張萌張華麗戴冬青 李西明 馬良勇

（中國水稻研究所，杭州310006；#共同第一作者；*

通訊作者：ricemaly@163.com）

環(huán)境對水稻花時(shí)的影響和花時(shí)調(diào)查統(tǒng)計(jì)方法的改進(jìn)

張萌#張華麗#戴冬青 李西明 馬良勇*

（中國水稻研究所，杭州310006；#共同第一作者；*

通訊作者：ricemaly@163.com）

花時(shí)在雜交稻制種中有著關(guān)鍵作用。明確環(huán)境對水稻花時(shí)的影響，選擇合適的花時(shí)調(diào)查統(tǒng)計(jì)方法可以加快對花時(shí)性狀的研究。本文以早花時(shí)突變體eft、正?；〞r(shí)材料日本晴（NIP）以及構(gòu)建的eft/NIP重組自交系群體為材料，通過分期播種親本，明確了溫度和光照對花時(shí)的影響規(guī)律；提出了一種以親本為標(biāo)準(zhǔn)的改進(jìn)的水稻花時(shí)調(diào)查和統(tǒng)計(jì)方法?；谠摳倪M(jìn)的花時(shí)調(diào)查和統(tǒng)計(jì)方法，能有效減弱環(huán)境因素對花時(shí)性狀的影響，可將樣本間的花時(shí)誤差由原來的0～30 min縮減至0～5 min，為水稻花時(shí)性狀的遺傳研究提供較為精確的數(shù)據(jù)。

水稻；花時(shí)；溫度；日長；調(diào)查統(tǒng)計(jì)方法

水稻（oryza sativa L.）是典型的自花授粉作物，水稻的穩(wěn)定高產(chǎn)在保障糧食安全中有著至關(guān)重要的作用。然而在水稻的生長周期中，病害、蟲害、干旱及高溫等都會造成其最終產(chǎn)量的顯著下降[1]。在水稻開花期，超過32℃的高溫會引起小穗不育從而造成大量減產(chǎn)[2-3]。由于全球氣候變暖，由高溫脅迫造成的水稻減產(chǎn)正逐步成為糧食安全的威脅，而水稻早花時(shí)可以有效避免高溫等不良天氣對受精的影響，從而大大提高結(jié)實(shí)率[3-4]。隨著雜交水稻的廣泛應(yīng)用，雜交水稻種子生產(chǎn)過程中父母本的花時(shí)不遇（即父母本開花高峰錯(cuò)位的現(xiàn)象）導(dǎo)致制種失敗或制種產(chǎn)量低的問題日益突出[5-6]。特別是近年來隨著秈粳亞種間雜種優(yōu)勢利用研究的不斷深入，一批強(qiáng)優(yōu)勢的“粳不秈恢”（不育系偏粳，恢復(fù)系偏秈）組合如“甬優(yōu)”、“春優(yōu)”和“浙優(yōu)”系列的育成，為大面積水稻高產(chǎn)帶來了新的機(jī)遇。但“粳不秈恢”制種產(chǎn)量普遍低下，嚴(yán)重制約了這些強(qiáng)優(yōu)勢組合在生產(chǎn)上的廣泛應(yīng)用[7]。究其原因，主要是因?yàn)榫静挥低^不外露或外露率較低，只能在不育系開花時(shí)接受同時(shí)開花的恢復(fù)系的花粉[8-12]。然而，由于不育系本身的生理特性，開花時(shí)間比正常的品種晚，而秈稻又比粳稻開花早約1 h，造成“粳不秈恢”制種父母本嚴(yán)重花時(shí)不遇，從而制種產(chǎn)量低[6，13-15]。因此，遺傳育種家越來越重視水稻花時(shí)的研究。

