羅亞坤，練斯南，藺文成,梁琳，史利軍，趙占中，白挨泉，崔尚金

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京海淀100193；2.農(nóng)業(yè)部獸用藥物與獸醫(yī)生物技術(shù)北京科學(xué)觀測實驗站，北京海淀100193；3.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東佛山528231；4.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，廣東廣州510642）

兩廣部分地區(qū)仔豬腹瀉死亡的流行病學(xué)調(diào)查

羅亞坤1,2，練斯南1,3，藺文成4,梁琳1,2，史利軍1,2，趙占中1,2，白挨泉3，崔尚金1，2

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京海淀100193；2.農(nóng)業(yè)部獸用藥物與獸醫(yī)生物技術(shù)北京科學(xué)觀測實驗站，北京海淀100193；3.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東佛山528231；4.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，廣東廣州510642）

研究旨在分析廣東、廣西地區(qū)2015年1—10月份腹瀉仔豬群中豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）發(fā)病情況和流行特征，以便為今后的防控提供理論數(shù)據(jù)。分別采用RT-PCR檢測PEDV、用NanoPCR方法檢測PRV，對2015年1—10月份廣東、廣西地區(qū)7個地市臨床送檢的56份組織樣品（包括心、肝、脾、肺、腎、淋巴等，其中有35份含有小腸樣品）進(jìn)行病原核酸檢測。病原核酸檢測結(jié)果顯示：PEDV的陽性率為14.28%，PRV的陽性率為53.6%；PEDV與PRV混合感染率為8.57%。對PEDV陽性樣品的S1基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，研究獲得PEDV陽性樣品的S1基因與2015年廣東分離的CH-HGC-01-2015的親緣關(guān)系較近。由此可見，廣東、廣西地區(qū)PRV發(fā)病率較高，PEDV的發(fā)展呈新的流行態(tài)勢，并且存在PEDV和PRV的混合感染。

豬病流行性腹瀉病毒；豬偽狂犬病病毒；流行病學(xué)調(diào)查；克隆；序列分析

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一種嚴(yán)重的病毒性傳染病。該病的臨床癥狀一般表現(xiàn)為嚴(yán)重的水樣腹瀉，并伴有嘔吐現(xiàn)象，全身脫水明顯，糞便稀且呈黃色或灰黃色。病豬精神萎靡，眼窩下陷，食欲減退或廢絕，病豬在腹瀉3～4 d后會因嚴(yán)重脫水而死亡，并且致死率極高[1]。自1971年英國首次報道PED之后在日本、德國、比利時等地相繼暴發(fā)。1976年，我國首次報道了該病。在之后的20年間，該病已在我國的20多個省份暴發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。在我國，各階段的豬群都極易感染PEDV[2-3]。在春季和冬季，保育與肥育豬PEDV的感染率高于哺乳仔豬和母豬[4]。PEDV基因組是單股正鏈RNA，基因組序列包括6個ORF，從5'→3'依次為編碼復(fù)制酶多聚蛋白lab、纖突蛋白、ORF3蛋白、小膜蛋白、膜糖蛋白和核衣殼蛋白的基因[5]。S蛋白可劃分為S1區(qū)（1～789位氨基酸）和S2區(qū)（790～1 383位氨基酸）[6]。其中S1可以識別宿主細(xì)胞的特異性受體并與之結(jié)合，S2結(jié)構(gòu)域的作用為促進(jìn)細(xì)胞膜與病毒膜的融合[7]。S1基因的變化能體現(xiàn)病毒的變異情況，所以有必要對PEDV S1基因進(jìn)行研究[8-9]。

豬偽狂犬病（Pseudorabies,PR）是由豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的以發(fā)熱、流產(chǎn)、死產(chǎn)及腦脊髓炎等為主要臨床癥狀的急性敗血性傳染病，對豬群危害嚴(yán)重。自2011年以來，豬群中有許多已經(jīng)免疫了gE基因缺失活疫苗的規(guī)?；i場出現(xiàn)了母豬產(chǎn)弱仔、死胎、流產(chǎn)，仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀及死亡等疑似偽狂犬病的臨床癥狀，其中也有PR的局部暴發(fā)，并呈上升趨勢，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[10]。病毒基因組為雙鏈DNA，大小約為150 kb，可以編碼70～100種病毒蛋白。在眾多的病毒蛋白中，gB蛋白是該病毒糖蛋白中最保守的糖蛋白，無論是強毒株還是疫苗株，在復(fù)制過程中都必須有g(shù)B基因的參與[11-12]。

