石洪玥，劉 陽，王曉梅，高金偉，邱琳珊，李晶晶

( 1.天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300384；2.天津市水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，天津300402 )

七里海中華絨螯蟹遺傳多樣性的RAPD和ISSR分析

石洪玥1，劉 陽1，王曉梅1，高金偉1，邱琳珊1，李晶晶2

( 1.天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300384；2.天津市水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，天津300402 )

利用RAPD-PCR及ISSR-PCR兩種分子標(biāo)記技術(shù)，分析了七里海中華絨螯蟹第6代繁育群體的遺傳多樣性。用10個(gè)多態(tài)性高的RAPD引物對(duì)24個(gè)七里海中華絨螯蟹樣本個(gè)體進(jìn)行擴(kuò)增，共檢測(cè)出107個(gè)不同的擴(kuò)增位點(diǎn)，擴(kuò)增片段大小為300～2300 bp。其中多態(tài)位點(diǎn)總數(shù)為66個(gè)，平均多態(tài)位點(diǎn)比例為61.32%，群體內(nèi)香農(nóng)-維納多樣性值為0.1714。用 8 個(gè)多態(tài)性高的ISSR 引物對(duì)24個(gè)個(gè)體共檢測(cè)到106個(gè)位點(diǎn)，擴(kuò)增片段為200～1500 bp。其中多態(tài)性位點(diǎn)79 個(gè)，平均多態(tài)位點(diǎn)百分率為74.53%，群體內(nèi)香農(nóng)-維納多樣性值為0.1778。結(jié)果顯示，該群體的多態(tài)位點(diǎn)比例和香農(nóng)-維納多樣性值均較大，說明其有較豐富的遺傳多樣性，同時(shí)也說明RAPD和ISSR技術(shù)用于七里海中華絨螯蟹核基因組的遺傳多樣性分析，具有較高的檢出率和靈敏度。

七里海中華絨螯蟹；遺傳多樣性；RAPD-PCR；ISSR-PCR

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)在我國(guó)境內(nèi)分布較廣，自然分布主要在長(zhǎng)江水域、遼河水域、甌江水域及海河水域的四大水系中[1]。由于其極具市場(chǎng)價(jià)值，已成為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的重點(diǎn)培育品種。自20世紀(jì)70年代末中華絨螯蟹人工養(yǎng)殖和人工育苗的難關(guān)被突破后，中華絨螯蟹養(yǎng)殖改變了蟹苗完全依賴天然產(chǎn)量的局面，但隨著中華絨螯蟹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展[2-5]，天然中華絨螯蟹的苗種明顯不能滿足其需求，在養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中需從各地引進(jìn)苗種，導(dǎo)致中華絨螯蟹基因間的混雜以及優(yōu)勢(shì)基因的喪失[6-7]。由于過度捕撈、環(huán)境污染、興修水利、水質(zhì)資源變化等多種原因，蟹苗的自然資源產(chǎn)量已瀕臨枯竭。因此，通過有效的試驗(yàn)技術(shù)對(duì)七里海中華絨螯蟹種質(zhì)資源進(jìn)行探究，分析其遺傳背景、遺傳差異和遺傳多樣性，不僅有助于七里海中華絨螯蟹種群的鑒別，而且對(duì)七里海中華絨螯蟹的養(yǎng)殖和育種也大有幫助[8]。

物種遺傳物質(zhì)變異多樣性研究可直接反映在DNA分子標(biāo)記技術(shù)的結(jié)果上，DNA標(biāo)記是對(duì)遺傳變異的直接反映，且信息豐富，可作為生物種質(zhì)鑒定的新方法。因此，DNA分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)遺傳學(xué)研究和有關(guān)方面的育種起到了有效的推動(dòng)作用[9]。目前，對(duì)中華絨螯蟹群體遺傳多樣性的研究已見相關(guān)報(bào)道，如胡鵬飛等[10]采取RFLP 技術(shù)對(duì)長(zhǎng)江水系中華絨螯蟹線粒體DNA的遺傳多樣性進(jìn)行分析。高志千等[11]用RAPD方法分析了遼河、長(zhǎng)江和甌江中華絨螯蟹種群的遺傳變異。鄭芳等[12]應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)天然水域中華絨螯蟹進(jìn)行遺傳檢測(cè)。此外，還有關(guān)于中華絨螯蟹在同工酶水平上的遺傳變異[13-14]以及微衛(wèi)星SSR分析[15]的研究報(bào)道。

