郭美麗，王佳婉，王 珂，靳慧慧，張開(kāi)明

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，鄭州 450002)

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外源ABA對(duì)低溫不同光周期下四季秋海棠葉片花色素苷的誘導(dǎo)機(jī)理

郭美麗，王佳婉，王 珂，靳慧慧，張開(kāi)明*

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，鄭州 450002)

以‘超級(jí)奧林匹克’四季秋海棠(‘Super Olympia’Begoniasemperflorens)為材料，于常溫(25 ℃/15 ℃)等日照條件下用0、5、10、50、100、500 μmol/L脫落酸(ABA)和低溫(15 ℃/6 ℃)不同光周期下用10 μmol/L ABA分別噴施各處理植株，對(duì)不同處理下植株的色素含量、內(nèi)源激素含量及其酶活性進(jìn)行比較分析，探討ABA對(duì)其葉片花色素苷合成的調(diào)控作用及其機(jī)理。結(jié)果顯示：(1)常溫等日照條件下，四季秋海棠葉片在5和10 μmol/L ABA處理后的第3～5天有明顯變紅趨勢(shì)，且花色素苷含量和內(nèi)源ABA含量顯著增加，而內(nèi)源赤霉素(GA)含量的下降幅度較為顯著，相應(yīng)的花色素苷合成關(guān)鍵酶和運(yùn)輸酶活性也顯著提高。(2)低溫條件下，四季秋海棠葉片花色素苷積累量與光周期密切相關(guān)，短日照處理的花色素苷積累量最大并顯著高于等日照和長(zhǎng)日照，但等日照與長(zhǎng)日照下花色素苷積累量無(wú)顯著差異；外源10 μmol/L ABA處理均可顯著提高低溫不同光周期下四季秋海棠葉片的花色素苷含量。(3)外施10 μmol/L ABA增加了低溫下長(zhǎng)日照和等日照處理中DFR(二氫黃酮醇-4-還原酶)還原反應(yīng)中H供體NADPH的含量，促使DFR和UFGT(糖苷轉(zhuǎn)移酶)的活性上調(diào)進(jìn)而增加了花色素苷的含量；外施ABA處理均能夠提高低溫不同光周期處理組的內(nèi)源ABA含量，降低內(nèi)源GA的含量，與花色素苷的生成量相一致。研究表明，外源ABA能夠通過(guò)調(diào)節(jié)花色素苷合成的關(guān)鍵酶來(lái)影響花色素苷的合成，外施適宜濃度ABA能夠促進(jìn)四季秋海棠葉片花色素苷的積累，可用于實(shí)際生產(chǎn)中的葉片著色調(diào)控管理。

四季秋海棠；脫落酸；花色素苷；低溫；光周期

花色素苷(anthocyanin)是一種黃酮類(lèi)次生代謝物，是一類(lèi)從紅到紫到藍(lán)的植物色素，一般產(chǎn)生于植物葉片。當(dāng)外界環(huán)境改變使得葉綠素遭到破壞,其含量明顯下降時(shí)，色素也就隨之而產(chǎn)生了[1]。影響花色素苷生成的環(huán)境因素有很多[2]，其中光照、溫度、旱澇、營(yíng)養(yǎng)缺乏、激素、衰老等條件下都能影響花色素苷的形成。溫度一般通過(guò)影響色素合成關(guān)鍵酶的活性，從而調(diào)節(jié)花色素苷的合成以及色素之間的組成和比例[3]。溫度是影響葉片中花色素苷含量的重要因素。它不僅從基因轉(zhuǎn)錄水平上影響花色素苷合成，同時(shí)影響花色素苷的穩(wěn)定[4]。低溫可以誘導(dǎo)一些植物體內(nèi)花色素苷合成的相關(guān)基因的表達(dá)，使花色素苷含量升高，如使PAL(苯丙氨酸解氨酶)、CHS(查爾酮合成酶)、CHI(查爾酮異構(gòu)酶)和DFR(二氫黃酮醇-4-還原酶)基因的轉(zhuǎn)錄水平升高幾倍；而高溫卻能抑制這些基因的表達(dá)，使花色素苷含量降低。光照也是影響彩葉植物葉色變化最重要的環(huán)境因素。它從強(qiáng)度、光質(zhì)和光照時(shí)間等方面影響花色素苷的合成及調(diào)節(jié)相關(guān)酶的活性[5]。紫葉矮櫻、紫葉小檗等必須在全光照下才能發(fā)揮其彩葉的最佳色彩[6]。彩葉秋海棠的葉色在遮陰處呈暗綠色，在全光下則呈紅褐色[7]。光照是影響花青苷合成的最重要的外部因子，合成花青苷的4個(gè)關(guān)鍵酶，PAL、CHS、DFR、UFGT(糖苷轉(zhuǎn)移酶)都是光調(diào)節(jié)酶，都以光敏色素為受體[8]。已有研究表明，外源ABA處理不僅可以提高果實(shí)的成熟度，促進(jìn)果實(shí)軟化和后熟衰老進(jìn)程，而且在改善果實(shí)質(zhì)量、促進(jìn)果實(shí)著色方面也有明顯的效果。