為了解廣東、廣西地區(qū)2015年豬流行性腹瀉和偽狂犬病的流行情況，本研究對2015年1—10月廣東、廣西部分地區(qū)豬疑似腹瀉和疑似偽狂犬病組織樣品，采用RT-PCR和NanoPCR技術(shù)進(jìn)行病原調(diào)查，旨在為廣東、廣西地區(qū)豬流行性腹瀉和偽狂犬病的綜合防控提供參考。

1 材料和方法

1.1 病料來源

采集2015年1—10月廣東、廣西部分地區(qū)7個地市56份組織樣本（包括心、肝、脾、肺、腎、淋巴，其中有35份含有小腸樣品），并置于-80℃冰箱內(nèi)保存以備用。

1.2 主要試劑

組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒購自天根生物科技有限公司；NanoPCR GREDBIO（NPK02）試劑盒購自山東大正醫(yī)療器械股份有限公司；總RNA提取試劑盒、2×Taq Mix、抑制劑、Oligod（T）15、dNTPs、DNA Marker，pMD-19T載體購自TAKARA公司；TRIzol試劑和反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV，購自Promega公司；2×Easy Taq PCR Supper Mix，DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國內(nèi)分析純。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank收錄的PEDV S1基因（登錄號：AF353511）、PRV gB序列（登錄號：NC_006151），應(yīng)用Oligo6.0軟件設(shè)計引物，見表1，送北京華大科技有限公司合成。

表1 引物序列

1.4 病毒RNA和DNA的提取及病原檢測

小腸樣本總RNA提取操作步驟按照TAKARA MiniBest Universal RNA Extraction Kit（Cat：#9767）說明書進(jìn)行（所有移液吸頭和EP管均為DNase&RNase-Free）。通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行PCR的擴增，反應(yīng)體系如下：cDNA 2.0 μL，2× Easy Taq PCR Supper Mix 10.0 μL，S1（10 μM）1.0 μL，S2（10 μM）1.0 μL，滅菌ddH2O補至20 μL。PCR擴增條件如下：90℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共計30個循環(huán)，72℃延伸10 min。組織樣本基因組DNA提取操作步驟按照TIANamp組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒（Cat：#DP304-03）說明書操作。然后參考Ma等[13]方法進(jìn)行nanoPCR擴增，反應(yīng)體系：2×nano buffer 10.0 μL，B1（10 μM）1.0 μL，B2（10 μM）1.0 μL，Taq DNA polymerase（5 U/L）1.0 μL，組織DNA 1.0 μL，滅菌ddH2O補至20 μL。將PCR擴增產(chǎn)物10 μL通過1.0 g/100 mL的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.5 PCR產(chǎn)物克隆、測序以及PEDV S1基因遺傳進(jìn)化分析

以PEDV檢測為陽性樣品的cDNA為模板，分別以Q-S1、Q-S2為引物對S1基因進(jìn)行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0 g/100 mL瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定后，克隆至pMD19-T載體中，轉(zhuǎn)化后挑取陽性克隆，進(jìn)行PCR和酶切鑒定，送至北京華大基因科技有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果與GenBank中登錄的PEDV S1基因的核苷酸進(jìn)行同源性分析，用CLUSTAL和Mega 6等軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹分析，參考序列見表2。

表2 PEDV參考序列

2 結(jié)果

2.1 PEDV病原核酸檢測結(jié)果

采用RT-PCR擴增的方法將來自廣東、廣西地區(qū)臨床送檢的35份小腸樣品進(jìn)行了PEDV的檢測，檢測重復(fù)3次，結(jié)果一致。通過表3可看出，廣東、廣西地區(qū)養(yǎng)豬場豬群PEDV的陽性率為14.28%（5/35）。由數(shù)據(jù)看出，廣東地區(qū)的大瀝PEDV陽性率最高為28.57%，化州市和惠州市次之?；ǘ?、肇慶以及廣西地區(qū)的陸川市在本次檢測中沒有檢測出PEDV的陽性樣品。