但是，由于水稻花時(shí)的差異，不僅與遺傳因素有關(guān)，而且還受到環(huán)境和人為因素的影響[16]，花時(shí)的調(diào)查困難成為制約花時(shí)研究的關(guān)鍵。影響花時(shí)的環(huán)境因素主要包括溫度、濕度、光照、風(fēng)力及CO2等。其中，環(huán)境因素中對父母本花時(shí)影響最大的是溫度。前人的田間觀察研究結(jié)果表明，一天的平均氣溫影響開花的早晚，高溫利于開花提早[2，17-19]。因此，本文通過分期播種的方法明確溫度對花時(shí)的影響規(guī)律，并基于這一規(guī)律改進(jìn)了花時(shí)調(diào)查統(tǒng)計(jì)方法，以期為水稻花時(shí)的遺傳研究提供精確可靠的數(shù)據(jù)，為今后水稻及其他植物的花時(shí)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

早花時(shí)突變體eft：從春江06（CJ06）和TN1所構(gòu)建的DH群體中發(fā)現(xiàn)的早花時(shí)突變體（eft），在海南3月中旬抽穗，開花時(shí)間為上午9∶00～9∶30，比正常秈稻早2 h左右；在杭州8月上中旬抽穗，開花時(shí)間為上午7∶00～7∶30，比正常秈稻開花早約1.5～2 h；9月上中旬則在9∶00左右開花，比正常秈稻早約2 h。

正?；〞r(shí)親本日本晴（Nipponbare，NIP）：典型粳稻，相同環(huán)境下比eft的花時(shí)遲1.7～3.5 h，平均約推遲

2.5 h。

重組自交系群體（F10）：2008年夏利用早花時(shí)突變體eft和典型粳稻品種日本晴雜交，獲得F1雜交種子并于當(dāng)年冬季種植于海南陵水南繁基地；收獲F2種子，并于2009年夏種植于中國水稻研究所富陽試驗(yàn)基地；其后通過單粒傳的方法，在杭州和海南加代，至2015年獲得農(nóng)藝性狀穩(wěn)定的F10群體，包含184個(gè)株系。

表1 親本eft和NIP的花時(shí)記載情況

所有材料均種植于中國水稻研究所富陽試驗(yàn)基地，每株系2行，每行6株，單本種植，常規(guī)栽培管理。

1.2 試驗(yàn)方法

水稻開花在一瞬間完成，精確的記錄每個(gè)開花瞬間相對困難?；〞r(shí)的研究一般以群體的盛花時(shí)研究為主，調(diào)查多采用目測法，即以小區(qū)為單位觀察記錄水稻開花高峰?；〞r(shí)的調(diào)查和數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)對花時(shí)性狀研究的精確性和可靠度有著至關(guān)重要的作用。

1.2.1 環(huán)境影響花時(shí)規(guī)律的研究

杭州屬長日照，該重組自交系在此長日照下抽穗期較為分散，持續(xù)時(shí)間較長，如重組自交系群體中最早的株系抽穗期為7月27日，最遲的株系9月23日才抽穗。此段時(shí)間內(nèi)，包括氣溫、濕度、光照等的外界環(huán)境不斷變化，水稻花時(shí)也隨之變化。為排除此時(shí)段內(nèi)外界環(huán)境對花時(shí)的影響，必須清楚環(huán)境如何影響花時(shí)。親本采用分期播種，自4月29日起，每隔6 d播種1期，共播種7期。日本晴的生育期較短，開花時(shí)間從7月25日的9∶05到8月28日的10∶30；eft的花時(shí)記載則從7月28日的7∶20到9月25日的9∶40，持續(xù)到整個(gè)RIL群體抽穗期。除雨天外連續(xù)記錄2個(gè)親本的具體花時(shí)，每5 d取1個(gè)平均值作為該段時(shí)間的花時(shí)，并對eft的花時(shí)與溫度和日照長短分別進(jìn)行相關(guān)性分析。

水稻開花期溫度等環(huán)境數(shù)據(jù)的獲得：通過網(wǎng)站http∶//richurimo.51240.com獲取試驗(yàn)地點(diǎn)的日平均溫度、最高溫度、最低溫度和晝長（日照長短）數(shù)據(jù)。

