張嘉麗 黃宇航 宋 明 任陽陽 張夢(mèng)婷 劉 霞 孫 偉 陳士林

(1 武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院,武漢，430070； 2 安利(中國)植物研發(fā)中心，無錫，214145；3 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京，100700)

?

基于ITS序列鑒別真菌類藥材馬勃及其混偽品

張嘉麗1,3黃宇航1宋 明2任陽陽1張夢(mèng)婷1劉 霞1孫 偉3陳士林1,3

(1 武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院,武漢，430070； 2 安利(中國)植物研發(fā)中心，無錫，214145；3 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京，100700)

目的:運(yùn)用ITS序列鑒別真菌類藥材馬勃Lasiosphaeracalvatia及其混偽品。方法：收集來自重慶、北京等9個(gè)地方的21份脫皮馬勃、大馬勃、紫色馬勃樣品，提取基因組DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后雙向測序。同時(shí)從GenBank上下載常見馬勃藥材混偽品的序列。將所有序列進(jìn)行剪切校準(zhǔn)拼接后分析，基于K2P(Kimura 2-Parameter)模型計(jì)算馬勃及其混偽品的種內(nèi)和種間遺傳距離，并構(gòu)建Neighbor-Joining(NJ)系統(tǒng)聚類樹。結(jié)果：大馬勃的ITS序列種內(nèi)最大K2P遺傳距離為0；脫皮馬勃的ITS序列種內(nèi)最大K2P遺傳距離為0.003；紫色馬勃的ITS序列種內(nèi)最大遺傳距離為0.003。大馬勃與混偽品種間最小K2P遺傳距離為0.019，脫皮馬勃與混偽品種間最小K2P遺傳距離為0.031，紫色馬勃與混偽品種間最小K2P遺傳距離為0.634。大馬勃、脫皮馬勃、紫色馬勃的種內(nèi)最大遺傳距離均小于它們與混偽品的種間最小遺傳距離。NJ樹結(jié)果顯示大馬勃、紫色馬勃、脫皮馬勃各自聚為一支，表現(xiàn)出良好的單系性，能夠與混偽品明顯的區(qū)別開來。結(jié)論：基于ITS序列的條形碼技術(shù)可以將馬勃藥材及其混偽品有效進(jìn)行鑒別。

馬勃；混偽品；ITS；條形碼

馬勃Lasiosphaeracalvatia為灰包科真菌脫皮馬勃LasiosphaerafenzliiReich.、大馬勃Calvatiagigantea(Batsch ex Pers.)Lloyd、紫色馬勃Calvatialilacina(Mont.et Berk.)Lloyd的干燥子實(shí)體，能夠清肺利咽、止血，用于治療風(fēng)熱郁肺咽痛，音啞，咳嗽；外治鼻衄，創(chuàng)傷出血[1]。馬勃中所含馬勃多糖被證實(shí)在抗腫瘤方面有良好的效果[2]，大馬勃中還含有豐富的蛋白質(zhì)和多種人體必需氨基酸[3]，且大馬勃的菌株在經(jīng)過液體發(fā)酵培養(yǎng)后，其鎮(zhèn)痛、抗炎的作用增強(qiáng)[4]。由于菌類分布較廣泛、形態(tài)簡單難鑒別，故市售的馬勃經(jīng)常出現(xiàn)亂用、混用的現(xiàn)象。

圖1 馬勃藥材照片

目前市面上常見的混偽品主要有小馬勃LycoperdonpusillumBatsch ex Pers.[5]、豆包菌Pislithustinctorius(Pers.)Coker & Couch.[6]、頭狀禿馬勃Calvatiacraniiformis(Schw.)Fries.、網(wǎng)紋馬勃LycoperdonperlatumPers[7]、白禿馬勃Calvatiacandida(Rostk.)Hollos、梨形馬勃LycoperdonpyriformeSchaeff es Pers.、鉛色灰球菌BovistaplumbeaPers.、樹皮絲馬勃Mycenastrumcorium(Guess.ex DC.)Desv.、長根靜灰球菌Bovistellaradicata(Dur.et Mont.)Pat[8]。