本研究利用RAPD 和ISSR兩項(xiàng)技術(shù)對(duì)七里海中華絨螯蟹第6代繁育群體的遺傳多樣性進(jìn)行分析，旨在了解七里海中華絨螯蟹的基因庫(kù)，為七里海中華絨螯蟹的良種繁育以及中華絨螯蟹現(xiàn)有資源的保護(hù)以及開發(fā)和利用提供理論依據(jù)，同時(shí)對(duì)RAPD和ISSR兩種分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行了比較和探討。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)中分析用樣本為天津市水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心培育的七里海中華絨螯蟹第6代繁育群體，隨機(jī)選取30只個(gè)體，樣本取回后，附肢于95%乙醇保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和儀器設(shè)備

1.2.1 藥品和試劑

無水乙醇：天津市恒昊公司化學(xué)試劑廠；Taq酶：生工生物工程(上海)股份有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)：美國(guó)Genview公司；100 bp+1.5 kb DNA Marker-K：生工生物工程(上海)股份有限公司；EDTA-2Na：生工生物工程(上海)股份有限公司；蛋白酶K：美國(guó)AMRESCO公司；三羥甲基氨基甲烷飽和酚：鼎國(guó)生物工程有限公司；三氯甲烷：青島化學(xué)試劑廠；異戊醇：青島化學(xué)試劑廠；冰乙酸：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；TE緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)，1 mmol/L EDTA，pH=8.0；瓊脂糖：進(jìn)口分裝，鼎國(guó)生物工程有限公司；上樣緩沖液(6X)：0.25%溴酚藍(lán)，40%(m/V)蔗糖水溶液；PCR水(RNase Dnase-free)：生工生物工程(上海)股份有限公司；1×TAE：50×TAE 20 mL,蒸餾水 980 mL；溴酚藍(lán)：鼎國(guó)生物工程有限公司；引物：生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2.2 主要儀器和設(shè)備

高速離心機(jī)(德國(guó) Eppendorf公司，5417R型)，生物安全柜(上海力申科技有限公司，HFsafe 900/C型)，PCR儀(美國(guó)MJ Research公司，PTC-200 型)，電泳檢測(cè)設(shè)備[君意東方電泳設(shè)備(北京)有限公司，JY600 型]，凝膠成像分析儀(英國(guó)SYNGENE公司，GENEGENIUS型)，電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司，HHS型)，超微量紫外可見分光光度計(jì)(德國(guó) IMPLEN公司，P-300 型)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 總DNA的提取

采用常規(guī)酚/氯仿提取方法從七里海中華絨螯蟹的螯肢肌肉中提取總體DNA。

1.3.2 RAPD和ISSR擴(kuò)增反應(yīng)體系及反應(yīng)程序

RAPD和ISSR的擴(kuò)增反應(yīng)總體積為25 μL，包括：2.5 μL 10× buffer，0.5 μL dNTP(10 mmol/L)，2 μL引物(5 μmol/L)，0.3 μL Taq plus DNA聚合酶(5 U/μL)，18.7 μL PCR水，1 μL樣本DNA。RAPD引物購(gòu)自生工上海生物工程股份有限公司。ISSR擴(kuò)增反應(yīng)所用50個(gè)引物是依據(jù)加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的第9套ISSR引物序列(http://www.Michaelsmith.Ubc.a/services/NAPS/ Primer-Sets/Primers)，由生工上海生物工程股份有限公司合成。RAPD擴(kuò)增PCR循環(huán)程序：首先經(jīng)94 ℃變性5 min后，進(jìn)行40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94 ℃,1 min;37 ℃,1 min;72 ℃,2 min;最后72 ℃延伸10 min。ISSR擴(kuò)增PCR循環(huán)程序：經(jīng)95 ℃預(yù)變性4 min后，前15個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94 ℃ 變性40 s，溫度A退火40 s,72 ℃延伸1.5 min, 后22個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性45 s，溫度B退火40 s，72 ℃延伸1.5 min，最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.8%的瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測(cè)(5 V/cm)。將重復(fù)性好、擴(kuò)增條帶清晰的電泳圖譜用于七里海中華絨螯蟹的遺傳多態(tài)性分析。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