四季秋海棠(Begoniasemperflorens)是城市綠化當(dāng)中應(yīng)用較廣的一種地被和花壇花卉，綠葉系列的‘超級(jí)奧林匹克’品種，能夠在外界環(huán)境(如強(qiáng)光、低溫等)的影響下積累花色素苷，而使葉片變紅。低溫對(duì)花色苷合成的促進(jìn)是通過(guò)提高花色苷合成相關(guān)酶的活性， 也可通過(guò)強(qiáng)化結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)水平、 增加酶的含量來(lái)實(shí)現(xiàn)。脫落酸(abscisic acid， ABA)可提高一些植物的葉片或果實(shí)中 PAL、CHS、CHI、F3H(黃烷酮-3-羥基化酶)、UFGT 等酶的活性，促進(jìn)花色苷合成[9]。如劉延吉等[10]發(fā)現(xiàn)ABA可提高南果梨(Pyrusussuriensis)PAL、CHI活性，促進(jìn)果皮花色苷的積累。在低溫條件下，不同光周期與外源ABA對(duì)花色素苷的積累是否有存在互作關(guān)系，目前我們并不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)中我們選用綠葉系列的‘超級(jí)奧林匹克’四季秋海棠品種作為材料，選用最適花色素苷積累的ABA激素濃度(10 μmol/L)，研究外源激素ABA與不同光周期對(duì)花色素苷合成的影響。為花色素苷合成過(guò)程中的環(huán)境因子交叉作用的研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料培養(yǎng)

參試材料‘超級(jí)奧林匹克’(‘Super Olympia’)綠葉系列的四季秋海棠品種，種子購(gòu)于鄭州貝利得花卉有限公司。將種子播種于25 cm寬、200個(gè)孔的穴盤(pán)內(nèi)，營(yíng)養(yǎng)土內(nèi)含有3∶1∶1(v / v / v)泥炭、蛭石和珍珠巖混合而成的基質(zhì)。生長(zhǎng)環(huán)境為氣溫25 ℃/18 ℃(白天/夜晚)、光周期16 h /8 h(白天/夜晚)、相對(duì)濕度70%～85%，待植株長(zhǎng)至3～4片葉時(shí)，挑選形態(tài)長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗分裝成幾組，以備實(shí)驗(yàn)處理使用。

1.2 材料處理

1.2.1 常溫下不同濃度ABA處理 將分裝的幼苗放于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，生長(zhǎng)環(huán)境為25 ℃/15 ℃(白天/夜晚)、等日照、空氣相對(duì)濕度70%～85%、光照強(qiáng)度800 lx。試驗(yàn)設(shè)置0、5、10、50、100、500 μmol/L ABA 6個(gè)濃度處理組，每組進(jìn)行4次重復(fù)，每天于早上9:00和晚上9:00對(duì)其葉片正反面進(jìn)行2次ABA噴施。分別在處理的第0、1、3和5天進(jìn)行拍照，并取正常功能葉片測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)。

