張晨，王長生，李春雪，董紅嬌，瞿燕

·炮制制劑·

透骨散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

張晨1，王長生2，李春雪1，董紅嬌2，瞿燕1

目的：建立透骨散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用TLC法對透骨散中黃柏、芫花、大黃、沒藥進行定性鑒別；采用顯微鑒別方法對透骨散中黃柏、芫花、大黃、白芷、紅大戟、紫花地丁進行了鑒別；采用HPLC測定透骨散中鹽酸小檗堿的含量，色譜柱Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm） 流動相甲醇-2.2%醋酸水（40:60），柱溫25 ℃，檢測波長265 nm。結(jié)果：定性鑒別中檢出黃柏、芫花、大黃、白芷、沒藥，分離度好、專屬性強且陰性無干擾。鹽酸小檗堿線性范圍為0.0875～1.4 μg（R2=0.9999），平均加樣回收率 99.57%（RSD 0.55%）。結(jié)論：建立的質(zhì)量控制方法操作簡單、重復(fù)性好，可較好的控制透骨散的質(zhì)量，為該制劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

透骨散；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；鹽酸小檗堿；

透骨散為臨床使用20多年的有效經(jīng)驗方，該方由黃柏、芫花、白芷、大黃、沒藥等八味中藥組成。臨床上用于骨髓炎，結(jié)核，冷膿腫等，療效確切且經(jīng)濟實用。為控制臨床用藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保證其安全性和有效性，本研究對該制劑中黃柏、芫花、大黃、沒藥進行了薄層色譜鑒別，增加了顯微鑒別研究，同時采用高效液相色譜法測定了方中有效成分鹽酸小檗堿含量，為有效地控制該制劑的質(zhì)量提供實驗依據(jù)。

1 材料

Waters 2695型高效液相色譜儀（2996 PDA 檢測器，Empower 化學(xué)工作站，美國），KQ5200E型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司），METILER AE240S 型電子天平（梅特勒-托利上海有限公司），Leica DM 2000 生物顯微鏡（Leica Microsystems CMS GmbH）。透骨散（由成都中醫(yī)藥大學(xué)制劑教研室提供，批號20140407，20140102，20140530），鹽酸小檗堿（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號121128），黃柏、芫花、大黃、膠質(zhì)沒藥對照藥材及大黃酸、大黃素（中國藥品生物制品鑒定所，批號分別為121510-201105，121062-200602，120984-201202，121250-201104，110757-200206，110756-200110）。甲醇為色譜（ΟCEANPAK），水為樂百氏純凈水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 黃柏[1]取透骨散10 g，加1%醋酸甲醇溶液40 mL，于60 ℃超聲處理20 min，濾過，濾液揮干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。取缺黃柏陰性制劑，同法制成陰性對照溶液。另取黃柏對照藥材0.2 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法（2010年版《中國藥典》一部附錄Ⅵ B）試驗，吸取上述三種溶液5～6 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（30:15:4)的下層溶液為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，且陰性無干擾。見圖1。

2.1.2 芫花 取透骨散10 g，加石油醚（30～60℃）20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液揮干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取缺芫花陰性制劑，同法制成陰性對照溶液。另取芫花對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法（2010年版《中國藥典》一部附錄Ⅵ B）試驗，吸取上述三種溶液5～6 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯(10:1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，且陰性無干擾。見圖2。

圖2 芫花TLC鑒別圖

2.1.3 大黃[2]取透骨散10 g，加甲醇20 mL，冷浸1 h，濾過，濾液揮干，殘渣加甲醇10 mL使溶解，再加鹽酸1 mL，加熱回流30 min，立即冷卻，溶液用乙醚萃取2次，每次20 mL，合并乙醚層，揮干，殘渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作為供試品溶液。取缺大黃陰性制劑，同法制成陰性對照溶液。另取大黃對照藥材0.3 g，加甲醇10 mL，同法制成對照藥材溶液。再取大黃素及大黃酸對照品，分別加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（2010年版《中國藥典》一部附錄Ⅵ B）試驗，吸取上述四種溶液5～6 μL，分別點于同一硅膠H薄層板上，以石油醚(30～60 ℃)-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(302 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材、對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，置氨蒸汽中熏后，斑點變?yōu)榧t色，且陰性無干擾。見圖3。