電泳檢測(cè)后的圖譜利用RAPD分析軟件Quantity One 4.6.2進(jìn)行分析，選取清晰的擴(kuò)增片段進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，將有條帶的記為1，無條帶的記為0，得到0、1矩陣，從而統(tǒng)計(jì)位點(diǎn)總數(shù)，多態(tài)位點(diǎn)數(shù)以及多態(tài)位點(diǎn)比例等[16]。

香農(nóng)—維納多樣性指數(shù)H0=-∑πilnπi

香農(nóng)—維納多樣性值H=-∑πilnπi/N

式中，πi為某一條帶在某一群體中出現(xiàn)的頻率，N為所測(cè)的總位數(shù)。

群體的多態(tài)位點(diǎn)百分率/%=該群體的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)/總位點(diǎn)數(shù)×100%

群體的多態(tài)位點(diǎn)頻率/%=具有該位點(diǎn)的樣本數(shù)/總樣本數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD和ISSR引物篩選結(jié)果

共用33個(gè)RAPD引物和30個(gè)ISSR引物對(duì)七里海中華絨螯蟹核基因組進(jìn)行分析，其中21個(gè)RAPD引物具有擴(kuò)增產(chǎn)物，10個(gè)引物具有清晰的擴(kuò)增條帶。8個(gè)ISSR引物，擴(kuò)增條帶清晰，穩(wěn)定性好，用于進(jìn)行七里海中華絨螯蟹樣本的遺傳多樣性分析。

2.2 RAPD擴(kuò)增及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

利用10個(gè)多態(tài)性高的RAPD引物對(duì)24個(gè)七里海中華絨螯蟹樣本個(gè)體進(jìn)行擴(kuò)增，引物S97、S397、S376和S83的擴(kuò)增結(jié)果見圖1。統(tǒng)計(jì)分析顯示，共檢測(cè)出107個(gè)不同的擴(kuò)增位點(diǎn)，擴(kuò)增片段大小為300～2300 bp。每個(gè)引物擴(kuò)增出多態(tài)位點(diǎn)數(shù)4～9個(gè)，位點(diǎn)總數(shù)8～13個(gè)。10個(gè)引物多態(tài)位點(diǎn)百分率為50.00%～72.73%，多態(tài)位點(diǎn)總數(shù)為66個(gè)，平均多態(tài)位點(diǎn)百分率為61.32%(表1)。說明RAPD技術(shù)用于七里海中華絨螯蟹核基因組的遺傳多樣性分析，具有較高的檢出率和靈敏度。根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)的基因頻率計(jì)算出群體內(nèi)香農(nóng)—維納多樣性指數(shù)為 18.3419，群體內(nèi)香農(nóng)—維納多樣性值為0.1714?？梢钥闯銎呃锖Ｖ腥A絨螯蟹群體的遺傳多態(tài)性較高。

圖1 RAPD引物S97、S397、S376、S83在七里海中華絨螯蟹群體中的擴(kuò)增圖譜注：泳道M為Marker,100 bpDNA標(biāo)準(zhǔn)分子量.下同.