1.2.2 低溫不同光周期下外施ABA處理 根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)的結(jié)論選用10 μmol/L的 ABA濃度，并在白天/夜晚15 ℃/6 ℃低溫、光照強(qiáng)度為800 lx環(huán)境條件下進(jìn)行不同光周期處理。試驗(yàn)處理時(shí)要把花蕾去除，選擇生長(zhǎng)基本一致的四季秋海棠綠葉品種植株。外源ABA處理設(shè)10 μmol/L ABA(ABA)和不噴施對(duì)照(CK)兩個(gè)水平，光周期設(shè)置長(zhǎng)日照(L，白天/夜晚16 h/8 h)、等日照(Q，白天/夜晚12 h/12 h)和短日照(S，白天/夜晚8 h/16 h)3個(gè)水平，共組成CK+L(對(duì)照+長(zhǎng)日照)、ABA+L(ABA+長(zhǎng)日照)、CK+Q(對(duì)照+等日照)、ABA+Q(ABA+等日照)、CK+S(對(duì)照+短日照)、ABA+S(ABA+短日照)6個(gè)處理組合。每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)選取5盆植株進(jìn)行試驗(yàn)，處理時(shí)間為15 d。處理結(jié)束后取出拍照，并取足夠的正常功能葉立即置于液氮中，保存在-80 ℃的冰箱內(nèi)，用于測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 花色素苷含量 花色素苷含量測(cè)定參照Mita等[11]的方法加以改進(jìn)。取樣0.1 g用液氮研磨，加1% HCl甲醇液放入2 mL離心管于4 ℃下保存24 h待測(cè)。13 000 g在 4 ℃離心15 min ，既可測(cè)定530 nm和650 nm處的吸光值A(chǔ)530和A650，按公式(A530- 0.25×A650)計(jì)算花色苷含量。

1.3.2 葉綠素含量 葉綠體色素含量參照Porra[12]的方法測(cè)定。各處理分別取0.2 g凍樣用2 mL的80%丙酮在遮光下提取，分光光度計(jì)(SHIMADZUUV-2401PC)測(cè)量662 nm、644 nm、445 nm處的吸光值A(chǔ)662、A644、A445，通過(guò)以下公式計(jì)算出葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)和類(lèi)胡蘿卜素(Car)的含量。

Chla=9.78×A662-0.99×A644

Chlb=21.4×A644-4.65×A662

Car=4.69×A445-0.268×(Chla+Chlb)

1.3.3 相關(guān)酶活性 (1)PAL和CHI活性 取0.3 g 凍樣加入5 mL提取液(0.05 mol/L Na2HPO4/KH2PO4pH 7.0，0.05 mol/L抗壞血酸，0.018 mol/L巰基乙醇)，冰浴勻漿，4 ℃下15 000 g離心20 min，上清液為酶粗提液用于測(cè)定PAL、CHI活性。3次取樣重復(fù)。

PAL活性測(cè)定采用Lister[13]的方法。取0.5 mL粗酶液加入2.5 mL的反應(yīng)液 (硼酸緩沖液pH 8.8，0.01 mol/L苯丙氨酸)，置于34 ℃反應(yīng)30 min，用三氯乙酸終止反應(yīng)，在5 000 g離心5 min除去變性的蛋白質(zhì)。反應(yīng)生成的肉桂酸含量用在290 nm處的吸光值來(lái)表示。每分鐘光密度變化0.001所需的酶量為1活性單位。對(duì)照實(shí)驗(yàn)用不加苯丙氨酸的反應(yīng)液代替正常的反應(yīng)液進(jìn)行。

CHI活性測(cè)定采用Lister等[14]的方法進(jìn)行。取0.75 mL的粗酶提液加入2 mL混合液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，牛血清蛋白7.5 mg/mL，50 mmol/L KCN)，然后加50 μL 1 mg/mL的查爾酮溶液置于34 ℃水浴30 min，另取同量的酶提液沸水浴10 min為對(duì)照，測(cè)定在381 nm吸光值的變化來(lái)表示CHI的活性。每分鐘光密度變化0.001所需的酶量為1活性單位。

(2)DFR和UFGT活性 粗酶液提取參照Murray[14]報(bào)導(dǎo)的方法加以改進(jìn)。取樣品1 g加液氮研磨后，加入5 mL -20 ℃的丙酮混勻離心，棄去上清液，用4 mL -20 ℃丙酮再提取一次，沉淀用4 mL (0.1 mol/L硼酸緩沖液pH 8.8，5 mmol/L抗壞血酸)溶液提取，上清液為DFR和UFGT酶的粗提液。

DFR活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)參照Stafford 和Lester[15]報(bào)導(dǎo)的方法。取0.5 mL酶提液加入0.6 mL反應(yīng)混合液[(0.1 mol/L Tris緩沖液(pH 7.4)，1 μmol/L脫氫櫟精(Dihydroquercetin)，1 mmol/L NADPH，1單位的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶以及6 μmol/L的葡萄糖-6-磷酸)]共1.1 mL，在34 ℃水浴1 h后，用1 mL的乙酸乙酯提取3次，合并提液，然后用0.2 mL的蒸餾水提取3次。乙酸乙酯部分用氮?dú)獯蹈桑尤?.5 mL的正丁醇：鹽酸(95∶5 V/V)于95 ℃水浴30 min，在550 nm 測(cè)定吸光值，用來(lái)表示由無(wú)色花色素(leuocyanidin)向花色素轉(zhuǎn)變的量，取同量的酶提液沸水浴10 min為對(duì)照。每小時(shí)光密度變化0.001所需的酶量為1酶活性單位。

