李建省，靳 鋒，王寶蕊，張竹君，楊維建，丁文君，張新麗，徐 進

甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

管通方醇提物對人食管癌EC9706細胞抑制作用的研究*

李建省，靳 鋒，王寶蕊，張竹君，楊維建，丁文君，張新麗，徐 進

甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

目的:通過觀察管通方醇提物對食管癌EC9706細胞增殖、細胞周期的影響，揭示該方抑制食管癌EC9706生長的作用機制。方法:體外培養(yǎng)食管癌EC9706細胞，用管通方醇提物處理細胞，M TT法檢測管通方醇提物對食管癌EC9706細胞增殖影響的量效關系；倒置顯微鏡下觀察食管癌EC9706細胞形態(tài)學變化；PI單染標記流式細胞術檢測醇提物對食管癌EC9706細胞周期的影響。結果:管通方醇提物均可不同程度地抑制食管癌EC9706細胞的增殖，其抑制率呈劑量依賴關系；管通方醇提物影響了細胞形態(tài)結構。管通方醇提物對EC9706細胞周期各時相均有影響。與對照組比較，管通方組G0/G1期細胞比率升高(P＜0.05)。結論:管通方醇提物將食管癌EC9706細胞阻滯于G0/G1，阻滯細胞周期的進程，該方對食管癌EC9706細胞的增殖具有抑制作用。

食管癌；EC9706細胞；管通方；細胞周期阻滯

食管癌是全世界最常見的六大惡性腫瘤之一，我國是世界上食管癌發(fā)病率和病死率最高的國家，食管癌居惡性腫瘤死亡第四位［1］。每年全世界新診斷的30萬食管癌患者中，1/2(16.72萬)以上發(fā)生在中國，并且預后極差，5年生存率僅10%左右［2-3］。因此對食管癌的防治研究是中國乃至全世界食管癌研究者的重點、難點和熱點。中醫(yī)藥治療食管癌具有獨特的優(yōu)勢，筆者運用管通方治療食管癌取得滿意療效。本研究通過研究管通方醇提物對食管癌EC9706細胞增殖及細胞周期的影響，探討該方治療食管癌的作用機制，為進一步研究該方提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑 人食管癌細胞株EC9706購于上海中科院細胞庫，RPMI Medium 1640培養(yǎng)基(索萊寶公司生產(chǎn)，批號:31800-500)、細胞周期檢測試劑盒(南京凱基生物公司生產(chǎn)，批號:KGA512)、Tyrode液自行配制、小牛血清(杭州四季青公司生產(chǎn)，批號:121005)、胰蛋白酶(索萊寶公司生產(chǎn)，批號: T1320-100)、MTT(索萊寶公司生產(chǎn)，批號:T1320-100)、DMSO(Amresco)、70%乙醇、PBS自行配制。

1.2 儀器 FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司提供)、Heraeus細胞培養(yǎng)箱(美國Kendro公司提供)、倒置顯微鏡(ZEISS公司提供)、3-18K臺式離心機(Sigma公司提供)、SG-603生物安全柜(Bake公司提供)。

1.3 細胞分組 以1×106cells/皿細胞密度種EC9706細胞于φ100 mm培養(yǎng)皿中，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時后，棄上清液，設空白對照組及管通方400、800、1 600 μg/mL組，共4組，各藥物組分別加入含IC50且藥物濃度為10%小牛血清培養(yǎng)基10 mL，空白對照組加等量含10%小牛血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。

1.4 管通方醇提物制備 管通方由斑蝥、旋覆花、黃芪、牛膝等組成，稱取以上方95%的乙醇提取并干燥，溶解于二甲基亞砜(DMSO)，配制成濃度為300 μg/μL的藥液，然后用不含血清的培養(yǎng)基RPMI1640，配成4 μg/μL的貯存液，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 M TT法測定管通方醇提物對EC9706細胞增殖影響的量效關系 以5×103個細胞/孔的密度接種于96孔平面培養(yǎng)板，含小牛血清培養(yǎng)液200μL/孔，于37℃，5%CO2飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時，棄上清液，加入含管通方醇提物的10%小牛血清培養(yǎng)基200 μL，濃度分為25、50、100、200、400、800、1 600、3 200 μg/mL8個梯度，每組設3個復孔，空白對照組加含10%小牛血清的培養(yǎng)基200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。棄上清液，每孔加100 μL含0.2 mg/mL MTT的無血清培養(yǎng)基，孵育4小時，棄上清液。每孔加入150 μL DMSO，振蕩10分鐘后用酶標儀以570 nm/630 nm測定光吸收值(OD)。實驗重復3次。按照腫瘤細胞生長抑制率(%)=(1-用藥組OD值/對照組OD值)×100%公式計算各藥物組對腫瘤細胞增殖的抑制率。運用SPSS 13.0進行曲線擬合，并根據(jù)概率估計，求出藥物半數(shù)有效量(IC50)。

