張婷

摘要 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗法對油茶產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌的發(fā)酵條件進行研究，結(jié)果表明，油茶產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌Y-UH-2的最適發(fā)酵條件為：培養(yǎng)基起始pH值為7，接種量為5 %，培養(yǎng)溫度為28 ℃，轉(zhuǎn)速170 r/min，其黃酮產(chǎn)量為3.18 mg/100 mL，比未優(yōu)化時高出42%。

關(guān)鍵詞 黃酮產(chǎn)量；油茶；植物內(nèi)生菌；單因素優(yōu)化；正交優(yōu)化

中圖分類號 S794.4 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）20-0260-02

Optimization of Fermentation Conditions of Flavonoids-producing Strain of Camellia oleifera

ZHANG Ting

（College of Bioengineering，Jingchu University of Technology，Jingmen Hubei 448000）

Abstract The fermentation conditions of flavonoids producing strain of Cemellia oleifera were studied using orthogonal test，based on the single factor experments.The results showed that the optimum factors were as follow：the optimal intial pH value was 7，inoculation amount was 5%，the culture temperature was 28 ℃，fermentation speed was 170 r/min.The flavonoids yield was 3.18 mg/100 mL，improved by 42%，compared with the original state of strain Y-UH-2.

Key words flavonoids yield；Camellia oleifera；endophyte；single factor experments；the orthogonal test

植物內(nèi)生真菌是指在一定階段或全部階段生活于健康植物的組織和器官內(nèi)部的真菌，普遍存在于植物中[1]。由于內(nèi)生真菌長期存在于宿主植物中，與宿主植物共同進化，能產(chǎn)生與宿主植物類似的活性物質(zhì)，目前已成為生物防治中有潛力的微生物農(nóng)藥、增產(chǎn)菌或作為潛在的生防載體菌而加以利用[2]。油茶（Camellia oleifera），別名茶油樹、茶子樹、白花茶，常綠小喬木。油茶是我國獨有的一種食用油料木本植物。茶油色清味香，營養(yǎng)豐富，且耐貯藏，是優(yōu)質(zhì)的食用油。另外，也可作為潤滑油、防銹油用于工業(yè)。茶油中含有的不飽和脂肪酸高達90%，遠(yuǎn)高于菜油、花生油和豆油，與橄欖油相比VE含量高1倍，并且含有山茶甙等特定生理活性物質(zhì)，具有相當(dāng)高的營養(yǎng)價值。茶殼還是一種很好的食用菌培養(yǎng)基[3]。研究發(fā)現(xiàn)，油茶葉中含有多種黃酮類化合物，對這些黃酮類的獲得方式主要依賴于提取[4]。本研究對前期獲得的油茶產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌的誘變菌株Y-UH-2進行發(fā)酵工藝優(yōu)化，希望能為今后的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株。以油茶產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌菌株的誘變菌株Y-UH-2為試驗菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基。采用PDA培養(yǎng)基[5]，培養(yǎng)基配制完畢后，高壓滅菌鍋121 ℃，20 min。

1.1.3 試劑。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品購自荊州昌華試劑公司，葡萄糖、瓊脂、蛋白胨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、蔗糖、氯化鈉、硝酸銨、硝酸鈉、氯化鉀、硫酸亞鐵、乙酸乙酯等均為分析純，購自武漢科普化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SHZ-3 循環(huán)水多用真空泵：上海滬西分析儀器廠有限公司；JJ-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺：蘇州金凈凈化設(shè)備科技有限公司；722s可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；DHWY-200B 恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；DH-600A 電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京科偉永興儀器有限公司；100S-11高壓滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵單因素優(yōu)化試驗。參照冷桂華等[6-8]的研究文獻選取培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基起始pH值、轉(zhuǎn)速和接種量這4種單因素水平，如表1所示。

1.3.2 正交試驗。結(jié)合單因素優(yōu)化結(jié)果，選取4個單因素的各3個水平，如表2所示，用L9（34）進行正交試驗設(shè)計。

1.3.3 黃酮含量的測定。按照沈建福等[9]的方法，測定一系列濃度不同的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的吸光值，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。再根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 培養(yǎng)溫度對發(fā)酵結(jié)果的影響。培養(yǎng)溫度對發(fā)酵條件的影響如圖1所示，溫度會影響菌株的生長繁殖速度，從而影響其代謝物質(zhì)的產(chǎn)量。當(dāng)培養(yǎng)溫度過低，僅20 ℃時，菌株生長緩慢，發(fā)酵密度降低，增加溫度，菌株生長速度提高，但繼續(xù)增加溫度超過28 ℃時，溫度過高影響了菌株的代謝過程，阻礙菌株中黃酮物質(zhì)的積累，因此產(chǎn)黃酮含量少。在其他條件同等條件下，最適培養(yǎng)溫度為28 ℃。