1.2.2 花時(shí)性狀的調(diào)查

2015年夏，調(diào)查杭州F10花時(shí)性狀，采用單株目測動態(tài)調(diào)查的方法。根據(jù)真實(shí)花時(shí)不斷變換調(diào)查時(shí)間，使記載數(shù)據(jù)與真實(shí)花時(shí)相近，減少人為因素的干擾。例如，上午9∶00調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)株系1已達(dá)盛花，不能確定該株系早在9∶00之前多久盛花，第2天提早5 min左右調(diào)查，若株系1未開或未達(dá)盛花，則將該株系花時(shí)記為9∶00；反之，第3天繼續(xù)提早5 min于8∶50左右調(diào)查，若株系1未開或未達(dá)盛花，則將該株系花時(shí)記為8∶ 55；反之，繼續(xù)提前5 min調(diào)查，直至發(fā)現(xiàn)該株系未達(dá)盛花為止。此方法必須保證調(diào)查這幾天天氣變化不大，若中間天氣不符，可選擇剔除不一致天氣的記載數(shù)據(jù)，以避免環(huán)境變化對調(diào)查產(chǎn)生的誤導(dǎo)。每個(gè)株系均連續(xù)調(diào)查5～7 d，以期得到更接近真實(shí)花時(shí)的數(shù)據(jù)。本研究中水稻盛花時(shí)標(biāo)準(zhǔn)定為每株系（2行12株）每叢有3朵以上穎花開放。

1.2.3 花時(shí)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)

本研究中花時(shí)目測法調(diào)查的花時(shí)性狀數(shù)據(jù)基本接近真實(shí)花時(shí)，但是整個(gè)重組自交系（RIL）群體抽穗期歷時(shí)較長，使每個(gè)株系開花時(shí)間的差異不僅取決于遺傳因素，同時(shí)受氣候環(huán)境變化的影響，沒有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，無法將所記載花時(shí)數(shù)據(jù)作為QTL定位數(shù)據(jù)，故在改進(jìn)調(diào)查方法的基礎(chǔ)上改進(jìn)花時(shí)統(tǒng)計(jì)方法。將分期播種的親本花時(shí)作為同一生育期RIL群體各株系的統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)，以減少環(huán)境的干擾。

本試驗(yàn)新創(chuàng)建了不同于前人分級統(tǒng)計(jì)法[20-21]的花時(shí)差統(tǒng)計(jì)法，即調(diào)查重組自交系花時(shí)期間，每天采用目測法調(diào)查早花時(shí)親本eft花時(shí)和重組自交系花時(shí)，將同一個(gè)生育期的早花時(shí)親本eft作為參考，計(jì)算其與同一天開花的株系的花時(shí)之差（花時(shí)差=某株系的盛花時(shí)-同期抽穗的親本eft的盛花時(shí)）作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，以分鐘（min）為單位，為后續(xù)遺傳分析所用。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對花時(shí)的影響

從表1可看出，不同時(shí)期內(nèi)，親本eft和NIP各自的花時(shí)相差很大，但是親本eft的花時(shí)均早于同一時(shí)期的NIP的花時(shí)，二者的花時(shí)相差約為1.7～3.5 h。

利用eft的花時(shí)以及水稻開花期試驗(yàn)地的氣溫及日照長短，構(gòu)建了親本eft具體花時(shí)隨環(huán)境因素的變化散點(diǎn)圖（圖1）。從圖1整個(gè)RIL抽穗期間親本eft花時(shí)與溫度、光照等環(huán)境因素的變化趨勢，可以看出在整個(gè)重組自交系抽穗期間，日平均氣溫逐漸降低，eft花時(shí)隨之逐漸推遲，晝長則呈現(xiàn)一定斜率下降的趨勢，即總體來說，隨著時(shí)間的推移，溫度逐漸降低，日照時(shí)數(shù)減少，花時(shí)推遲。親本eft花時(shí)與溫度、日照長短的相關(guān)性分析表明，eft花時(shí)與日最低溫、日平均氣溫、日最高溫、日照長短的相關(guān)系數(shù)分別為-0.9019**、-0.8429**、-0.7756**、-0.9152**（表2）。表明花時(shí)與溫度、日照長短均呈極顯著負(fù)相關(guān)，其中日最低溫度決定了水稻的初始開花時(shí)間，這與一天中氣溫變化的規(guī)律相符。這一結(jié)果進(jìn)一步從數(shù)據(jù)上直觀證明“溫度升高，花時(shí)提早；日照時(shí)數(shù)增加，花時(shí)提早”的結(jié)論[2，17，22]，并且進(jìn)一步表明最低溫度直接影響花時(shí)遲早。