2.3 ISSR擴(kuò)增結(jié)果

利用8個(gè)多態(tài)性高的ISSR引物對(duì)24個(gè)七里海中華絨螯蟹樣本個(gè)體進(jìn)行擴(kuò)增，引物817、835、846和848的擴(kuò)增電泳圖見圖2。統(tǒng)計(jì)分析顯示，共檢測(cè)出106個(gè)不同的擴(kuò)增位點(diǎn)，擴(kuò)增片段大小為200～1500 bp。每個(gè)引物擴(kuò)增出多態(tài)位點(diǎn)數(shù)7～19個(gè)，位點(diǎn)總數(shù)為11～21個(gè)。8個(gè)引物多態(tài)位點(diǎn)百分率為53.85%～90.47%，多態(tài)位點(diǎn)總數(shù)為79個(gè)，平均多態(tài)位點(diǎn)百分率為74.53%(表2)。由擴(kuò)增圖譜可見，每個(gè)引物在群體的不同個(gè)體間均表現(xiàn)出很高的多態(tài)性。根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)的基因頻率計(jì)算出群體內(nèi)香農(nóng)—維納多樣性指數(shù)為18.8425和群體內(nèi)香農(nóng)—維納多樣性值為0.1778，可見，七里海中華絨螯蟹表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。

圖2 ISSR引物817、835、846、848在七里海中華絨螯蟹群體中的擴(kuò)增圖譜

表1 篩選出的RAPD引物序列及其擴(kuò)增結(jié)果

表2 篩選出的ISSR 引物序列及其擴(kuò)增結(jié)果

3 討 論

七里海中華絨螯蟹是天津?qū)幒涌h的特產(chǎn)，因在天津七里海水域生長(zhǎng)而以此得名，早在清朝年間就被視為宮廷貢品，百姓對(duì)其低脂肪、高蛋白以及獨(dú)特的風(fēng)味更是贊不絕口，2006年12月，國(guó)家質(zhì)檢總局對(duì)七里海中華絨螯蟹的地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)的申請(qǐng)給予批準(zhǔn)[17]。

遺傳多樣性是生物多樣性研究的重要內(nèi)容，只有通過對(duì)遺傳多樣性的研究才能從本質(zhì)上揭示物種多樣性的起源、變異和進(jìn)化[18]。平均多態(tài)位點(diǎn)比率和香農(nóng)-維納多樣性指數(shù)是衡量生物群體遺傳多樣性高低的參數(shù)。RAPD和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)是評(píng)估遺傳多樣性的一種有效手段，二者以其高度多樣性在物種的遺傳多樣性研究已得到了廣泛的應(yīng)用[19]。RAPD技術(shù)在20世紀(jì)90年代末期得到廣泛地應(yīng)用與發(fā)展，其是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的可對(duì)整個(gè)未知序列核基因組的遺傳多態(tài)性進(jìn)行分析的一種分子標(biāo)記技術(shù)[20]。RAPD 分析技術(shù)無需事先了解所要研究生物的核苷酸序列組成，所用引物可隨機(jī)地選定與合成，每個(gè)RAPD 反應(yīng)中，僅加單個(gè)引物，擴(kuò)增無特異性，退火溫度較低，因此可保證核苷酸引物與模板DNA的穩(wěn)定結(jié)合，同時(shí)允許適當(dāng)?shù)腻e(cuò)配，使得RAPD 有較高的檢出率，RAPD 分析所需的DNA樣品量極少，RAPD 技術(shù)簡(jiǎn)便易行、省時(shí)省力，易于程序化，利用一套隨機(jī)引物便可得到大量的分子標(biāo)記，并可借助計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行相應(yīng)地統(tǒng)計(jì)分析。

我國(guó)在20世紀(jì)90年代后期[21-28]開始對(duì)中華絨螯蟹的分子遺傳學(xué)進(jìn)行研究，應(yīng)用RAPD技術(shù)，對(duì)絨螯蟹屬種間[中華絨螯蟹和日本絨螯蟹(E.japonica)]及中華絨螯蟹種群間的親緣關(guān)系與分子遺傳標(biāo)記進(jìn)行研究。如謝浩等[21]利用RAPD技術(shù)對(duì)中華絨螯蟹、日本絨螫蟹及日本絨螯蟹合浦亞種3種絨螫蟹親緣關(guān)系的研究，發(fā)現(xiàn)了區(qū)分中華絨螯蟹與日本絨螯蟹的分子遺傳標(biāo)記。周開亞等[22]首次應(yīng)用RAPD標(biāo)記對(duì)中華絨螯蟹種群進(jìn)行了分子鑒定，在200個(gè)隨機(jī)引物中，篩選出2個(gè)特異性RAPD引物能夠用于長(zhǎng)江種群的鑒別。李思發(fā)等[23]應(yīng)用RAPD分析技術(shù)，得出遼河與甌江中華絨螯蟹種群的遺傳距離最大(0.171)。邱濤等[24-25]用RAPD 方法分析了遼河、長(zhǎng)江和甌江種群的遺傳變異，并用RAPD技術(shù)識(shí)別中華絨螯蟹性別差異，發(fā)現(xiàn)17個(gè)引物擴(kuò)增出了群體水平的性別差異，篩選出一個(gè)引物擴(kuò)增出了個(gè)體水平的性別差異。趙姝華等[26]采用RAPD技術(shù)對(duì)中華絨螯蟹同一來源的不同個(gè)體進(jìn)行遺傳差異分析，初步得出個(gè)體間遺傳變異在20%以下，同源程度達(dá)80%以上。