表3 PEDV檢測結(jié)果

2.2 PRV病原核酸檢測結(jié)果

采用NanoPCR擴增檢測PRV，將來自于廣東、廣西地區(qū)臨床送檢的56份組織樣品進(jìn)行了檢測，檢測重復(fù)3次，結(jié)果一致。通過表4可看出，廣東、廣西地區(qū)養(yǎng)豬場豬群PRV的陽性率為53.6%（30/56）。由數(shù)據(jù)看出，PRV的陽性率較高，感染嚴(yán)重，流行范圍廣，其中廣東化州市PRV發(fā)病率在本次檢測中最高達(dá)到80%，肇慶最低為25%。

表4 PRV檢測結(jié)果

2.3 PEDV和PRV混合感染檢測結(jié)果

對廣東、廣西地區(qū)臨床送檢56份組織樣本中的35份小腸樣本進(jìn)行了PEDV和PRV混合感染情況調(diào)查檢測（表5）。檢測重復(fù)3次，結(jié)果一致。從表5可看出，PEDV與PRV有混合感染的情況，本次檢測中混合感染率為8.57%。

表5 PEDV和PRV混合感染檢測結(jié)果

2.4 PEDV S1基因遺傳進(jìn)化分析

將5個PEDV檢測陽性樣品PCR產(chǎn)物克隆后由北京華大公司測序，S1大小均為2 076 bp。5個病毒株命名分別為：GD-2015-01，GD-2015-02，GD-2015-03，GD-2015-04和GD-2015-05。測序結(jié)果與GenBank中登錄的PEDV S1基因的核苷酸進(jìn)行同源性分析（參考序列見表2），用CLUSTAL和Mega 6軟件NJ法進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹分析（圖1）?；蜻M(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，21個PEDV病毒株分為2個大群，即：Pandemic Group和Classical Group；Pandemic Group群又分為兩個亞型1和2，廣東地區(qū)流行的PEDV毒株都分布在Pandemic Group群中1亞型，比對結(jié)果與Zhang等[14]的比對結(jié)果一致。而本研究測序的5個PEDV病毒株與在2015年廣東分離的CH-HGC-01-2015株及在美國2014年分離的USA/ Kansas125/2014株分布在同一分支，即Pandemic Group群中2亞型，親緣關(guān)系較近。其他的中國病毒株（除LZC病毒株外）與歐洲病毒株CV777親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與其他學(xué)者報道基本一致[15-16]。

圖1 國內(nèi)外PEDV病毒株S1基因序列遺傳進(jìn)化樹

3 討論

PEDV屬于Ⅰ型冠狀病毒，是引起仔豬腹瀉疾病的主要病原，仔豬感染后具有較高的死亡率[17]。PEDV于1971年由Pensaert等[18]首次報道于英國，自20世紀(jì)80年代后期在我國呈現(xiàn)出大面積流行，多與豬傳染性胃腸炎病毒（Porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV）、輪狀病毒（Porcine rotavirus）等其他腸道病毒混合感染，對養(yǎng)豬業(yè)造成極大危害[19-20]。2010年底至今，首先在廣東等華南部分地區(qū)流行，隨后蔓延至全國的哺乳仔豬“頑固性腹瀉”疾病，表現(xiàn)為7日齡內(nèi)仔豬嘔吐、水樣腹瀉、腸道出血、發(fā)病率高、死亡率高，產(chǎn)房母豬不表現(xiàn)任何臨床癥狀，二次感染的新流行特點[21]。PEDV S蛋白具有較高的變異性和能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體的主要免疫蛋白。S基因變異性較大，在分析PEDV流行性毒株的遺傳變異和流行情況中發(fā)揮重要的作用[22-23]。

豬是PRV的貯存宿主，病豬、帶毒豬是該病的主要傳染源，帶毒鼠類也是該病重要的傳染源。PRV只有一個血清型，耐過的豬會終身帶毒，會因應(yīng)激而將感染的病毒活化。偽狂犬病病毒可引起豬發(fā)熱、奇癢、腦脊髓炎。仔豬一旦患病，死亡率高達(dá)100%。gB為PRV最保守的糖蛋白之一，同時也是PRV的一個重要包膜組分和中和抗原，對于病毒的感染必不可少。因此可以選擇gB基因作為檢測PRV的分子探針[24]。