2.1.2 轉(zhuǎn)速對發(fā)酵結(jié)果的影響。轉(zhuǎn)速對菌株發(fā)酵產(chǎn)黃酮的影響如圖2所示。當(dāng)轉(zhuǎn)速為100 r/min時，轉(zhuǎn)速過低，影響溶氧效果，導(dǎo)致菌株生長緩慢，適當(dāng)提高轉(zhuǎn)速，菌絲生長狀況得到提升，轉(zhuǎn)速過高超過150 r/min時，導(dǎo)致菌體濃度下降，黃酮產(chǎn)量隨之下降。因此，選擇最適轉(zhuǎn)速為150 r/min。

2.1.3 接種量對發(fā)酵結(jié)果的影響。當(dāng)接種量為3%時，接種量少，菌株生長緩慢，黃酮產(chǎn)量偏低；增加接種量至5%時，黃酮產(chǎn)量隨之增加，繼續(xù)增加接種量，黃酮產(chǎn)量并沒有繼續(xù)增加，反而下降了，可能是接種量過大，營養(yǎng)不夠，抑制了菌株的生長，使得黃酮產(chǎn)量也隨之降低。因此，應(yīng)該接入合適的菌量，使其快速生長。如圖3所示，在其他條件不變的情況下，產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌發(fā)酵最適接種量為5%。

2.1.4 培養(yǎng)基起始pH值對發(fā)酵結(jié)果的影響。在微生物生長過程中，pH值影響微生物的生長繁殖。適合pH值既有利于菌體的生長繁殖，又可以最大限度地獲得高的產(chǎn)量。因為發(fā)酵過程中pH值是不斷變化的，所以起始pH值顯得尤為重要。如圖4所示，當(dāng)pH值為5～7時，菌株發(fā)酵產(chǎn)黃酮產(chǎn)量逐漸上升，可能此時利用菌株生長，菌株發(fā)酵代謝產(chǎn)黃酮能力較強，再增加pH值，影響菌株的代謝過程，導(dǎo)致黃酮產(chǎn)量下降，因此選擇最適起始pH值為7。

2.2 正交試驗結(jié)果

在單因素試驗結(jié)果上，進行正交試驗，以黃酮含量為指標(biāo)得到的結(jié)果如表3所示。極差顯示RC>RB=RA>RD，由此可見，培養(yǎng)基起始pH值因素對發(fā)酵過程產(chǎn)生的黃酮含量有明顯影響。表3顯示發(fā)酵培養(yǎng)的最佳因素組合為A3B2C2D2。按照這個試驗組合進行3組平行試驗進行驗證，黃酮含量分別為3.20、3.19、3.16 mg/100 mL，平均含量為3.18 mg/100 mL。均高于正交試驗的任何一組，比未優(yōu)化前誘變菌株Y-UH-2（2.24 mg/100 mL）高出42%（表4），這表明油茶產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌的最佳發(fā)酵條件是轉(zhuǎn)速 170 r/min，接種量為5 %，培養(yǎng)基起始pH值為7，培養(yǎng)溫度為28 ℃。

3 結(jié)論

利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)有價值的代謝產(chǎn)物時，培養(yǎng)條件如pH值、發(fā)酵溫度等可變因子較多，因此在微生物培養(yǎng)時對培養(yǎng)條件的優(yōu)化顯得尤為重要。本試驗結(jié)果表明產(chǎn)黃酮油茶內(nèi)生真菌的發(fā)酵培養(yǎng)最佳條件是培養(yǎng)基起始pH值為7，接種量為5%，培養(yǎng)溫度為28 ℃，轉(zhuǎn)速 170 r/min，比未優(yōu)化前產(chǎn)量提高了42%，高于張海龍等[10]在銀杏中篩選出的產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌的黃酮產(chǎn)量。在后續(xù)的研究中，還需進一步提高菌株產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的能力，為開啟黃酮類物質(zhì)獲取的新途徑提供試驗依據(jù)。

4 參考文獻

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[10] 張海龍，李善春，盧維浩，等.銀杏內(nèi)生真菌多樣性與產(chǎn)黃酮類物質(zhì)真菌的分離和鑒定[J].土壤，2015，47（1）：135-141.