鄭守晶, 王益晨, 楊慧芳, 鄭明鋒*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)金山學(xué)院， 福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院， 福建 福州 350002)

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響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶提取真姬菇SDF工藝研究

鄭守晶1, 王益晨2, 楊慧芳1, 鄭明鋒2*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)金山學(xué)院， 福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院， 福建 福州 350002)

以真姬菇(Hypsizigusmarmoreus)下腳料為原料，采用纖維素酶提取可溶性膳食纖維(soluble dietary fiber,SDF)，在加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH等單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法分析優(yōu)化工藝參數(shù)。結(jié)果表明，最佳提取工藝：纖維素酶添加量為0.57%、酶解溫度為57.98 ℃、酶解時(shí)間為3.70 h、酶解pH為5.15，在此條件下，真姬菇SDF提取率達(dá)到10.20%。

真姬菇; 可溶性膳食纖維; 纖維素酶; 提取

膳食纖維不能被人體腸道的消化酶所分解，屬于廣大碳水化合物中的一種多糖類物質(zhì)，適量的攝入膳食纖維對人體的健康有著很大的改善作用(林德榮，2008)。根據(jù)膳食纖維在水里溶解與否可將膳食纖維分為可溶性膳食纖維(soluble dietary fiber，SDF)和非可溶性膳食纖維(insoluble dietary fiber，IDF)。

SDF是指能溶解于水又能吸水使其膨脹的多糖類物質(zhì)，且能被大腸中微生物酵解的一類纖維，主要有果膠、植物膠、葡聚糖、樹膠瓊脂等(陶顏娟，2008)，主要存在于植物細(xì)胞液和細(xì)胞間質(zhì)中，對人體健康十分有益，例如降血糖、降血脂、預(yù)防食道癌、預(yù)防腫瘤等。近些年來，SDF基于其特殊的生理功能已經(jīng)越來越受到人們青睞和科研的重視。

真姬菇(Hypsizigusmarmoreus)屬于木質(zhì)腐生真菌，不但外形好看，味道鮮美，還具有很高的營養(yǎng)價(jià)值(Tsai et al.，2013)，所以越來越受到人們的喜愛。真姬菇中含有很多優(yōu)質(zhì)的營養(yǎng)成分，鈉、鉀、鈣、鋅、鐵、磷的含量也極為豐富，維生素B1、B2、B6的含量也比一般的食用菌高。本文預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果表明真姬菇干粉的SDF含量高達(dá)10%左右，SDF具有降血糖、延緩衰老、降血壓等藥理功效，是一種不可多得的物質(zhì)，值得開發(fā)利用。但是傳統(tǒng)的酶-重量法和熱水浸提法對物料SDF的提取率不高，都是只能提取物料本身固有的SDF，不能增加其含量(Chawla et al.，2010)；本試驗(yàn)以真姬菇下腳料為原料，采用纖維素酶提取法，纖維素酶能把真姬菇中的非SDF部分降解，使部分非SDF轉(zhuǎn)變成SDF，提高其提取率。該提取工藝的研究，不僅能降低生產(chǎn)成本，而且高提取率可以提升真姬菇產(chǎn)業(yè)的核心競爭力，產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)和社會效益。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

真姬菇：購于福建省福州市永輝超市。

1.2 試驗(yàn)主要試劑

纖維素酶(10 萬u·g-1)：由寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司提供；濃硫酸、苯酚、無水乙醇、檸檬酸、碳酸鈉，以上試劑均為市售分析純。

1.3 試驗(yàn)儀器

HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；RE52-99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)；漩渦振蕩儀(上海亞榮生化儀器廠)；UV-1800PC型紫外分光光度計(jì)(上海亞榮生化儀器廠)；循環(huán)水式真空泵[奧豪斯儀器(上海)有限公司]；pH計(jì)[奧豪斯儀器(上海)有限公司]；ZNC-300型高速粉碎機(jī)(北京興時(shí)利和科技發(fā)展有限公司)；DHG-9123A電熱熱風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)； DGH-9123A低速大容量離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.4 纖維素酶法提取真姬菇SDF優(yōu)化工藝