DNA條形碼技術(shù)(DNA barcoding)是利用基因中一段特定的相對(duì)較短的，并且擁有高穩(wěn)定性和重復(fù)性的序列來進(jìn)行物種鑒定的一種分子生物學(xué)技術(shù)[9]。該技術(shù)作為傳統(tǒng)鑒定技術(shù)的有效補(bǔ)充，可為中藥材的鑒定提供準(zhǔn)確的結(jié)果[10]。目前，該技術(shù)在已經(jīng)在植物分類、中藥材鑒定等多個(gè)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，其準(zhǔn)確性也已得到驗(yàn)證，并已成功應(yīng)用于蔓荊子、蟾皮、血竭、車前子、羌活等多種中藥材的鑒別中[11～15]，其對(duì)于控制藥材市場藥品的安全、準(zhǔn)確具有很重要的作用[16]。

由于不同種類的真菌在外表上相對(duì)于動(dòng)植物來說難以區(qū)分，且許多真菌分布廣泛、來源復(fù)雜，所以使得真菌的鑒別更加困難[17]。目前真菌類中藥材已經(jīng)越來越多地應(yīng)用于臨床，為了保證藥材的真實(shí)有效以及用藥安全，目前常規(guī)的鑒別手段也存在一定的局限性，故我們急需更為準(zhǔn)確的鑒定手段。研究發(fā)現(xiàn)，ITS序列在真菌鑒別中具有一定的優(yōu)勢，而COI序列含有較多內(nèi)含子，不利于擴(kuò)增，并不適用于成為全部真菌鑒定的條形碼[18]。通過比較ITS序列與COI序列的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)ITS序列在真菌中的鑒別范圍更加廣泛[19]，也表現(xiàn)出了更好的鑒別能力[20]。

本研究以馬勃藥材及其常見混偽品作為研究對(duì)象，獲得其ITS序列，以準(zhǔn)確鑒別真菌類藥材馬勃及其混偽品。

1 材料與方法

1.1 材料 本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)地采集、藥材市場購買等方式收集馬勃共3個(gè)物種21份藥材，分別來自重慶、北京、河北等地，樣品信息見表1。另從GenBank數(shù)據(jù)庫下載35條序列，詳細(xì)信息見表2。

表1 樣品信息表

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 取干燥馬勃藥材20 mg，用核分離液(2%PVP，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L pH 8.0 Tris-Hcl和0.7 mmol/L NaCl)800 μL抽提2次，利用基因組DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.,China)提取DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及測序 采用ITS通用引物ITS1-18S(5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3' )和ITS4-28S(5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' )擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括2×Tag PCR Mix 12.5 μL，2.5 μmol/L引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL，擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 85 s，(95 ℃ 35 s，55 ℃ 55 s，72 ℃ 45 s)循環(huán)35次，72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測并純化后，使用ABI 3730XL測序儀(Applied Biosystems Co,USA)進(jìn)行雙向測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 測序峰圖文件用CodonCode AlignerV4.2(CodonCode Co.,USA)進(jìn)行序列拼接和剪切，去除低質(zhì)量序列，獲得ITS序列。將所得ITS序列使用MEGA5.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析。基于K2P(Kimura 2-Parameter)模型計(jì)算種內(nèi)種間遺傳距離，并對(duì)馬勃藥材及其混偽品進(jìn)行遺傳距離分析，并構(gòu)建Neighbor-Joining(NJ)系統(tǒng)聚類樹，采用bootstrap重復(fù)1000次進(jìn)行檢驗(yàn)。

表2 GenBank下載序列

2 結(jié)果

2.1 馬勃及其混偽品的種內(nèi)變異分析 脫皮馬勃、大馬勃、紫色馬勃、白禿馬勃、頭狀禿馬勃、網(wǎng)紋馬勃、小馬勃、梨形馬勃、鉛色灰球菌、樹皮絲馬勃、長根靜灰球菌、豆包菌的ITS序列長度、種內(nèi)變異位點(diǎn)數(shù)、GC含量等信息見表3。大馬勃共7條序列，長度為609 bp，沒有變異位點(diǎn)。脫皮馬勃共7條序列，長度為609 bp，以YC0777MT14為主導(dǎo)單倍型，在22 bp處存在C-T變異，在494 bp處存在A-G變異。紫色馬勃共7條序列，長度為607 bp，以YC0809MT01為主導(dǎo)單倍型，在388 bp處存在A-G變異；在395 bp處存在G-A變異。

2.2 馬勃種內(nèi)、種間及其與混偽品的種間遺傳距離分析 基于K2P模型計(jì)算遺傳距離見表4，大馬勃、脫皮馬勃和紫色馬勃的種內(nèi)最大遺傳距離小于它們分別和混偽品的種間最小遺傳距離，大馬勃、脫皮馬勃和紫色馬勃的種間最小遺傳距離大于大馬勃、脫皮馬勃和紫色馬勃的種內(nèi)最大遺傳距離。