1.6 細胞形態(tài)觀察 以1×106cells/皿的密度接種EC9706細胞于φ100mm培養(yǎng)皿中，10mL/皿，于37℃，5%CO2，飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時。分別加入含管通方醇提物400、800、1600μg/mL的10%小牛血清培養(yǎng)基200 μL，空白對照組加含10%小牛血清的培養(yǎng)基200 μL，培養(yǎng)48小時，倒置相差顯微鏡下觀察各組EC9706細胞形態(tài)變化，拍×200照片。

1.7 流式細胞儀測定細胞周期 加藥培養(yǎng)48小時后，棄上清液，加入2.5 mL0.25%胰蛋白酶消化2～3分鐘，2 000 r/min離心5分鐘，棄上清液后加入5 mL PBS重懸細胞，計數(shù)，按照凱基細胞DNA含量檢測試劑盒操作方法，收集并調整細胞濃度為1×106/mL，2 000 r/min離心5分鐘，加入PBS清洗，用70%乙醇固定過夜。按細胞周期檢測試劑盒操作，采用FACSCalibur流式細胞儀對各組樣品進行檢測，每樣本獲取104個細胞熒光信號，激發(fā)波長488 nm，用CellQuest Pro獲取、分析軟件檢測EC9706細胞周期分布。周期分布用GO/G1%，S%，G2/M%表示。

1.8 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)運用SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 管通方醇提物對EC9706細胞形態(tài)的影響 管通方醇提物1 600、800、400 μg/L處理細胞后，低濃度(400 μg/L)組與對照組比較，細胞形態(tài)變化不明顯。中濃度(800 μg/L)組細胞生長較分散，細胞分裂減少，胞內(nèi)充滿大量顆粒狀或空泡樣物質，部分細胞核變小，核仁數(shù)目減少，染色質凝聚。高濃度(1 600 μg/L)組細胞增長緩慢，細胞間接觸松散，細胞匯合率低，出現(xiàn)部分漂浮細胞，可見部分細胞膜皺縮發(fā)泡，少量細胞固縮呈圓形或卵圓形且透亮。見圖1。

圖1 管通方醇提物不同濃度對食管癌EC9706細胞形態(tài)影響

2.2 管通方醇提物對EC9706細胞增殖影響的量效關系 以管通方醇提物藥物濃度為橫坐標、抑制率為縱坐標，運用SPSS 13.0回歸分析進行曲線擬合，擬合劑量-效應關系曲線，并按概率估計求出IC50值。結果顯示管通方醇提物對EC9706細胞生長具有抑制作用，并呈劑量依賴性關系。8個梯度中，1 600 μg/mL濃度時，抑制率最高，提示800 μg/mL為有效藥物劑量，1 600 μg/mL時發(fā)生細胞毒性作用。見表1。

表1 管通方醇提物對EC9706細胞增殖的影響

2.3 管通方醇提物對細胞周期的影響 管通方醇提物處理EC9706細胞48小時，用流式細胞儀檢測各期細胞數(shù)量。隨藥物濃度的增加，EC9706細胞在細胞周期中的分布出現(xiàn)明顯的變化與對照組比較，G0/G1期細胞比率逐漸增加，S期和G2/M細胞比率逐漸減少，低濃度組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，中濃度組、高濃度組時與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 管通方醇提物對細胞周期的影響(s) %

表2 管通方醇提物對細胞周期的影響(s) %

注:△表示與對照組比較P＜0.05。

組別 G0/G1S G2/M對照組 41.85±0.56 35.41±0.32 22.27±13.10高濃度組 54.51±1.27△31.79±0.43△13.71±1.38△中濃度組 45.34±1.10△34.27±0.68△19.94±1.27△低濃度組 42.89±0.70 36.82±0.67 20.25±1.08

3 討論

食管癌屬于中醫(yī)“噎膈”范疇［4-5］，中醫(yī)學認為虛、痰、瘀、郁、氣是噎膈的主要病因病機?，F(xiàn)代醫(yī)家以化痰瘀、消癌腫、通壅阻、降逆氣治法治療，可明顯改善癥狀。筆者認為“腫瘤的本質是細胞水平上陰陽平衡失調，腫瘤細胞增殖失控(陽盛)，凋亡不足(陰衰)，即細胞水平上陽盛陰衰導致腫瘤發(fā)生”［6］。司富春等［7-8］對單味藥物及中藥復方進行實驗研究，發(fā)現(xiàn)其可抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡，上調Fas，下調Bcl-2和激活caspase-3。

本研究通過文獻分析，并結合臨床研究，自擬管通方由班蝥、旋覆花、黃芪、牛膝等藥物組成，具有益氣活血、解毒散堅之功，治療食管癌具有良好的效果，但抗癌作用尚不清楚，本研究對管通方醇提物進行體外研究，觀察其對人食管癌EC9706細胞增殖及細胞周期的影響［9］。在此過程中細胞遺傳物質復制并加倍且在分裂結束時平均分配至兩個子細胞中，通過流式細胞術PI染色法對細胞內(nèi)DNA含量進行檢測時，可將細胞周期各時相區(qū)分為G1/G0期、S期和G2/M期，并計算出各時相的百分比。腫瘤細胞均有其自身的生長周期特征與規(guī)律，通常情況下，細胞的G0/G1期持續(xù)時間最長，因此，G0/G1期細胞比率最高；G2/M期時間相對較短，因此，處于G2/M期細胞比率最低。