1.4.1 纖維素酶法提取真姬菇SDF的方法 真姬菇下腳料表面用清水充分洗凈，采用熱風(fēng)干燥的方法干燥，將干燥后的子實(shí)體用粉碎機(jī)粉碎，過100目分離篩。將粉碎好的真姬菇粉末加入一定量的超純水，用檸檬酸和碳酸鈉調(diào)整pH,精確稱取適量的酶加入溶液中混合，在水浴中恒溫酶解，每隔5 min攪拌一次，使酶和物料充分混合反應(yīng)，酶解完成后將其放入100 ℃水浴中10 min，使酶失去活性。將反應(yīng)液移入大容量離心機(jī)離心，取上清液，真空濃縮后加入4倍濃縮液體積的無水乙醇靜置4 h，再置于大容量離心機(jī)中以4000 r·min-1的速度離心10 min，去上清液，收集沉淀，沉淀即是粗SDF，把收集到的沉淀干燥稱重。

(1)

1.4.2 纖維素酶提取真姬菇SDF的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 取2 g真姬菇干粉，分別加入0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%纖維素酶進(jìn)行酶解(Ma et al.，2016)，固定其他條件，分別考察酶解溫度(40、45、50、55、60 ℃)(Sun，2007)、酶解時(shí)間(1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h)(Li et al.，2014)、酶解pH值(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0)(Mu et al.，2012)對真姬菇SDF提取率的影響。每組平行3次試驗(yàn)，取平均值。

1.4.3 纖維素酶提取真姬菇SDF的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì) 運(yùn)用Design Expert(version8.0.3)軟件中的Central Composite分析試驗(yàn)(李珍等，2013)，在單因素分析的基礎(chǔ)上，以纖維素酶的條件因素(溫度、時(shí)間、pH、加酶量)為指標(biāo)，每個(gè)因素設(shè)定五個(gè)水平(趙強(qiáng)等，2012；林建原等，2013)，通過響應(yīng)面分析各因素和因素間交互作用的顯著性(張術(shù)易，2012；侯學(xué)敏等，2013)。試驗(yàn)因子及水平編碼如表1所示，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

表1 Central Composite 試驗(yàn)因子水平編碼表

Table 1 Central Composite coding table of experimental factors and levels

水平編碼因 素加酶量/%酶解溫度/℃酶解時(shí)間/hpH20.9603.56.010.7553.05.500.5502.55.0-10.3452.04.5-20.1401.54.0

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶單因素分析

2.1.1 纖維素酶添加量對真姬菇SDF提取率的影響 由圖1可知，纖維素酶的添加量在0.5%時(shí)，真姬菇SDF的提取率達(dá)到最高，低于或高于0.5%時(shí)，提取率都低于這個(gè)水平。說明加酶量過低時(shí)，造成底物的飽和，加酶量不足以應(yīng)付所有的底物，酶解效率不高；當(dāng)纖維素酶添加量過大時(shí)，SDF的提取率反而下降，應(yīng)該是過量的纖維素酶會使已經(jīng)溶出的部分SDF降解成小分子物質(zhì)，不容易被無水乙醇醇沉，造成真姬菇SDF提取率的下降(Hou et al.，2009)。

圖1 酶添加量對真姬菇SDF提取率的影響

Figure 1 Effect of cellulase dosage on SDF extraction rate ofH.marmoreus

2.1.2 酶解溫度對真姬菇SDF提取率的影響 由圖2可知，纖維素酶的提取溫度在50 ℃時(shí)SDF有最高的提取率，過低的溫度或過高的溫度都沒有50 ℃時(shí)的提取率高。根據(jù)酶學(xué)原理，酶在最適溫度時(shí)作用效果最好。當(dāng)溫過高時(shí)，酶的活力會下降，作用效果降低，導(dǎo)致真姬菇SDF提取率下降；當(dāng)溫度過低時(shí)，酶的活性受到抑制，導(dǎo)致提取率下降。

2.1.3 酶解時(shí)間對真姬菇SDF提取率的影響 由圖3可知，酶解時(shí)間對真姬菇SDF提取有一定的影響，提取時(shí)間從開始到3 h,SDF提取率不斷增加，但時(shí)間超過3 h后,提取率反而下降，可能是纖維素酶會繼續(xù)發(fā)揮降解作用，造成SDF分解成更小的糖類分子，不容易被無水乙醇醇沉。

