楊永義+張華+宣寧

摘要：以華130B為稻瘟病抗性基因的供體、圣稻15為受體，通過回交轉(zhuǎn)育結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇，選育出綜合性狀優(yōu)良的Pi1單基因株系4個、Pi2單基因株系3個、Pi1和Pi2雙基因聚合系3個。稻瘟病田間抗性自然鑒定結(jié)果表明，單基因系抗級為3級，表現(xiàn)為中抗；雙基因聚合系抗級為1級，表現(xiàn)為高抗；而對照圣稻15抗級為7級，表現(xiàn)為高感。說明通過分子標(biāo)記輔助選擇轉(zhuǎn)育Pi1和Pi2基因能顯著提高水稻稻瘟病抗性，同時表明雙基因聚合系抗性明顯好于單基因系。

關(guān)鍵詞：水稻；稻瘟?。环肿訕?biāo)記輔助選擇；抗性鑒定

中圖分類號：S511.2+20.34 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2016）11-0018-04

Abstract Using Hua 130B as donor of rice blast resistance genes and Shengdao 15 as recipient， ten lines including four lines with Pi1 gene， three lines with Pi2 gene and three double gene-pyramided lines were developed by back-cross breeding with molecular marker-assisted selection， and these lines showed desirable agronomic traits in the field. The natural evaluation results of rice blast resistance in field showed that the disease resistance grade of single gene lines and double gene-pyramided lines were 3 and 1 respectively， showing high resistance. The resistance grade of Shengdao 15 was 7， so it was highly susceptible. This research indicated that breeding of Pi1 and Pi2 using molecular marker-assisted selection could significantly improve the resistance to rice blast， and it also showed that the resistance of double gene-pyramided lines was significantly better than that of single gene lines.

Keywords Rice； Rice blast； Molecular marker-assisted selection； Resistance identification

稻瘟病是由稻瘟病菌（Magnaporche oryzae）引起的水稻生產(chǎn)上的重要病害之一，在世界范圍內(nèi)都有不同程度的發(fā)生，嚴(yán)重的甚至顆粒無收[1]。在我國水稻產(chǎn)區(qū)，稻瘟病呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，成為最主要的病害，給水稻生產(chǎn)造成巨大損失[2，3]。用化學(xué)農(nóng)藥防治稻瘟病，不僅會使種植成本升高，還會造成農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染。培育和種植帶有稻瘟病廣譜抗性基因的水稻是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效的方法[4]。

近年來，水稻稻瘟病的研究越來越受到人們重視。目前已鑒定出68個稻瘟病基因座上的83個主效基因，其中23個稻瘟病基因已被克隆[5]。Pi1和Pi2是兩個稻瘟病抗性廣譜基因，對我國不同稻瘟病菌生理小種具有廣譜抗性，已被應(yīng)用于水稻育種中[6-8]。劉士平等（2003）[9]對Pi1、Pi2和Pi3基因進(jìn)行聚合和接種鑒定，大大提高了水稻品種對稻瘟病的抗性。柳武革等[6]利用分子標(biāo)記輔助選擇對Pi1和Pi2基因進(jìn)行轉(zhuǎn)育和聚合，培育出5個純合的雙基因聚合系，綜合抗性達(dá)到高抗水平。胡杰等[8]利用分子標(biāo)記輔助選擇將Pi1和Pi2聚合到保持系97B中，在田間自然發(fā)病條件下，雙基因聚合系穗頸瘟的抗性為1級，表現(xiàn)為高抗。陳紅旗等[7]將Pi1、Pi2和Pi3聚合到保持系金23B中，育成的改良系大大提高了對稻瘟病的抗性。隨著研究的深入，越來越多的稻瘟病抗性基因被挖掘、定位和克隆，加上成熟的分子標(biāo)記輔助選擇體系，為稻瘟病抗性基因的利用提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。拓寬稻瘟病抗性基因資源，提高黃淮區(qū)水稻品種對稻瘟病的抗性，是黃淮區(qū)水稻生產(chǎn)中亟待解決的問題。

本研究利用攜帶抗稻瘟病基因Pi1和Pi2的華130B為供體親本，以黃淮區(qū)主栽品種圣稻15為受體親本，通過回交轉(zhuǎn)育和分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，以期培育出綜合性狀優(yōu)良、抗稻瘟病的粳稻新品系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

攜帶抗稻瘟病基因Pi1和Pi2的供體親本華130B，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室何予卿教授提供，受體圣稻15由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 雜交和選擇程序

以圣稻15作母本、華130B作父本雜交獲得F1代雜交種，然后以圣稻15作輪回親本連續(xù)回交3次，再自交3次獲得 BC3F4株系。在回交過程中從BC1F1開始用分子標(biāo)記檢測抗稻瘟病基因Pi1和Pi2，選擇帶有目的基因且農(nóng)藝性狀偏向圣稻15的單株作母本。在 BC3F4中選擇農(nóng)藝性狀優(yōu)良的株系進(jìn)行Pi1和Pi2目的基因的檢測，選出純合穩(wěn)定的株系。