UFGT活性測(cè)定參照Lister和Lancaster[14]的方法。取酶液0.5 mL加入0.5 mL的反應(yīng)液 [0.05 mol/L二甘氨酸緩沖液(pH 8.0)，1 mmol/L的槲皮素和2.5 mmol/L的UDP-葡萄糖]，反應(yīng)液在34 ℃水浴30 min后，用0.75 mL 20% 三氯乙酸的甲醇溶液終止反應(yīng)，于5 000 r/min離心5 min，上清液貯藏于-20 ℃待測(cè)。用高效液相色譜檢測(cè)櫟精的減少量并用其表示酶活性。

(3)谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)活性 每個(gè)處理取0.3 g 待測(cè)樣品加入1.8 mL的硼酸緩沖液， 離心后取上清液待測(cè)，利用南京建成生物工程研究所提供的谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒提供的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 NADP+和NADPH含量 稱取約0.1 g組織樣品，加入0.9 mL酸性提取液，冰浴研磨，煮沸5 min，冰浴中冷卻后，10 000 g 4 ℃離心10 min，取上清液至另一新的離心管中，加入等體積的堿性提取液使之中和，10 000 g 4 ℃離心10 min，取上清液冰上保存供測(cè)定NADP+含量。另外，稱取約0.1 g組織樣品，加入0.9 mL堿性提取液，冰浴研磨，煮沸5 min，冰浴中冷卻后，10 000 g 4 ℃離心10 min，取上清液至另一新的離心管中，加入等體積的酸性提取液使之中和，10 000 g 4 ℃離心10 min，取上清液冰上保存供測(cè)定NADPH含量。NADP+和NADPH含量測(cè)定采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司試劑盒，按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行相關(guān)操作。

1.3.5 ABA和GA含量 取樣之前，用自來(lái)水將葉片沖洗干凈之后，稱取0.3 g樣品(用液氮速凍后保存在-80 ℃的低溫冰箱中)，加2 mL樣品提取液(80%甲醇，內(nèi)含1 mmol/L BHT)，在冰浴下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入10 mL試管，再用2 mL提取液分次將研缽沖洗干凈，一并轉(zhuǎn)入試管中，搖勻后放置在4 ℃冰箱中。4 ℃下提取4 h，1 000 g離心15 min(實(shí)驗(yàn)中離心機(jī)型號(hào)LDZ5-2，4 000 r/min), 取上清液。沉淀中加1 mL提取液，攪勻，置4 ℃下再提取1 h，離心，合并上清液并記錄體積，殘?jiān)鼦壢?。將上清液用氮?dú)獯蹈桑ヌ崛∫褐械募状?，用樣品稀釋液定容每個(gè)處理取0.3 g 樣品樣進(jìn)行ABA、GA的酶聯(lián)免疫檢測(cè)，利用中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供的ELISA植物激素測(cè)定試劑盒提供的方法進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Statistic 5.0進(jìn)行差異顯著性分析，用Excel 2007計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，用OriginPro 7.5軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 常溫等日照下不同濃度外源ABA對(duì)四季秋海棠葉片內(nèi)源激素、色素含量及相關(guān)酶活性影響