ISSR方法是基于 SSR 基礎(chǔ)上的一種分子標(biāo)記手段，該技術(shù)利用錨定引物擴(kuò)增微衛(wèi)星位點(diǎn)之間的區(qū)域，與RAPD相比，其每條引物可產(chǎn)生更多的多態(tài)性條帶[29]。相較于RAPD標(biāo)記在中華絨螯蟹方面的研究，ISSR標(biāo)記在中華絨螯蟹種質(zhì)研究中的報(bào)道并不多見。鄭芳等[12]采用ISSR 技術(shù)鑒定4個(gè)水系(鴨綠江、長(zhǎng)江、閩江和南流江)中華絨螯蟹，共獲得80條清晰穩(wěn)定的條帶，其中有53條多態(tài)性條帶，多態(tài)率為66.25%。

本研究利用10條RAPD引物和8條ISSR引物分別對(duì)七里海中華絨螯蟹第6代繁育群體進(jìn)行了總 DNA 的基因擴(kuò)增，且兩種分子標(biāo)記技術(shù)均能擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定的條帶。由研究結(jié)果可以看出，RAPD和ISSR兩種標(biāo)記方法獲得的每條引物多態(tài)性位點(diǎn)的平均值分別為6.60個(gè)和 9.88 個(gè)，多態(tài)性條帶百分率的平均值分別為61.32%和 74.53%。但兩種分子標(biāo)記技術(shù)所表現(xiàn)出的物種的遺傳信息不盡相同，可見，七里海中華絨螯蟹存在豐富的遺傳多樣性。

遺傳多樣性是指存在于生物個(gè)體間、單個(gè)物種間以及物種之間的基因多樣性[30]。一種生物的遺傳變異越突出、越多樣性，它對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力越強(qiáng)，同時(shí)一個(gè)物種對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力越強(qiáng)它的進(jìn)化潛力也就越大。群體的香農(nóng)—維納多樣性值是衡量群體遺傳多樣性的重要指標(biāo)，此數(shù)值越大則表明該物種的遺傳多樣性越高，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力也就越強(qiáng)。根據(jù)多態(tài)性條帶的基因頻率分別計(jì)算出RAPD和ISSR標(biāo)記技術(shù)群體內(nèi)香農(nóng)—維納多樣性指數(shù)為 18.3419和18.8425，群體內(nèi)香農(nóng)—維納多樣性值為0.1714和0.1778?？梢姡呃锖Ｖ腥A絨螯蟹第6代繁育群體具有較高的遺傳多態(tài)性。電泳圖譜可知，每個(gè)引物在該群體中，均表現(xiàn)出很高的多態(tài)性，同時(shí)也說明了RAPD和ISSR標(biāo)記技術(shù)可以成功地對(duì)七里海中華絨螯蟹核基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行遺傳多樣性分析。兩種標(biāo)記技術(shù)均能得到各自的的多態(tài)性條帶，但是所呈現(xiàn)的多態(tài)性和檢測(cè)水平各不相同，因此，結(jié)合RAPD和ISSR兩種標(biāo)記技術(shù)獲得的七里海中華絨螯蟹遺傳多樣性信息更全面客觀。

[1] 馬成學(xué), 李曉東, 王曉梅, 等. 絨螯蟹線粒體細(xì)胞色素b基因的RFLP分析[J]. 天津師范大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 26(3)：23-27.

