAT1-1和MtDGAT1-2的表達(dá)存在明顯差異。MtDGAT1-1在苜蓿種子發(fā)育中呈現(xiàn)單峰表達(dá)模式，即在種子發(fā)育初期(10～12 d)表達(dá)量較低，隨著種子的發(fā)育表達(dá)量逐漸增高，在16 d時達(dá)到最高，隨后逐漸降低，36 d時降到最低，約為其第10天表達(dá)量的0.5倍。MtDGAT1-2在苜蓿種子發(fā)育中也呈現(xiàn)單峰的表達(dá)模式，也隨著種子的發(fā)育表達(dá)量逐漸增高，在24 d時達(dá)到最高，在36 d時仍維持著很高的表達(dá)量，約為其第10天表達(dá)量的7.5 倍。

2.3 釀酒酵母表達(dá)載體構(gòu)建和互補實驗

為證實MtDGAT1-1和MtDGAT1-2編碼蛋白具有DGAT酶功能，使用酵母突變體H1246進(jìn)行互補實驗，該突變體中負(fù)責(zé)中性油脂TAG和固醇酯合成的基因都被敲除，因此H1246既不能合成TAG，也不能形成油體[3]。通過KpnI和XhoI雙酶切和連接的方法將MtDGAT1-1和MtDGAT1-2插入酵母表達(dá)載體pWXY3.1，置于TEF1啟動子的下游和CYC1終止子的上游，菌落PCR的結(jié)果(圖5)證實酵母表達(dá)載體pWXY3.1-MtDGAT1-1和pWXY3.1-MtDGAT1-2已經(jīng)構(gòu)建成功。抽提質(zhì)粒后使用醋酸鋰-PEG的方法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入H1246，同時以空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為陰性對照，以轉(zhuǎn)化釀酒酵母ScDGA1為陽性對照挑取SCU-平板上陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取油脂進(jìn)行TLC層析和碘顯色，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒的陰性對照中TAG條帶處無斑點出現(xiàn)，轉(zhuǎn)化陽性對照ScDGA1的處理中可以檢測到TAG斑點，轉(zhuǎn)化MtDGAT1-1的處理中不能檢測到TAG斑點，轉(zhuǎn)化MtDGAT1-2的處理中可以檢測到TAG斑點(圖6，A)，這說明MtDGAT1-2的表達(dá)恢復(fù)H1246合成TAG的能力，而MtDGAT1-1不能恢復(fù)。隨后對轉(zhuǎn)基因酵母進(jìn)行尼羅紅染色，結(jié)果表明MtDGAT1-1編碼蛋白不能互補H1246的油體缺陷表型，而MtDGAT1-2的表達(dá)則可以互補H1246的油體缺陷表型(圖6，B)。

圖5 pWXY3.1-MtDGAT1-1和pWXY3.1-MtDGAT1-2的菌落PCR結(jié)果Fig.5 Colonies PCR analysis of pWXY3.1-MtDGAT1-1 and pWXY3.1-MtDGAT1-2

ScDGA1編碼釀酒酵母內(nèi)源的DGAT2圖6 轉(zhuǎn)基因酵母油脂的TLC層析(A)和油體觀察(B)ScDGA1 encoding endogenous DGAT2 of Saccharomyces cerevisiaeFig.6 TLC analysis (A) and oil body (B) of transgenic yeasts

3 討 論

研究表明在牲畜快速生長時添加高油飼料(如高油玉米)能顯著改善牲畜的生產(chǎn)性能以及畜產(chǎn)品的品質(zhì)[9]。紫花苜蓿被譽為牧草之王，在世界各國廣泛種植，然而其葉片幾乎不含油脂，嚴(yán)重限制了紫花苜蓿作為高油飼料的應(yīng)用。植物通常不在葉片中積累TAG，但是近年來的研究表明在煙草葉片中異位表達(dá)擬南芥AtDGAT1、AtWRI1和AtOLE1可以使得葉片積累干重30%的油脂[10]。研究也表明模式植物擬南芥的研究結(jié)果在紫花苜蓿中并不適用，如在苜蓿中異位表達(dá)調(diào)控花青素代謝途徑的轉(zhuǎn)錄因子AtPAP1不能導(dǎo)致苜蓿葉片中花青素的積累，而異位表達(dá)苜蓿中AtPAP1的同系物MtLAP1則可以導(dǎo)致苜蓿葉片中大量積累花青素[8]，暗示擬南芥和苜蓿中的代謝調(diào)控機制的細(xì)節(jié)并不相同。理解苜蓿TAG合成和積累的分子機制是使用基因工程技術(shù)發(fā)展高油牧草的前提。然而紫花苜蓿是四倍體，基因組復(fù)雜，難以操作[7-8]。而蒺藜苜蓿是二倍體，且與紫花苜蓿的親緣關(guān)系較近，基于蒺藜苜蓿的研究可以直接推廣到紫花苜蓿上面。