本研究對廣東、廣西地區(qū)疑似PRV、PEDV感染的臨床送檢的56份組織樣品，其中有35份含有小腸組織樣品，分別應(yīng)用RT-PCR和NanoPCR方法對PRV、PEDV進(jìn)行病原檢測。檢測結(jié)果表明，PEDV的陽性率為14.28%，PRV的陽性率為53.6%；同時，存在PRV和PEDV的混合感染，其陽性率為8.57%。本次樣品檢測結(jié)果PRV陽性率較高，主要是因為送檢的病料來自小規(guī)模的豬場，這些豬場的對疫病的防疫和飼養(yǎng)管理水平均較低，可能是導(dǎo)致豬群PRV的感染率較高的原因之一。對本研究中測序的5個PEDV毒株的遺傳進(jìn)化樹分析可知，2015年在廣東地區(qū)流行病毒株基因發(fā)生變異，并與美國分離的毒株有聯(lián)系，但其基因變異機制尚需進(jìn)一步研究和證實。

總之，本次對2015年1—10月廣東、廣西部分地區(qū)PEDV、PRV的初步篩查為下一步兩廣地區(qū)，乃至整個華南地區(qū)PED和PR的防控提供參考。

[1]林忠武.豬流行性腹瀉的流行特點及其防治措施[J].福建畜牧獸醫(yī)，2011，33：14-15.

[2]甘振磊，湯德元，李春燕，等.豬流行性腹瀉流行特點及流行現(xiàn)狀的研究[J].豬業(yè)科學(xué)，2010，27：24-28.

[3]王靚靚，李訓(xùn)良，李鵬沖，等.豬流行性腹瀉的診斷與預(yù)防[J].世界華人消化雜志，2013，21（1）：33-38.

[4]張坤.豬病毒性腹瀉多重RT-PCR診斷方法的建立和應(yīng)用及豬輪狀病的的分離[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[5]陳建飛，王承寶，時洪艷，等.豬流行性腹瀉病毒的分子流行病學(xué)研究[C]//中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會暨中國免疫學(xué)會獸醫(yī)免疫分會第八次學(xué)術(shù)研討會論文集，2010：203-206.

[6]Timoney J F,Gillespie J H,Scott F W,et al.Microbiology and infectious disease of domestic animals[J].Comstock Publishing Associate Ithaca,1988,8：897-898.

[7]Sun D B,Feng L,Shi H Y,et al.Spike protein region(aa 636789) of porcine epidemic diarrhea virus is essential for induction of neutralizing antibodies[J].Acta Virologica,2007,51(3)：149-156.

[8]Shibata I,Tsuda T,Mori M,et al.Isolation of porcine epidemic diarrhea virus in porcine cell cultures and experimental infection of pigs of different ages[J].Vet Microbiol,2000,72(3-4)：173-182.

[9]劉洋，庫旭鋼，劉曉麗，等.豬流行性腹瀉病和豬圓環(huán)病毒病混合感染的診治[J].中國畜牧獸醫(yī)，2015，42（10）：2753-2761.

[10]梁琳，李明昕，崔尚金.豬偽狂犬變異株與經(jīng)典株的流行特點比較及防治策略[J].飼料與畜牧：規(guī)模養(yǎng)豬，2015，10（2）：52-54.

[11]Muller T,Klupp B G,Freuling C,et al.Characterization of pseudorabies virus of wild boar origin from Europe Epidemiol[J].Infect,2010,138(11)：1590-1600.

[12]朱淑芬.偽狂犬病毒gB基因在畢赤酵母中的表達(dá)及初步應(yīng)用[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[13]Ma X,Cui Y C,Qiu Z,et al.A nanoparticle-assisted PCR assay to improve the sensitivity for rapid detection and differentiation of wild-type pseudorabies virus and gene-deleted vaccine strains[J].J Virol Methods,2013,193：374-378.

[14]Zhang X B,Pan Y F,Wang D D,et al.Identification and pathogenicity of a variant porcine epidemic diarrhea virus field strain with reduced virulence[J].Virol J,2015,12：88.