[2] 李思發(fā), 工成輝, 趙乃剛. 湖泊放養(yǎng)長(zhǎng)江水系中華絨螯蟹的性成熟規(guī)律研究[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2001, 25(4)：251-257.

[3] 許步邵. 河蟹養(yǎng)殖技術(shù)[M]. 北京：金盾出版社, 1987：36-51.

[4] 張德隆, 杜小燕, 趙金利, 等. 河蟹性早熟成因及控制方法的研究[J]. 淡水漁業(yè), 2001, 31(4)：36-39.

[5] 劉偉. 長(zhǎng)江水系河蟹不同家系一齡蟹種生長(zhǎng)的比較研究[D]. 上海:上海海洋大學(xué), 2010.

[6] 谷孝鴻, 趙福順. 長(zhǎng)江中華絨螯蟹的資源與養(yǎng)殖現(xiàn)狀及其種質(zhì)保護(hù)[J]. 湖泊科學(xué), 2001, 13(3)：267-271.

[7] 彭武漢.中華絨螯蟹種群在珠江流域變異問題的初步探討[J]. 水產(chǎn)科技情報(bào), 1986, 13(2)：32-42.

[8] 張秀梅, 柳廣東, 高天翔. 絨螯蟹種質(zhì)資源研究進(jìn)展[J].青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 32(4)：533-542.

[9] 朱顏, 周國(guó)利, 吳玉厚, 等. 遺傳標(biāo)記的研究進(jìn)展和應(yīng)用[J]. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 26(1)：64-69.

[10] 胡鵬飛, 王茜, 戴偉, 等. 長(zhǎng)江水系中華絨螯蟹線粒體DNA的遺傳多樣性研究[J]. 水產(chǎn)學(xué)雜志, 2006, 19(1)：1-5.

[11] 高志千, 周開亞. 中華絨螯蟹遺傳變異的RAPD分析[J].生物多樣性, 1998, 6(3)：186-190.

[12] 鄭芳, 呂秀玲, 孫紅英, 等. ISSR標(biāo)記在河蟹種質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2007, 14(1)：46-51.

[13] 喬新美, 曹維孝, 鄒世平. 長(zhǎng)江、甌江中華絨螯蟹幾種同工酶的分析比較[J]. 淡水漁業(yè), 1994, 24(5)：10-13.

[14] Li G,Shen Q, Xu Z. Morphometric and biochemical genetic variation of the mitten crab,Eriocheir, in southern China [J]. Aquaculture, 1993,111(1/4)：103-115.

[15] Sui L Y, Zhang F M, Wang X M. Genetic diversity and population structure of the Chinese mitten crabEriocheirsinensisin its native range[J]. Mar Biol, 2009, 156(8)：1573-1583.

[16] Wachira F N, Waugh R, Hackett C A, et al. Detection of genetic diversity in tea(Camelliasinensis) using RAPD markers[J]. Genome, 1995, 38(7)：201-210.

[17] 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局網(wǎng).關(guān)于批準(zhǔn)對(duì)七里海河蟹實(shí)施地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)的公告[EB/OL].2006-12-22. [2015-09-16]http://www.aqsiq.gov.cn/xxgk_13386/jlgg_12538/zjgg/2006/200701/t20070118_315367.htm.

[18] Ayliffe M A,Lawrence G J,Ellis J G,et al. Hetero-duplex molecules formed between allelic sequences cause nonparental RAPD bands[J]. Nucleic Acids Research,1994, 22(9):1632-1636.

[19] Karp A, Edwards K J. Molecular technologies in the analysis of the extent and distribution of genetic diversity, IPGRI Workshop on molecular genetic tools in plant genetic resources[M]. Rome：IPGRI, 1995.

[20] 周孟嬌, 劉臻. RAPD 技術(shù)及其在蝦、蟹類研究中的應(yīng)用[J]. 水產(chǎn)科技情報(bào), 2003, 30(1)：25-28.

[21] 謝浩, 陸仁后, 項(xiàng)超美, 等. 利用RAPD技術(shù)對(duì)三種絨螯蟹親緣關(guān)系的研究[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 1999, 23(2)：120-125.