表3 馬勃及其混偽品ITS序列特征

表4 馬勃藥材種內(nèi)、種間及其與混偽品的種間遺傳距離分析

2.3 馬勃與其混偽品的NJ樹鑒定 基于ITS序列構(gòu)建馬勃藥材與其混偽品NJ樹(圖2)，結(jié)果表明，ITS序列能夠很好的將馬勃藥材與其混偽品區(qū)分開來。

圖2 基于ITS序列構(gòu)建馬勃藥材及其混偽品的NJ樹

3 討論

馬勃藥材為灰包科真菌脫皮馬勃LasiosphaerafenzliiReich.、大馬勃Calvatiagigantea(Batsch ex Pers.)Lloyd、紫色馬勃Calvatialilacina(Mont.et Berk.)Lloyd的干燥子實(shí)體，其形態(tài)與白禿馬勃、頭狀禿馬勃、網(wǎng)紋馬勃、小馬勃、梨形馬勃、鉛色灰球菌、樹皮絲馬勃、長根靜灰球菌、豆包菌非常相近，容易發(fā)生混用的現(xiàn)象。其中豆包菌又叫彩色豆馬勃，它是一種有益的外生菌根，能夠增強(qiáng)樹木的營養(yǎng)吸收能力及抵抗力[21]。因此，馬勃藥材的準(zhǔn)確鑒定對(duì)市場上馬勃藥材的使用和流通的安全性與規(guī)范性有著非常大的意義。目前，對(duì)于馬勃類藥材的鑒別多數(shù)為傳統(tǒng)的形態(tài)鑒別、顯微鑒別等手段[22]，但這些技術(shù)手段存在一定局限性，而DNA條形碼技術(shù)具有很強(qiáng)的適用性與通用性，利用該技術(shù)，可以更加穩(wěn)定和準(zhǔn)確保證馬勃藥材的質(zhì)量，也保證了臨床用藥安全。

本研究收集了來自重慶、北京、河北、內(nèi)蒙、廣西、浙江、安徽、湖北、新疆等地的馬勃藥材樣品，選用ITS序列作為DNA條形碼對(duì)馬勃藥材及其混偽品進(jìn)行鑒定研究。應(yīng)用基于K2P計(jì)算的遺傳距離對(duì)馬勃藥材種內(nèi)、種間及其混偽品的種間遺傳距離進(jìn)行比較、分析結(jié)果表明，馬勃藥材的種內(nèi)最大K2P遺傳距離小于馬勃藥材與其混偽品的種間最小K2P遺傳距離，構(gòu)建NJ樹，馬勃藥材和其混偽品各自聚為一支，表現(xiàn)出良好的單系性，同時(shí)馬勃藥材與其混偽品可以區(qū)分開來。因此，應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)能夠準(zhǔn)確的鑒別馬勃藥材與其混偽品。

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(第一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:50.

[2]姜明華,田易玲,徐凌川.馬勃多糖對(duì)荷瘤模型小鼠抑瘤作用及生命延長率的影響[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2014,38(2):157-158.

[3]張江萍,范曉龍,吳銳.山西野生大馬勃營養(yǎng)成分分析[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(5):456-457.

[4]張帆，王大可，李愛欣,等.大馬勃抗炎鎮(zhèn)痛及體外抑菌作用的研究[J].中國食用菌,2014,33(2):50-52.

[5]游黔平,陳昆先.馬勃及其偽品小灰包的鑒別[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2006,17(3):349.

[6]余昕,張丹.淺談4種真菌類中藥的真?zhèn)舞b別[J].山西中醫(yī),2009,12(25):48-50.

[7]芮正祥.安徽中藥志第三卷[M].合肥:安徽科學(xué)技術(shù)出版社,2005:353.

[8]國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草(第一冊(cè))[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1999:609-612.

[9]陳士林,龐曉慧,姚輝,等.中藥DNA條形碼鑒定體系及研究方向[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2011,13(5):747-754.

[10]陳士林,姚輝,韓建萍,等.中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則[J].中國中藥雜志,2013,38(2):141-147.

[11]張曉存,徐迪,孫偉,等.蔓荊子藥材及其混偽品DNA條形碼鑒定研究[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2014,16(11):2366-2370.

[12]樊佳佳,宋明,宋馳,等.中藥材蟾皮及其混偽品的DNA條形碼鑒定研究[J].中國藥學(xué)雜志,2015,50(15):1292-1296.