[15]Wei Z Y,Lu W H,Li Z L,et al.Complete genome sequence of novel porcine epidemic diarrhea virus strain GD-1 in China[J].Virol J,2012,86(24)：13824-13825.

[16]Pan Y F,Tian X Y,Li W,et al.Isolation and characterization of a variant porcine epidemic diarrhea virus in China[J].Virol J, 2012,9：195.

[17]張強敏，郭福生，尹燕博，等.豬流行性腹瀉病毒分子生物學(xué)特征[J].中國病毒學(xué)，2002，17（4）：381-384.

[18]Pensaert M,Debouck P.A new Coronavirus like particle associated with diarrhea in Swine[J].Arch Virol,1978,58：243-247.

[19]陳如敬，吳學(xué)敏，車勇良，等.豬流行性腹瀉病毒FJ-11株的分離與ORF3基因序列分析[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，26（6）：947-951.

[20]Puranavehja S,Poolperm P,Lertwatchararsarakul P,et al.Chineselike strain of porcine epidemic diarrhea virus,Thailand[J].E－merg Infect Dis,2009,15(7)：1112-1115.

[21]蔡汝健，張樂宜，宋長緒.2010—2013年華南地區(qū)豬流行性腹瀉病流行情況調(diào)查及防控效果[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（11）：104-105.

[22]Park S J,Song D S,Ha G W,et al.Cloning and further sequence analysis of the spike gene of attenuated porcine epidemic diarrhea virus DR13[J].Virus Genes,2007,35(1)：55-64.

[23]Timoney J F,Gillespie J H,Scott F W,et al.Microbiology and infectious disease of domestic animals[J].Comstock Publishing Associate Ithaca,1988,8：897-898.

[24]羅亞坤，崔尚金.豬偽狂犬病病毒和豬博卡病毒混合感染的檢測[J].豬業(yè)科學(xué)，2014（9）：40-42.

（編輯：富春妮）

他汀類藥物可抵御P M2.5危害

【美國《科學(xué)美國人》月刊網(wǎng)站11月24日報道】題：他汀類藥物可以保護(hù)人們免受空氣污染的危害

他汀類藥物常被用來降低膽固醇，減少心臟病和中風(fēng)的風(fēng)險。它們似乎還能夠緩解人們吸入空氣顆粒物之后出現(xiàn)的炎癥。

美國肺臟學(xué)會高級醫(yī)療顧問諾曼·埃德爾曼說：“空氣中的顆粒物大量增加會對健康造成嚴(yán)重影響。他汀類藥物似乎不僅能保護(hù)肺部免受影響，而且能夠保護(hù)心臟。”

加拿大不列顛哥倫比亞大學(xué)肺臟專家斯蒂芬·范埃登副教授介紹說，雖然醫(yī)生不能通過開藥的方式保護(hù)人們免受空氣污染的危害，但已有多項研究證明，如果服用他汀類藥物，血液內(nèi)某種蛋白質(zhì)的數(shù)量就會減少，而這種蛋白質(zhì)正是人體組織發(fā)炎的標(biāo)志物。此類炎癥有可能加重呼吸和心血管疾病。美國加利福尼亞州環(huán)境健康風(fēng)險評估辦公室的流行病學(xué)專家巴特·奧斯特羅說，他們考察了1 923名美國女性，發(fā)現(xiàn)服用他汀類藥物的人可能避免PM2.5的炎癥效應(yīng)。

范埃登的研究小組讓實驗兔攝入他汀類藥物，然后將其放入顆粒物環(huán)境，結(jié)果藥物降低了肺部炎癥的水平。在另一組兔子實驗中，他汀類藥物似乎有助于清除肺部的大顆粒。

（轉(zhuǎn)自參考消息[N]，2014-11-27）

S858.28

A

1002-1957(2016)01-0101-04

2016-01-06

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程項目（ASTIP-IAS15）

羅亞坤（1992-），男，黑龍江哈爾濱人，在讀碩士研究生，研究方向為動物傳染病學(xué)與分子流行病學(xué).E-mail：lykxbumtozs＠163.com

崔尚金，博士生導(dǎo)師，研究員，研究方向為動物疫病防控.E-mail：cuishangjin＠126.com