在常溫(白天/夜晚：25 ℃/15 ℃)等日照條件下，葉面噴施系列濃度的ABA后，四季秋海棠葉片花色素苷相關(guān)合成酶(PAL、CHI、DFR、UFGT)和運(yùn)輸酶(GST)活性以及花色素苷、光合色素和內(nèi)源激素含量發(fā)生了不同程度的變化(表1、2)。首先，外源噴施ABA對(duì)四季秋海棠葉片花色素苷的誘導(dǎo)作用因濃度不同而異，即在低濃度下(5～10 μmol/L)，隨著濃度的增加，外源ABA對(duì)花色素苷的誘導(dǎo)作用逐漸增強(qiáng)，葉片花色素苷含量分別比對(duì)照顯著增加39.32% 和55.06%(P<0.05)，且在10 μmol/L ABA處理5 d之后，四季秋海棠的葉片表現(xiàn)出肉眼可見(jiàn)的紅色；而當(dāng)噴施的ABA濃度較高(50、100和500 μmol/L)時(shí)，這種對(duì)花色素苷的誘導(dǎo)作用則消失，葉片花色素苷含量比對(duì)照不同程度降低。其次，花色素苷合成相關(guān)的PAL、CHI、DFR、UFGT和運(yùn)輸酶GST活性的變化與花色素苷的含量變化特征相符：在外源噴施ABA 濃度較低(5、10 μmol/L)時(shí)，5種酶活性較對(duì)照顯著增加，且與施用ABA的濃度呈正相關(guān)；而當(dāng)噴施的ABA濃度較高(50、100和500 μmol/L)時(shí)，5種酶活性與對(duì)照相比大多顯著降低，部分沒(méi)有顯著變化。第三，外源噴施不同濃度的ABA之后，對(duì)植物的內(nèi)源激素含量也造成不同的影響，即顯著提高了內(nèi)源ABA的含量，而顯著降低了內(nèi)源激素GA的含量，特別是10 μmol/L外源ABA處理下，內(nèi)源ABA顯著增加了60.93%，而內(nèi)源GA卻顯著降低了38.35%。再次，與葉片花色素苷含量變化相對(duì)應(yīng)，葉片葉綠素含量(a和b)和類(lèi)胡蘿卜素含量與外源施用ABA的濃度呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)，即隨著ABA 濃度的增加而逐漸降低，如500 μmol/L的ABA 施用5 d后，葉綠素a、b含量分別比對(duì)照顯著降低32.56%和29.73%，類(lèi)胡蘿卜素則比對(duì)照顯著降低8.00%，說(shuō)明噴施ABA能促使葉片中葉綠素降解。因此，我們?cè)诤罄m(xù)試驗(yàn)中選取10 μmol/L的ABA為試驗(yàn)濃度。

表1 常溫等日照下外源ABA處理對(duì)四季秋海棠葉片花色素苷含量及相關(guān)酶活性的影響

注：同列不同小寫(xiě)字母表示處理間差異達(dá)到0.05顯著水平;下同

Note: Different letters in the same column indicate significant differences among treatments at 0.05 level; the same as below

表2 常溫等日照下外源ABA處理對(duì)四季秋海棠葉片內(nèi)源激素及色素苷含量的影響

CK.不噴施ABA；L. 長(zhǎng)日照(16 h/8 h)；Q. 等日照(12 h/12 h)；S. 短日照(8 h/16 h)。下同圖1 低溫不同光周期下外施10 μmol/L ABA對(duì)四季秋海棠花色素苷含量的影響CK.Control,without exogenous ABA；L. Long-day(16 h/8 h)；Q. Intermediate-day(12 h/12 h)；S. Short-day(8 h/16 h).The same as belowFig.1 Effect of 10 μmol/L exogenous ABA on anthocyamin content in leaves of B. semperflorens under low temperature and different photoperiodic treatment

2.2 低溫不同光周期下外源ABA對(duì)花色素苷含量及相關(guān)酶活性的影響

前期研究表明，四季秋海棠的綠葉品種‘超級(jí)奧林匹克’在秋季時(shí)葉片因積累花色素苷而變紅[16]，這不僅是低溫的作用[17]，也是短日照的作用，因?yàn)樵诓贿m宜光周期(長(zhǎng)日照和等日照)下，即使給予低溫也不能誘導(dǎo)花色素苷合成[18]。在低溫條件下(白天/夜晚：15 ℃/6 ℃)，短日照處理(S)促進(jìn)了四季秋海棠葉片明顯變紅，而同期的長(zhǎng)日照(L)和等日照(Q)處理并未使四季秋海棠葉片變紅(圖1，A)；同時(shí)，短日照處理(CK+S)的花色素苷含量顯著高于其余處理，分別是長(zhǎng)日照(CK+L)和等日照(CK+Q)處理的1.73和1.82倍(圖1，B)。在同樣的低溫下，同時(shí)外施10 μmol/L的ABA之后，不論是短日照(ABA+S)、等日照(ABA+Q)還是長(zhǎng)日照(ABA+L)，四季秋海棠葉片都呈現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紅色，同時(shí)它們?nèi)~片花色素苷含量較相應(yīng)的對(duì)照處理(單獨(dú)低溫處理)顯著增加，但仍以短日照處理顯著較高(圖1，A、B)。相應(yīng)地，四季秋海棠葉片花色素苷合成酶和運(yùn)輸酶的活性也在噴施ABA之后較對(duì)照(單獨(dú)低溫處理)顯著增加，尤其是DFR和UFGT活性在長(zhǎng)日照條件下噴施ABA之后分別提高了5.20%、7.57%，在短日照條件下分別增加了6.41%、18.71%，在等日照條件下分別提高了10.60%和19.20%；另外，各日照處理間相比較，仍以短日照處理葉片各相關(guān)酶活性顯著較高(表3)。這說(shuō)明ABA在低溫和不適宜光周期條件下，直接促進(jìn)花色素苷合成下游的DFR和UFGT酶的增加，進(jìn)而促進(jìn)了花色素苷的合成和積累，從而驗(yàn)證了關(guān)于“低溫短日照條件下誘導(dǎo)四季秋海棠葉片合成花色素苷的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)可能是ABA積累的推測(cè)。