[13]王俊,劉霞,孫偉,等.名貴中藥材血竭的DNA條形碼研究[J].中國藥學(xué)雜志,2015,50(15):1261-1265.

[14]宋明,張雅琴,林韻涵,等.基于ITS2和psbA-trnH序列對(duì)細(xì)小種子類藥材車前子的鑒定比較[J].中國中藥雜志,2014,39(12):2227-2232.

[15]張改霞,金鉞,賈靜,等.藥用植物羌活種子DNA條形碼鑒定研究[J].中國中藥雜志,2016,41(3):390-395.

[16]辛天怡,李西文,姚輝,等.中藥材二維DNA條形碼流通監(jiān)管體系研究[J].中國科學(xué):生命科學(xué),2015,45(7):695-702.

[17]張宇,郭良棟.真菌DNA條形碼研究進(jìn)展[J].菌物學(xué)報(bào),2012,31(6):809-820.

[18]周均亮,趙瑞琳.真菌DNA條形碼技術(shù)研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào),2013,40(8):1468-1477.

[19]KEITH A.SEIFERT.Progress towards DNA barcoding of fungi[J].Molecular Ecology Resources,2009,9(1):83-89.

[20]Dentinger BT，Didukh MY，Moncalvo JM.Comparing COI and ITS as DNA barcode markers for mushrooms and Allies(Agaricomycotina)[J].PLoS One,2011,6(9)：e25081.

[21]周愛東,吳小芹,王明生,等.彩色豆馬勃硝酸還原酶基因克隆與序列分析[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2013,37(6):22-26.

[22]劉信奎,孫偉,矯明昭.中藥飲片馬勃質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的改進(jìn)[J].中國保健營養(yǎng),2012(7):241.

(2016-04-12收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Identification of Lasiosphaera Calvatia and Its Adulterants Using ITS Barcode

Zhang Jiali1,3，Huang Yuhang1，Song Ming2，Ren Yangyang1，Zhang Mengting1，Liu Xia1，Sun Wei3，Chen Shilin1,3

(1SchoolofChemistry，ChemicalEngineeringandLifeScience，WuhanUniversityofTechnology，Wuhan430070，China; 2Amway(China)BotanicalResearchandDevelopmentCenter,Wuxi214145，China; 3InstituteofChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China)

Objective:ITS sequence was used as a barcode to identify Lasiosphaera Calvatia and its adulterants.Methods:We collected 21 samples of Lasiosphaera Calvatia and extracted their DNA，then amplified their ITS sequences.We also downloaded sequences of Lasiosphaera Calvatia’s adulterants from GenBank.Sequences were assembled and analysis their variable sites.The Kimura 2-Paramter(K2P)genetic distances and compute the Neighbor-joining(NJ)phylogenetic tree were computed.Results:The maximum intraspecific K2P genetic distances of the ITS sequence of Calvatia gigantea(Batsch ex Pers.)Lloyd is 0.The maximum intraspecific K2P genetic distances of the ITS sequence of Lasiosphaera fenzlii Reich.is 0.003.The maximum intraspecific K2P genetic distances of the ITS sequence lengths of Calvatia lilacina(Mont.et Berk.)Lloyd is 0.003.The minimum interspecific K2P genetic distances of Calvatia gigantea and adulterants is 0.019，Lasiosphaera fenzlii and adulterants is 0.031，while Calvatia lilacina and adulterants is 0.634.The maximum intraspecific genetic distances of Calvatia gigantea、Lasiophaera fenzlii and Calvatia lilacina were all less than the minimum interspecific genetic distances of themselves and their adulterants.the NJ tree based on ITS sequence showed that Calvatia gigantea、Lasiosphaera fenzlii and Calvatia lilacina can gather into a branch sperately.Conclusion:ITS sequence was able to identify Lasiosphaera Calvatia from their adulterants,which is suitable in the identification of Lasiosphaera Calvatia and its adulterants.

Lasiosphaera Calvatia，ITS，adulterants，Barcoding

國家重大科技專項(xiàng)子課題“中藥新藥安全性檢測技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)研究”——中藥原料藥混偽品分子基因鑒定技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)(編號(hào)：2014ZX09304-307-001-020)

張嘉麗(1993.3—)，女，碩士研究生，研究方向：中藥資源與分子鑒定

陳士林，男，研究員，主要研究方向：中藥資源與分子鑒定，Tel:(010)64058460,E-mail：slchen@icmm.ac.cn

R282

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.006