表2 親本eft與溫度、日照長度的相關(guān)性分析

圖1 RIL抽穗期內(nèi)親本花時(shí)、氣溫、日照時(shí)數(shù)的變化

圖2 RIL群體花時(shí)調(diào)查及統(tǒng)計(jì)分布結(jié)果

2.2 花時(shí)調(diào)查統(tǒng)計(jì)結(jié)果

花時(shí)調(diào)查結(jié)束后，將所記載的RIL花時(shí)數(shù)據(jù)，按照每30 min歸為一級，分級統(tǒng)計(jì)可將184個(gè)RIL群體分為9級，其中早花時(shí)親本eft屬于第1級，正常花時(shí)親本NIP屬于第6級，兩者花時(shí)差別較大（圖2A）。以各株系與eft的花時(shí)差作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的結(jié)果見圖2B。與分級法類似，花時(shí)差法也在中部出現(xiàn)一個(gè)波谷，即處于eft花時(shí)與NIP花時(shí)之間有個(gè)時(shí)間段，達(dá)盛花時(shí)的株系數(shù)明顯較少（圖2B）。

2.3 與前人調(diào)查統(tǒng)計(jì)方法的比較

前人花時(shí)的研究多采用分級目測法[20-21]。萬國等[21]將花時(shí)調(diào)查周期控制在30 min，并將花時(shí)分為6級，9∶30以前定為第1級，9∶31～10∶00為第2級，10∶01～10∶30為第3級，以此類推。而本試驗(yàn)將花時(shí)性狀的調(diào)查統(tǒng)計(jì)方法分割成兩個(gè)獨(dú)立的部分，即目測調(diào)查和花時(shí)差統(tǒng)計(jì)，調(diào)查時(shí)盡量使記載數(shù)據(jù)接近真實(shí)花時(shí)，統(tǒng)計(jì)時(shí)又盡可能減少環(huán)境的影響。2種調(diào)查統(tǒng)計(jì)方法并沒有實(shí)質(zhì)性差別，最大的不同在于精確度。前人所采用的花時(shí)分級研究方法相對較為粗糙，不僅沒有考慮到環(huán)境對花時(shí)的影響，而且花時(shí)的絕對誤差在0～30 min之間，與真實(shí)花時(shí)的差距有大有小，兩個(gè)相鄰花時(shí)級數(shù)的株系真實(shí)花時(shí)差在1～59 min，同一級數(shù)的株系真實(shí)花時(shí)差也在0～30 min，很難達(dá)到一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)；而本研究改進(jìn)的花時(shí)目測法根據(jù)真實(shí)花時(shí)隨時(shí)更改調(diào)查時(shí)間，多次追蹤調(diào)查，使調(diào)查結(jié)果更為精確，絕對誤差僅在幾分鐘之內(nèi)，更加接近真實(shí)花時(shí)，改進(jìn)的花時(shí)統(tǒng)計(jì)法只需計(jì)算早花時(shí)親本eft與每個(gè)株系的花時(shí)差，此數(shù)據(jù)直接作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析，這一方法使花時(shí)數(shù)據(jù)保持原貌，使表型數(shù)據(jù)值更加豐富，可能會使花時(shí)QTL定位更為精確。