表3 低溫不同光周期下外施10 μmol/L ABA對(duì)四季秋海棠花色素苷相關(guān)合成酶和轉(zhuǎn)移酶活性的影響

2.3 低溫不同光周期下外源ABA對(duì)四季秋海棠葉片內(nèi)源ABA和GA含量的影響

圖2 低溫不同光周期下外施10 μmol/L ABA后四季秋海棠ABA和GA含量Fig.2 ABA and GA contents under low temperature and different photoperiodic treatments with and without 10 μmol/L ABA on leaves of B. semperflorens

外源噴施ABA增加四季秋海棠葉片的內(nèi)源ABA含量，而抑制內(nèi)源GA含量，從而提高ABA/GA的比值(圖2)。其中，在單獨(dú)低溫條件下，短日照處理四季秋海棠葉片的內(nèi)源ABA含量比長(zhǎng)、等日照處理顯著較高，而內(nèi)源GA含量澤顯著較低，從而致使其ABA/GA的比值也顯著較高；與單獨(dú)低溫處理對(duì)照組相比較，四季秋海棠葉片內(nèi)源ABA含量在長(zhǎng)、等、短日照處理分別顯著增加12.35%、20.00%、10.59%，而內(nèi)源GA含量卻分別降低了7.61%、20.00%、25.00%，內(nèi)源ABA/GA的比值則明顯上升。因此，外源ABA調(diào)整了植物體內(nèi)源激素的比例，使植物體內(nèi)具有較高的內(nèi)源ABA含量和較低GA的含量，內(nèi)源ABA/GA的比值顯著升高。

圖3 低溫不同光周期下外施10 μmol/L ABA對(duì)四季秋海棠葉片NADPH/NADP+比值變化Fig.3 NADPH/NADP+ ratio differences under low temperature and different photoperiodic treatments with and without 10 μmol/L ABA on leaves of B. semperflorens

2.4 低溫不同光周期下外源ABA對(duì)四季秋海棠葉片NADPH和NADP+含量的影響

在花色素苷合成的途徑中，DFR對(duì)花色素苷的最終形成起決定性作用，其反應(yīng)需要NADPH參與[19]。由圖3可知，外源ABA雖未顯著提高低溫和不適宜的光周期(長(zhǎng)、等日照)下四季秋海棠葉片的NADPH+NADP+的總量，但卻顯著增加了NADPH的含量(分別比對(duì)照提高了6.58%和11.72%)，因此NADPH/NADP+比值顯著增加。這說(shuō)明外源ABA處理后促進(jìn)植物體內(nèi)的NADP+向NADPH轉(zhuǎn)變，因此為DFR催化二氫類(lèi)黃酮醇生成無(wú)色花青素提供H+，從而啟動(dòng)了DFR的活性，進(jìn)而促進(jìn)花色素苷的合成。該結(jié)果驗(yàn)證了我們的推測(cè)：低溫下不同光周期處理對(duì)四季秋海棠葉片花色素苷的誘導(dǎo)差異的物質(zhì)基礎(chǔ)是ABA，即低溫短日照條件誘導(dǎo)四季秋海棠葉片合成花色素苷的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)是ABA的積累。

3 討 論

通過(guò)考察外施ABA對(duì)四季秋海棠花色素苷合成的影響，發(fā)現(xiàn)不同濃度外源ABA處理下四季秋海棠花色素苷合成關(guān)鍵酶的變化趨勢(shì)與花色素苷含量的動(dòng)態(tài)趨勢(shì)基本相吻合，較低濃度ABA(5～10 μmol/L)促進(jìn)花色素苷合成酶(PAL、CHI、DFR和UFGT)及運(yùn)輸酶(GST)活力的提高，進(jìn)而提高了花色素苷的含量，表明ABA是通過(guò)調(diào)節(jié)花色素苷合成的關(guān)鍵酶來(lái)調(diào)控四季秋海棠葉片花色素苷的合成。而較高濃度的外源ABA(50、100、500 μmol/L)則對(duì)這些酶的活力沒(méi)有顯著影響，因此沒(méi)有花色素苷的生成。