圖3 大黃TLC鑒別圖

2.1.4 沒藥[3]取透骨散30 g，加10倍量的水，照揮發(fā)油測定法(2010年版《中國藥典》一部附錄X D乙法）加環(huán)己烷2 mL，緩緩加熱至沸，并保持微沸約2.5 h，放冷，取環(huán)己烷層作為供試品溶液。取缺沒藥陰性制劑，同法制成陰性對照溶液。另取膠質(zhì)沒藥對照藥材2 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法（2010年版《中國藥典》一部附錄Ⅵ B）試驗。吸取上述三種溶液各5～6 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙醚（4:1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯現(xiàn)同顏色的斑點，且陰性無干擾。見圖4。

圖4 沒藥TLC鑒別圖

2.2 顯微鑒別[4]

本品為黃色粉末，置顯微鏡下觀察[5]，纖維鮮黃色，直徑16～38 μm，常成束，周圍細(xì)胞含草酸鈣方晶，形成晶纖維（黃柏）。油管多已破碎，含淡黃棕色分泌物（白芷）。花粉粒黃色，類球形，直徑23～45 μm，表面有較明顯的網(wǎng)狀雕紋，萌發(fā)孔多數(shù)，散在（芫花）。草酸鈣針晶束散在或存于粘液細(xì)胞中（紅大戟）。草酸鈣簇晶較大，直徑20～160 μm，有的至190 μm（大黃）。非腺毛，長32～240 μm，直徑24～32 μm，具角質(zhì)短線紋（紫花地?。?，結(jié)果見圖5。

圖 5 透骨散顯微特征圖（10×40）

2.3 鹽酸小檗堿的含量測定[5]

2.3.1 色譜條件 色譜柱Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相甲醇-2.2%醋酸水（40:60）流速1 mL．min-1，柱溫25 ℃，檢測波長265 nm，進樣量10 μL，見圖6。

圖6 透骨散HPLC圖

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿（C20H17NΟ4·HCl）對照品適量，置于量瓶中，加甲醇制成每1 mL含0.14 mg的對照品溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 取本品1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放至室溫，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過；精密量取濾液0.5 mL，置量瓶中，精密加入甲醇14.5 mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 陰性溶液的制備 按處方比例稱取藥材，根據(jù)透骨散制備方法制成缺黃柏的陰性對照樣品，按照“2.3.3”項下方法制成缺黃柏陰性溶液。

2.3.5 線性關(guān)系考察 精密量取對照品溶液適量，用甲醇稀釋，得到不同質(zhì)量濃度的鹽酸小檗堿對照品溶液，分別吸取各溶液10 μL，按“2.3.1”項下色譜條件測定。以進樣濃度（mg．mL-1）為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到鹽酸小檗堿回歸方程y=2E+07x-21788（R2=0.999 9），線性范圍0.0875～1.4 μg。

2.3.6 精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液10 μL，按“2.3.1”項下色譜條件連續(xù)進樣5次，結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積 RSD為0.73%，表明儀器精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于0、2、4、8、12、24 h按“2.3.1”項下色譜條件進樣，結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積RSD為0.86%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 重復(fù)性試驗 取透骨散（批號20140407）6份，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.3.1”項下色譜條件測定，測得制劑中鹽酸小檗堿平均含量為15.94 mg．g-1（RSD為0.71%），表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗 取已知含量的透骨散（批號20140407）6份，分別加入鹽酸小檗堿對照品適量，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.3.1”項下色譜條件測定，結(jié)果見表1，表明該方法回收率良好。

表1 透骨散中鹽酸小檗堿含量測定的加樣回收試驗

2.3.10 樣品測定 取透骨散3批，2份/批，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件測定，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果