3 討論

本研究表明，雖然整個(gè)重組自交系抽穗期內(nèi)，所調(diào)查的親本花時(shí)除了部分?jǐn)?shù)據(jù)來自日本晴外，整個(gè)生育期完整的花時(shí)數(shù)據(jù)則來自同一材料eft，但花時(shí)差異卻十分明顯，這只能是環(huán)境因素所導(dǎo)致的。蒯建敏等[17]研究也表明，氣象條件的不一致性是造成同一品種在不同日期間花時(shí)差異的重要乃至主要因素。圖1表明，溫度升高促進(jìn)花時(shí)提早，溫度降低則使花時(shí)推遲，這與前人的研究一致[8-9，17]；此外，日照時(shí)數(shù)的減少使花時(shí)推遲，這也與蒯建敏等[17]研究結(jié)果一致，即日照時(shí)數(shù)的增加對水稻有促進(jìn)開花的作用。有趣的是，在9月1日至5日這段時(shí)間內(nèi)，溫度上升，花時(shí)反而推遲，與正常趨勢相悖（圖1）。推測有2種可能性：一是存在一個(gè)晝長臨界點(diǎn)，即在晝長＜13 h時(shí)，花時(shí)不再隨溫度的升高而提早，這段時(shí)間內(nèi)花時(shí)主要受日照長短的影響，而受溫度影響不大；二是花時(shí)受溫度和日照長短的影響，兩種因素相互協(xié)調(diào)又相互競爭，正常情況下，二者共同調(diào)控花時(shí)早遲，但當(dāng)二者發(fā)生沖突時(shí)，強(qiáng)的一方起主導(dǎo)作用，此時(shí)花時(shí)主要受強(qiáng)環(huán)境因子影響。高溫促進(jìn)花時(shí)提早是否存在一個(gè)日照時(shí)數(shù)臨界點(diǎn)，還有待于進(jìn)一步研究。

無論溫度和日照如何影響，本研究中兩親本的開花時(shí)間差基本固定，啟示筆者可以用品種間的時(shí)間差來作為區(qū)分不同品種水稻的依據(jù)，即用目標(biāo)單株（株系）與同一親本的花時(shí)差來作為該單株（株系）的花時(shí)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

目前用于花時(shí)的研究方法主要是點(diǎn)花法[20，23-25]和目測法[17，19，21]。點(diǎn)花法是以穗為單位的調(diào)查方法，標(biāo)記單穗在一定時(shí)間間隔內(nèi)的開花數(shù)，一般情況下全部或部分剪除已開穎花，以方便統(tǒng)計(jì)下一時(shí)段的開花數(shù)；目測法則是以小區(qū)為單位的調(diào)查方法只是觀察記錄水稻開花的高峰期。二者雖在廣泛應(yīng)用，但是由于人為干擾和溫度、日照等環(huán)境因素的影響很難得到大量的精確數(shù)據(jù)，目前花時(shí)性狀的調(diào)查仍是制約花時(shí)遺傳研究和解決花時(shí)不遇問題的主要因素。

本文所提出的經(jīng)過改進(jìn)的花時(shí)研究方法是在傳統(tǒng)的目測法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，秉承了目測法高效、快速的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又極大的避免了傳統(tǒng)目測法記載誤差過大的缺陷。本方法操作簡單、快捷、可靠，與前人方法相比，該方法得到的數(shù)據(jù)，完全可以滿足QTL定位的要求。因此，該改進(jìn)方法在植物花時(shí)研究中將有廣泛的應(yīng)用前景。

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Environment Influence and Improvement of Investigation and Statistical Methods on Flowering Time in Rice

ZHANG Meng#,ZHANG Huali#,DAI Dongqing,LI Ximing,MA Liangyong*
（China National Rice Research Institute,Hangzhou,310006,China;#These authors contributed equally to this work;*Corresponding author:ricemaly@163.com）

Rice flowering time is a critical factor for seed production in hybrid rice.The research of rice flowering time could be promoted by clarification the influence of environment and utilization appropriate investigation and statistical method.In the present study,the regularity of flowering time changing with temperature and day length was clarified though sowing parents by stages.Simultaneously,an effective investigation and statistical method was firstly established to investigate rice flowering time in the field no matter how the environment changes,based on a recombinant inbred line population including 184 lines from the cross between Nipponbare and the early flowering time mutant eft.The improved method could effectively mitigate the influence of environmental on flowering time and reduce the error of flowering time from 0～30 min to 0～5 min.The method may provide more accurate data to study rice flowering time traits in the future.

rice;flowering time;temperature;day length;investigation and statistical methods

S511

A

1006-8082（2016）06-0010-05

2016－09－08

國家“863”計(jì)劃（2014AA10A604-15）；國家自然科學(xué)基金（31071080）；浙江省公益性農(nóng)業(yè)項(xiàng)目（2011C22002）；國家自然科學(xué)基金（31501288）；浙江省自然科學(xué)基金（LQ16C130002）；中央級科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（2014RG003-3）