在本試驗(yàn)中，低濃度的外源ABA通過(guò)啟動(dòng)花色素苷合成相關(guān)的酶(PAL、CHI、DFR和UFGT)和運(yùn)輸酶(GST),顯著誘導(dǎo)了花色素苷在四季秋海棠葉片中的合成和積累。有研究表明，ABA的合成在果皮花色素苷的積累過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用[20]，900 mg/L的ABA處理能顯著提高葡萄果實(shí)中的花色素苷含量[21]；雷鳴等也發(fā)現(xiàn)1 000 mg/L的ABA對(duì)紅地球葡萄果實(shí)的花色素苷具有明顯的促進(jìn)作用[22]。本試驗(yàn)研究表明低溫、不同光周期條件下外源10 μmol/L ABA明顯增加四季秋海棠葉片花色素苷的積累，這說(shuō)明低溫不同光周期條件下10 μmol/L ABA對(duì)四季秋海棠葉片花色素苷的積累有明顯的促進(jìn)作用，且花色素苷積累量與光周期密切相關(guān)，短日照時(shí)花色素苷積累量最大而長(zhǎng)日照時(shí)積累量最小。

外施ABA處理能夠調(diào)節(jié)植物體內(nèi)ABA和GA的平衡，進(jìn)而調(diào)控花色素苷的形成[23]，本試驗(yàn)中外源ABA 對(duì)四季秋海棠葉片花色素苷的合成誘導(dǎo)可能是通過(guò)提高內(nèi)源的ABA含量，并降低GA的含量來(lái)實(shí)現(xiàn)的。低溫條件下，只有短日照啟動(dòng)了花色素苷合成及運(yùn)輸相關(guān)的酶活性，并誘導(dǎo)花色素苷顯著積累，葉片顯著變紅,這可能與低溫和短日照條件能顯著誘導(dǎo)植物體內(nèi)ABA含量增加有關(guān)。而在低溫條件下，長(zhǎng)日照和等日照處理植株體內(nèi)的ABA 含量較低，而GA含量較高，因此花色素苷相關(guān)的合成酶和運(yùn)輸酶未被啟動(dòng)，因此沒(méi)有花色素苷的合成。

花色素苷的生物合成過(guò)程中，要通過(guò)花色素苷合成關(guān)鍵酶(PAL、CHI、DFR 和 UFGT)相互協(xié)調(diào)，使花色素苷合成過(guò)程順利進(jìn)行。郭磊等[24]研究發(fā)現(xiàn)ABA參與了花色素苷合成的調(diào)控，對(duì)花色素苷合成具有促進(jìn)作用。ABA還能通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，進(jìn)而提高酶的活性，最終促進(jìn)花色素苷合成。本試驗(yàn)中，ABA處理后長(zhǎng)日照和等日照下的四季秋海棠葉片花色素苷合成酶和運(yùn)輸酶活性顯著提高，尤其是提高花色素苷合成途徑中下游的DFR和UFGT活性，DFR在花色素苷合成的途徑中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，與花色的產(chǎn)生直接相關(guān)[25]。因此，噴施ABA能夠誘導(dǎo)低溫長(zhǎng)日照和等日照處理下的四季秋海棠葉片合成花色素苷，關(guān)鍵因素可能在于對(duì)DFR活性的誘導(dǎo)。DFR是將二氫黃酮醇轉(zhuǎn)化為花色素反應(yīng)的第一個(gè)酶，它以不同二氫類(lèi)黃酮醇為底物，利用輔因子NADPH中的H將4位的羰基還原為羥基[18]，以轉(zhuǎn)化生成相對(duì)應(yīng)的不穩(wěn)定的無(wú)色花青苷元，然后這些無(wú)色花青苷元在ANS,3GT催化下分別形成花青素、花葵素、花翠素。因此DFR活性的啟動(dòng)與否與NADPH的含量有直接關(guān)系，NADPH含量及NADPH/NADP+比值的增加為DFR提供足夠的H供體，因此能啟動(dòng)DFR活性。本試驗(yàn)中，低溫短日照處理下葉片NADPH的含量較長(zhǎng)日照和等日照處理的高，NADPH/NADP+的比例也較高，因此DFR活性被啟動(dòng)，相應(yīng)地，其下游的UFGT活性也顯著增加，花色素苷最終合成；而低溫長(zhǎng)日照或等日照處理的植株，在外源噴施ABA之后，NADPH含量和NADPH/NADP+的比例顯著增加，因此DFR和UFGT被啟動(dòng)，誘導(dǎo)花色素苷合成。