[22] 周開亞, 高志千. RAPD 標(biāo)記鑒別中華絨螯蟹種群的初步研究[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 1999, 5(2)：176-180.

[23] 李思發(fā), 鄒曙明. 中國(guó)大陸沿海6水系絨螯蟹(中華絨螯蟹和日本絨螯蟹)群體親緣關(guān)系：RAPD指紋標(biāo)記[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 1999, 23(4)：325-330.

[24] 邱濤, 陸仁后, 項(xiàng)超美, 等. RAPD 方法對(duì)中華絨螯蟹長(zhǎng)江、遼河、甌江三群體的遺產(chǎn)多樣性分析[J]. 淡水漁業(yè), 1997, 27(5)：3-6.

[25] 邱濤, 陸仁后, 項(xiàng)超美, 等. 用RAPD技術(shù)識(shí)別中華絨螯蟹性別差異[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),1998, 22(2)：175-177.

[26] 趙姝華, 張勝利, 溫恩濤, 等. 中華絨螯蟹RAPD擴(kuò)增條件及個(gè)體間遺傳差異[J].水產(chǎn)科學(xué), 1998, 17(5):3-6.

[27] 項(xiàng)超美, 陸仁后, 謝浩, 等. 四種十足目甲殼動(dòng)物遺傳差異的RAPD分析[J].水生生物學(xué)報(bào), 1998, 22(3)：251-256.

[28] Wolfe A D, Xiang Q Y, Kephart S R. Assessing hybridization in natural populations ofPenstemon(Scrophulariaceae) using hypervariable intersimple sequence repeat (ISSR) bands[J]. Molecular Ecology, 1998, 7(9)：1107-1125.

[29] 丁淑燕, 黃亞紅, 柏如發(fā), 等. 江蘇及安徽地區(qū)十個(gè)中華絨螯蟹成蟹群體的RAPD分析[J].水產(chǎn)科學(xué), 2008, 27(8)：418-420.

[30] 龐廣昌, 姜冬梅. 群體遺傳多樣性和數(shù)據(jù)分析[J]. 林業(yè)科學(xué), 1995, 31(6)：543-550.

AnalysisofGeneticDiversityofChineseMittenHandedCrabEriocheirsinensisfromQilihaibyRAPDandISSRMarkers

SHI Hongyue1，LIU Yang1，WANG Xiaomei1，GAO Jinwei1，QIU Linshan1，LI Jingjing2

( 1.Tianjin Key Laboratory of Aquatic Ecology and Aquaculture, College of Fisheries,Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2.Tianjin Aquatic Animal Infectious Disease Control and Prevention Center, Tianjin 300402, China )

Two types of molecular markers, namely, Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD) and Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR) were used to detect the genetic diversities at the intra sixth generation breeding population of Chinese mitten handed crabEriocheirsinensisfrom Qilihai. Using 10 RAPD primers selected from 33 primers, a total of 107 amplified loci ranging from 300 to 2300 bp were observed from 24 individuals, and 66 of 107 loci detected were polymorphic with the percent of 61.32%, and the Shannon′s index of 18.3419. Eight ISSR primers of 50 primers used generated 106 reproducible and stable bands, ranging from 200 to 1500 bp, 79 of 107 loci detected were polymorphic with the percent of 74.53%, and the Shannon′s index of 18.8425. These findings indicated that the sixth generation breeding population had high genetic diversity, and that the proportion of polymorphic loci and Shannon′s index of Qilihai Chinese mitten handed crab were high, indicating that they have abundant genetic diversity.

Eriocheirsinensisin Qilihai； genetic diversity; RAPD; ISSR

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.03.011

S917

A

1003-1111(2016)03-0255-06

2015-09-16；

2015-11-10.

天津市水產(chǎn)局科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(J2013-21).

石洪玥(1986-)，女，助理實(shí)驗(yàn)師；研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué).E-mail：youyan_shy@126.com.通訊作者：王曉梅(1962-)，女，教授；研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種及分子生物學(xué).E-mail： xiaomeiw@tjau.edu.cn.