本研究從蒺藜苜蓿中克隆得到2個編碼DGAT1的基因MtDGAT1-1和MtDGAT1-2，并對其功能進(jìn)行了初步的分析和鑒定。前人研究表明硫解?；附Y(jié)合域中存在一個重要的脯氨酸殘基，在玉米中此脯氨酸殘基的缺失可使得DGAT酶活下降50%，異位表達(dá)帶有此脯氨酸殘基的玉米DGAT1可使得玉米種子中油含量增加41%，油酸含量增加107%[11]，MtDGAT1-1在此位置氨基酸殘基為絲氨酸，而MtDGAT1-2在此位置則為脯氨酸，暗示MtDGAT1-2具有DGAT酶活性，而MtDGAT1-1可能沒有DGAT酶活性。使用酵母突變株H1246對MtDGAT1-1和MtDGAT1-2進(jìn)行功能互補驗證，TLC分析和尼羅紅染色的結(jié)果都顯示異源表達(dá)MtDGAT1-2可以恢復(fù)H1246的TAG合成和油體形成，暗示MtDGAT1-2具有DGAT酶活，而MtDGAT1-1不能恢復(fù)H1246的TAG合成和油體形成，暗示MtDGAT1-1可能不具有DGAT酶活。AtDGAT2曾一度被認(rèn)為是編碼無功能的DGAT酶，因為AtDGAT2不能互補H1246，而且擬南芥中AtDGAT2的突變沒有產(chǎn)生影響種子油含量和成分改變的表型，然而后續(xù)的研究表明對AtDGAT2進(jìn)行酵母密碼子優(yōu)化表達(dá)則可以使得AtDGAT2互補H1246[12]，在煙草葉片中瞬時表達(dá)的結(jié)果也證實AtDGAT2能夠催化合成TAG，但具有脂?；o酶A底物的依賴性[13]，因此推斷AtDGAT2不易互補H1246的原因在于植物和酵母密碼子偏愛的差異以及酵母中沒有合適的底物。據(jù)此同樣可以推斷MtDGAT1-1不能互補H1246也可能是因為密碼偏愛性和酵母中不存在MtDGAT1-1偏愛的脂酰基輔酶A底物，因此是否MtDGAT1-1為無功能的DGAT，仍需進(jìn)一步的實驗證實。

先前的研究發(fā)現(xiàn)在多數(shù)二倍體物種DGAT1通常為單一拷貝，如擬南芥、蓖麻、小桐子等植物[6]，目前僅在斑鳩菊中發(fā)現(xiàn)2個DGAT1，分別為VgDGAT1a和VgDGAT1b，二者在核苷酸水平的相似性為92%，蛋白質(zhì)水平的相似性為94%[14]，遠(yuǎn)高于本研究克隆的MtDGAT1-1和M12在核苷酸和蛋白質(zhì)水平的相似性，暗示VgDGAT1a和VgDGAT1b是屬于斑鳩菊內(nèi)部的基因進(jìn)化事件的結(jié)果。進(jìn)化樹研究中，MtDGAT1-2與GmDGAT1和LjDGAT1聚在一起，而MtDGAT1-1單獨一枝，說明MtDGAT1-1與MtDGAT1-2形成的分歧要早于豆科物種內(nèi)部分化開始之前，這也表明MtDGAT1-1與MtDGAT1-2不是簡單的基因復(fù)制關(guān)系。為何在蒺藜苜蓿中出現(xiàn)2個序列差異如此之大的DGAT1基因，需要進(jìn)一步研究。