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，低溫不同光周期條件下外施10 μmol/L ABA 增加了 四季秋海棠葉片NADPH/NADP+比值，這說(shuō)明外施 ABA 增加了 DFR 還原反應(yīng)的 H 供體的NADPH 含量，這可能是提高 DFR活性的一個(gè)重要因素。因此，DFR對(duì)花色素苷的最終形成起決定性作用。

綜上所述，不同濃度ABA對(duì)四季秋海棠花色素苷合成關(guān)鍵酶的變化趨勢(shì)與花色素苷含量的動(dòng)態(tài)趨勢(shì)相吻合，較低濃度ABA促進(jìn)花色素苷合成酶PAL、CHI、DFR和UFGT活力的提高，進(jìn)而提高了花色素苷的含量，而較高的濃度則抑制了PAL、CHI、DFR和UFGT酶活力，抑制了花色素苷的生成，這說(shuō)明ABA通過(guò)調(diào)節(jié)花色素苷合成的關(guān)鍵酶來(lái)影響花色素苷的合成。外源ABA在低溫不同光周期條件下能使花色素苷含量、相關(guān)酶活性、ABA/GA提高，但對(duì)葉綠素含量和GA含量卻有抑制作用，尤其在低溫短日照條件效果更顯著。因此，ABA處理可作為一種有效的方法，用于葉片著色機(jī)制的研究。

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(編輯:裴阿衛(wèi))

Mechanism of ABA-induced Anthocyanin Biosynthesis in Begoniasemperflorens under Different Photoperiods and Low Temperatures

GUO Meili, WANG Jiawan, WANG Ke, JIN Huihui, ZHANG Kaiming*

(Forestry College, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450000, China)

Taking the ‘Super Olympic’BegoniaSemperflorensas material, at room temperature (25 ℃/15 ℃) under normal sunshine condition or low temperature (15 ℃/6 ℃) under the different photoperiods, we sprayed the plants with abscisic acid (ABA). The endogenous pigment content, hormone contents and enzyme activities were comparatively analyzed to discuss the effects of exogenous ABA on anthocyanin biosynthesis and its mechanism. The results showed: (1) at room temperature and normal sunshine condition, the leaves will get red obviously on the 3th days when applying ABA (5 and 10 μmol/L). The anthocyanin content and endogenous ABA content of pigment increased significantly, while the endogenous gibberellin (GA) content decreased significantly. The anthocyanin biosynthesis and trans portation also increased significantly. (2) Under the condition of low temperature, the anthocyanin accumulation was closely related to photoperiod and the anthocyanin accumulation was the largest in short day; The anthocyanin accumulation in sunshine condition also increased, but there was no significant difference between sunshine and long sunshine. (3) The addition of 10 μmol/L ABA treatment increased the content of H donor NADPH in DFR reduction under long day and sunshine condition. Under low temperature treatment, the activities of DFR and UFGT enzymes increased and then increased the anthocyanin content. In addition, exogenous ABA treatment could increase endogenous ABA content and decrease the content of endogenous GA in low temperature and different photoperiod treatments, which was consistent with the production of anthocyanin. The results showed that exogenous ABA can affect the synthesis of anthocyanins by regulating key enzyme in anthocyanin synthesis of flowers. The application of suitable concentration of ABA can promote theB.semperflorensleaf anthocyanin accumulation and can be used to control leaf coloring in actual production.

Begoniasemperflorens; abscisic acid; anthocyanin; low temperature；photoperiod

1000-4025(2016)10-1999-09

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.10.1999

2016-05-19;修改稿收到日期:2016-10-15

國(guó)家自然科學(xué)基金(311101562)

郭美麗(1989-)，女，碩士，主要從事園林植物生長(zhǎng)發(fā)育與調(diào)控。E-mail:1278658212@qq.com

*通信作者:張開(kāi)明，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要園林植物生長(zhǎng)發(fā)育與調(diào)控。E-mail:miss1199@126.com

Q945.18; Q945.78

A