本研究顯示，管通方醇提物抑制EC9706細胞的增殖，且抑制率隨藥物濃度增加而上升，呈劑量-效應依賴性關系，提示800 μg/mL為有效藥物劑量，在1 600 μg/mL濃度時，抑制率最高，但此時可見細胞間接觸松散，部分細胞膜皺縮發(fā)泡，出現(xiàn)細胞毒性作用。隨著管通方醇提物濃度的增加，EC9706細胞周期的分布出現(xiàn)明顯的變化，G0/G1期細胞比率逐漸增加，S期和G2/M細胞比率逐漸減少；當濃度為800、1 600 μg/mL時與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。說明管通方醇提物能將細胞阻滯在G0/G1期，但其影響細胞周期哪些因子的表達來實現(xiàn)其抑制食管癌細胞的增殖，目前尚不清楚，需要進一步深入研究。

［1］ 張思維，張敏，李光琳，等.2003—2007年中國食管癌發(fā)病與死亡分析［J］.中國腫瘤，2012，21(4)：241-247.

［2］ W u C，H u Z，Li n D，et al.G enom e-w i de associ at i on st udy i dent i fi es t hree new suscept i bi l i t y l ocifor esophageal squam ous-cel l carci nom a i n Chi nese popul at i ons［J］.N at G enet，2011，43(7)：679-684.

［3］ 王立東.河南食管癌研究的理解和思考［J］.鄭州大學學報:醫(yī)學版，2006，41(1):1-5.

［4］ 呂安林.食管癌術后中藥輔助治療42例療效觀察［J］.西部中醫(yī)藥，2013，26(8)：92-93.

［5］ 高振華.孫秉嚴治療食管癌經(jīng)驗述略［J］.西部中醫(yī)藥，2011，24(8)：37-38.

［6］ 李建省，司富春.腫瘤細胞凋亡的中醫(yī)陰陽理論闡釋［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2010，3(6)：1034-1035.

［7］ 司富春，劉紫陽.食管癌中醫(yī)證型和用藥規(guī)律分析［J］.中醫(yī)學報，2012，27(6):655-657.

［8］ 司富春.啟膈散、沙參麥冬湯、通幽湯和補氣運脾湯對hEG F刺激的人食管癌EC9706細胞生長信號轉導的調節(jié)［J］.世界華人消化雜志，2010，18(28):2956-2965.

［9］ 楊撫華.醫(yī)學細胞生物學概論［M］.成都：四川技術出版社，1996：237-254.

Study on the Inhibiting Effects of Alcohol Extract from GuanTong Formula on EC9706 Cell of Esophageal Cancer

LI Jiansheng,JIN Feng,WANG Baorui,ZHANG Zhujun,YANG Weijian,DING Wenjun,ZHANG Xinli,XU Jin
Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730050,China

Objective：To reveal the mechanism of GuanTong formula inhibiting EC9706 growth of esophageal cancer by observing the effects of alcohol extract from GuanTong formula on cell proliferation and cell cycle of EC9706.Methods：EC9706 cells of esophageal cancer were cultivated in vitro,and they were processed by alcohol extract from GuanTong formula,the dose-effect relationship between the effects of alcohol extract from GuanTong formula on EC9706 cell proliferation were detected by MTT method;the morphological changes of EC9706 cell of esophageal cell were observed under the inverted microscope;the effects of alcohol extract on EC9706 cell cycle of esophageal cancer were detected by using PI single staining flow cytometry.Results：EC9706 cell proliferation of esophageal cancer was inhibited by alcohol extract from GuanTong formula in varying degrees,its inhibiting rate was dose-effect relationship;alcohol extract from GuanTong formula influenced cell morphological structure and all stages of EC9706 cell cycle.Compared with the control group,the cell rate of G0/G1checkpoint in GuanTong formula group elevated (P＜0.05).Conclusion：Alcohol extract from GuanTong formula arrests EC9706 cell of esophageal cancer in G0/G1and induces cell differentiation,this formula has the function of inhibiting EC9706 cell proliferation of esophageal cancer.

esophageal cancer;EC9706 cell;GuanTong formula;cell cycle arrest

R735.1

A

1004-6852(2016)10-0008-03

2016-01-06

甘肅省自然科學基金項目(編號1308RJZA 250，1308RJZA 164)；甘肅省高等學?？蒲许椖?編號2013A-082)。

李建省(1976—)，男，博士學位，副主任醫(yī)師。研究方向:慢性腎臟疾病的中醫(yī)藥防治及臨床與實驗研究。