對旱金蓮和小桐子中的DGAT1基因時空表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)DGAT1在根、莖、葉、花、種子中都可以檢測到表達(dá)，在種子中的表達(dá)量顯著高于其他組織，而且表達(dá)豐度的變化與種子中油脂積累的曲線變化正相關(guān)[6,11]。本研究中MtDGAT1-1和MtDGAT1-2表達(dá)與旱金蓮和小桐子中DGAT1的研究相一致，說明MtDGAT1-1和MtDGAT1-2與苜蓿中油脂的積累相關(guān)。在發(fā)育的初期，MtDGAT1-1的表達(dá)明顯高于MtDGAT1-2的表達(dá)，MtDGAT1-1的表達(dá)高峰(16 d)也比MtDGAT1-2(24 d)出現(xiàn)早，在種子接近成熟的36 d，MtDGAT1-1的表達(dá)已經(jīng)降到與葉片中水平類似的時候，MtDGAT1-2的表達(dá)水平仍然很高，推測MtDGAT1-1和MtDGAT1-2在苜蓿種子發(fā)育中都起作用，MtDGAT1-1發(fā)揮作用的時段主要為中前期，可能與種子的胚發(fā)育和成熟有關(guān)，而MtDGAT1-2發(fā)揮作用則主要為中后期，可能與子葉中油脂的積累相關(guān)。

綜上所述，本研究首次從蒺藜苜蓿cDNA中克隆得到2個編碼DGAT1的基因MtDGAT1-1和MtDGAT1-1，發(fā)現(xiàn)MtDGAT1-1和MtDGAT1-2在根、莖、葉、花、種子中都有表達(dá)，在種子發(fā)育中期表達(dá)量最高，同時也發(fā)現(xiàn)MtDGAT1-1高表達(dá)種子發(fā)育的中前期，而MtDGAT1-2則高表達(dá)于種子發(fā)育的中后期。酵母互補實驗證實MtDGAT1-2編碼蛋白具有DGAT酶活性，能夠恢復(fù)H1246的TAG合成和油體形成；而MtDGAT1-1編碼蛋白不能夠恢復(fù)H1246的TAG合成和油體形成。考慮到酵母互補系統(tǒng)沒有能夠成功檢測到MtDGAT1-1編碼蛋白的活性，本實驗室下一步擬采用煙草瞬時表達(dá)系統(tǒng)來測試MtDGAT1-1和MtDGAT1-2的功能，從而探討MtDGAT1-1和MtDGAT1-2對于TAG合成和FA成份的限制作用。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Functional Characterization of Diacylglycerol Acyltransferase Gene (MtDGAT1) from Medicago truncatula

XU Ronghua1, CUI Tao1, WANG Jiancai2, MIAO Yongmei1, QIAN Lisheng1, HU Qingsen1

(1 College of Life Sciences, Anhui Science and Technology University, Fengyang, Anhui 233100, China; 2 Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China)

In this study, we acquired twoMtDGAT1 genes (MtDGAT1-1 andMtDGAT1-2) from cDNA ofMedicagotruncatulaby using insilico cloning combined with RT-PCR. The length ofMtDGAT1-1 is 1 620 bp, encoding 539 amino acids, while the length ofMtDGAT1-2 is 1 524 bp, encoding 507 amino acids. Multiple alignments revealed that both MtDGAT1-1 and MtDGAT1-2 shared the typical functional motifs with DGAT1s from other plant species. Expression analysis showed that bothMtDGAT1-1 andMtDGAT1-2 were expressed in root, stem, leaf, flower and seed, and highly expressed in developing seeds;MtDGAT1-1 was highly expressed in early-middle periods of seed development, whileMtDGAT1-2 was highly expressed in the middle and later periods of seed development. Functional complementation in yeast H1246 confirmed thatMtDGAT1-1 encodes disfunctional DGAT andMtDGAT1-2 encodes functional DGAT.

diacylglycerol acyltransferase; triacylglycerol;Medicagotruncatula; oil body

1000-4025(2016)10-1941-07

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.10.1941

2016-06-14;修改稿收到日期:2016-08-26

國家自然科學(xué)基金青年基金(31300569)；安徽省教育廳2016振興計劃(gxfxzD2016181)

徐榮華(1979-)，男， 博士，講師，主要從事生物技術(shù)和生物工程研究。E-mail：xrh96@163.com

Q785；Q786; Q789

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