3 討論

課題組除了對透骨散中黃柏、芫花、大黃、沒藥進行薄層鑒別之外，還對方中剩余藥材紅大戟、紫花地丁、白芷、乳香進行了薄層鑒別研究，通過改變供試品的制備方法、采用不同的展開系統(tǒng)、顯色劑和檢視條件，但效果都不理想，因此后者的薄層鑒別暫不作為該制劑的質(zhì)控方法；為更全面的對制劑進行定性鑒別，本研究增加了黃柏、芫花、大黃、白芷、紅大戟、紫花地丁的顯微定性鑒別。

色譜條件曾考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-水、甲醇-2.2%醋酸水等流動相體系，最終確立了最優(yōu)的流動相體系為甲醇-2.2%醋酸水（40:60），柱溫25 ℃，檢測波長265 nm。

根據(jù)透骨散工藝研究結(jié)果，從3個批次樣品中鹽酸小檗堿的含量測定結(jié)果可見，鹽酸小檗堿均能很好檢出，各批次間樣品含量介于14.6-18.7 mg．g-1?？紤]使用的藥材批間差異等因素，每1 mg樣品中鹽酸小檗堿含量限度計算如下：樣品中鹽酸小檗堿含量限度=黃柏藥材處方量（g）×黃柏藥材含鹽酸小檗堿限度×鹽酸小檗堿提取率限度/制備量（g）=90 g×3.0%×90% /690 g≈3.52 mg．g-1，故暫定本品每1 g含黃柏以鹽酸小檗堿（C20H17NΟ4·HCl）計不得少于3.52 mg。

[1] 丁兆朋,郝智慧,楊芬芳,等. 黃白止痢顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志,2013,19(17):117-120.

[2] 王賢兒,鐘希文,張文霞,等. 蛇黃散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[J]. 中成藥,2014, 36(9):1867-1872.

[3] 國家藥典委員會. 中華人民共和國:2010年版一部[S]. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:22.

[4] 李萍,錢忠直主編. 中華人民共和國藥典中藥材顯微鑒別彩色圖鑒[M]. 北京:人民衛(wèi)生出版社,2009.01.

[5] 唐艷梅,葉萌,向麗,等. HPLC測定黃柏中的鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬丁和鹽酸藥根堿[J]. 華西藥學(xué)雜志,2006,21(3):265-267.

（責(zé)任編輯：傅舒）

Study on the quality standard of Tougu Powder/

ZHANG Chen1, WANG Chang-sheng2, LI Chun-xue1, DONG Hong-jiao2, QU Yan1/ / (1.School of Pharmacy , Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan; 2.College of Chemistry &Environment Protection Engineering, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041,China)

Objective: To establish the quality standard of Tougu Powder. Method: Huangbo, Yuanhua, Dahuang and Moyao in Tougu Power were identified qualitatively by TLC. Microscopic identification of Huangbo, Yuanhua, Dahuang, Baizhi, Hongdaji, and Zihuadiding in Tougu Powder was carried out. Berberine hydrochloride content in Tougu Powder was determined by HPLC. The analysis was carried on a Diamonsil C18(250 mm ×4.6 mm, 5μm) column. The mobile phase was composed of methanol and 2.2% acetic acid water (40:60). The column temperature was 25℃ and detection wavelength was set at 265 nm. Result:Huangbo, Yuanhua, Dahuang, Baizhi and Moyao were detected by qualitative identification, which had good separation, strong specificity and had no negative interference. The linear range ofberberine hydrochloride was 0.0875～1.4 μg（R2=0.9999）with the average recoveries of 99.57% (RSD 0.55%). Conclusion: The method is simple, rapid and accurate, which can be used as Tougu Powder's quality control method.

Tougu Powder; quality standard; berberine hydrochloride

R283.3

A

1674-926X(2016)04-008-04

“十二五”科技部支撐計劃（2012BAI27B07），四川省科技廳科技基礎(chǔ)項目（2015JY0139）

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137；2.西南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境保護工程學(xué)院，四川 成都 610041

張 晨，在讀碩士，從事中藥炮制與制劑研究

Tel:18782916423 Email:m18782916423@163.com

瞿燕，博士，副教授，從事中藥炮制與制劑研究工作

Tel:028-61800231 Email:quyan028@126.com

2015-09-10