1.3 Pi1、Pi2基因的分子標(biāo)記檢測

Pi1基因的分子標(biāo)記檢測是利用緊密連鎖的SSR標(biāo)記RM144（RM144 F：5′-TGCCCTGGCGCAAATTTGATCC-3′；RM144R：5′-GCTAGAGGAGATCAGATGGTAGTGCATG-3′）和RM224（RM224F：5′-ATCGATCGATCTTCACGAGG-3′，RM224R：5′-TGCTATAAAAGGCATTCGGG-3′）。Pi2基因的分子標(biāo)記檢測是利用緊密連鎖的SSR標(biāo)記PI31（PI31 F： 5′-ATCCAAACCCGTTGTTGCAC-3′，PI31 R： 5′-CGGCAATTGCCACGATGATA-3′）。

20 μL PCR反應(yīng)體系包括模板DNA 1 μL， 10 mmol/L dNTPs 0.15 μL，Taq酶1.5 U， 10×PCR buffer （with MgCl2） 2 μL，2 μmol/L引物1.5 μL，其余用ddH2O補(bǔ)齊。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸5 min[10]。反應(yīng)產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺上電泳，經(jīng)硝酸銀甲醛溶液銀染[11]后觀察結(jié)果。

1.4 稻瘟病抗性鑒定

2015年在山東省濟(jì)寧市喻屯鎮(zhèn)陳莊農(nóng)場稻瘟病重發(fā)區(qū)進(jìn)行稻瘟病自然誘發(fā)試驗(yàn)，對BC3F4代10個穩(wěn)定株系進(jìn)行鑒定，陽性對照為供體親本華130B，陰性對照為受體親本圣稻15，每份材料種植50株。不用任何農(nóng)藥，田間從抽穗到成熟，一直有3～5 cm的水層，保持田間濕潤，易于稻瘟病的發(fā)生，于水稻成熟期進(jìn)行田間稻瘟病發(fā)病情況調(diào)查。稻瘟病抗性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照楊仕華等[12]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pi1和Pi2基因純合株系的獲得

首先，利用與Pi1和Pi2基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記RM144和PI31對抗性基因供體親本華130B和受體親本圣稻15進(jìn)行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)RM144和PI31在供體和受體親本中有多態(tài)性。然后利用RM144和PI31進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇。先利用RM144和PI31對F1植株進(jìn)行擴(kuò)增，選擇帶型為雜合帶的真雜種與圣稻15回交得到BC1F1。對BC1F1單株繼續(xù)進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定，選擇帶有Pi1和Pi2基因的單株，用圣稻15作父本，繼續(xù)回交，得到BC2F1。在BC2F1繼續(xù)選擇陽性株進(jìn)行回交，得到BC3F1。然后自交，對其BC3F2至BC3F4代，利用SSR標(biāo)記對分離群體進(jìn)行擴(kuò)增（圖1、2，以BC3F2為例），選擇帶有Pi1和Pi2基因的單株，每代分單株收獲后按株系種植，成熟后選擇農(nóng)藝性狀優(yōu)良的單株。在BC3F4代獲得Pi1和Pi2基因純合的株系，其中獲得帶有Pi1基因的純合穩(wěn)定株系8個、帶有Pi2基因的純合穩(wěn)定株系9個、帶有Pi1和Pi2雙基因的純合穩(wěn)定株系5個。根據(jù)農(nóng)藝性狀表現(xiàn)，選出綜合性狀優(yōu)良的Pi1單基因株系4個、Pi2單基因株系3個、Pi1和Pi2雙基因聚合系3個，進(jìn)行稻瘟病田間抗性鑒定。

2.2 Pi1和Pi2單基因純合系及雙基因聚合系稻瘟病抗性鑒定

2015年在濟(jì)寧市喻屯鎮(zhèn)陳莊農(nóng)場稻瘟病重發(fā)區(qū)對10個帶有單基因和雙基因的穩(wěn)定純合株系進(jìn)行稻瘟病抗性鑒定。結(jié)果表明，10個株系的抗病等級為1～3，表現(xiàn)為抗，其抗性與供體親本華130B在同一個水平上，而圣稻15表現(xiàn)為感，抗病等級為7（表1）。從表1可以看出，含不同抗性基因的材料對稻瘟病菌表現(xiàn)出不同的抗性，單基因系對稻瘟病菌的抗病等級為3級，雙基因系對稻瘟病的抗病等級為1級，兩基因累加系的抗性明顯強(qiáng)于單基因系。根據(jù)本研究，Pi1和Pi2轉(zhuǎn)育材料對山東稻瘟病菌群的抗性有明顯的提高，說明利用分子標(biāo)記輔助選擇培育帶有Pi1和Pi2稻瘟病抗性基因的水稻材料可以有效提高水稻品種對稻瘟病的抗性。

3 討論

山東省生產(chǎn)上應(yīng)用的水稻品種稻瘟病抗性不強(qiáng)，特別是一些近幾年生產(chǎn)上審定的品種，田間也表現(xiàn)高感稻瘟病，限制了其推廣應(yīng)用。2015年參加山東省區(qū)試的水稻品種經(jīng)稻瘟病菌接種鑒定，僅有一個品種抗病級別達(dá)到3級，其余都在5～9級。本研究以帶有Pi1和 Pi2的華130B為供體親本，通過回交轉(zhuǎn)育培育的帶有Pi1 和 Pi2的單基因系和雙基因系，抗性級別達(dá)到3級或3級以上，與對照品種圣稻15相比，稻瘟病抗性得到了明顯改良。下一步我們將利用這些材料進(jìn)行進(jìn)一步的轉(zhuǎn)育，培育農(nóng)藝性狀優(yōu)良的高抗稻瘟病水稻新品系。

參 考 文 獻(xiàn)：

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