圖2 酶解溫度對真姬菇SDF提取率的影響

Figure 2 Effect of enzymolysis temperature on SDF extraction rate ofH.marmoreus

圖3 酶解時(shí)間對真姬菇SDF提取率的影響

Figure 3 Effect of enzymolysis time on SDF extraction rate ofH.marmoreus

2.1.4 酶解pH對真姬菇SDF提取率的影響 由圖4可知，在酶解pH為5時(shí)提取率達(dá)到最高，pH過高或過低時(shí)都沒有達(dá)到較高的提取率。酶解pH不適應(yīng)酶本身的酶解條件時(shí)，酶的活性或被部分抑制或全部喪失，因?yàn)槎鄶?shù)酶本身也屬于蛋白質(zhì)，過高或過低的pH會造成蛋白質(zhì)的變性，也就是造成酶的失活。

圖4 酶解pH對真姬菇SDF提取率的影響

Figure 4 Effect of enzymolysis pH on SDF extraction rate ofH.marmoreus

2.2 纖維素酶提取真姬菇SDF中心組合試驗(yàn)

2.2.1 中心組合試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)中心組合試驗(yàn)方案進(jìn)行4因素5水平試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。對表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)用多元回歸擬合后，得到回歸方程為：

Y=10.05-0.078X1+0.14X2+0.18X3+0.079X4-0.14X12-0.13X22-0.17X32-0.20X42+0.039X1X2-0.03X1X3-0.041X1X4+0.095X2X3+0.029X2X4-0.072X3X4。

式中：X1表示加酶量，X2表示酶解溫度，X3表示酶解時(shí)間，X4表示酶解pH。

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

Table 2 The design and results of response surface analysis

編號因 素加酶量/%酶解溫度/℃酶解時(shí)間/hpHSDF提取率/%編號因 素加酶量/%酶解溫度/℃酶解時(shí)間/hpHSDF提取率/%1-1-1-1-19.131611119.7621-1-1-19.0017-20009.643-11-1-19.101820009.42411-1-19.05190-2009.215-1-11-19.452002009.9061-11-19.292100-209.037-111-19.792200209.738111-19.7423000-29.099-1-1-119.452400029.44101-1-119.1525000010.0611-11-119.5226000010.001211-119.3427000010.0913-1-1119.5428000010.01141-1119.1029000010.0615-11119.8930000010.05

2.2.2 回歸模型的方差分析 由表3可知，失擬項(xiàng)F1=2.91(P>0.05)不顯著，說明模型的擬合較為合適，決定系數(shù)R2=0.9900，說明回歸方程是很合理的，達(dá)到了極顯著水平，所以4因素5水平的真實(shí)數(shù)據(jù)在此方程的模擬下是可行的。交互項(xiàng)中X1X2、X2X3、X1X4、X3X4的回歸系數(shù)達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，X2X4的回歸系數(shù)達(dá)到顯著水平(P<0.05)，去除不顯著項(xiàng)X1X3，將原始方程簡化后得到新的回歸方程為：

Y=10.05-0.078X1+0.14X2+0.18X3+0.079X4-0.14X12-0.13X22-0.17X32-0.20X42+0.039X1X2-0.041X1X4+0.095X2X3+0.029X2X4-0.072X3X4。

表3 回歸模型方差分析1)

Table 3 The variance analysis of regression model

1)*表示回歸系數(shù)達(dá)0.05顯著水平；**表示回歸系數(shù)達(dá)0.01極顯著水平

2.2.3 因素交互效應(yīng)分析 通過Design Expert軟件對交互項(xiàng)X1X2、X2X3、X1X4、X3X4和X2X4進(jìn)行響應(yīng)面分析，繪制因素間交互作用的響應(yīng)面曲線圖，如圖5-9所示。

(a)等高線圖 (b)響應(yīng)面圖

圖5 加酶量和酶解溫度的交互作用對真姬菇SDF提取率的影響

Figure 5 Effect of interaction between enzyme dosage and enzymolysis temperature on SDF extraction rate ofH.marmoreus

(a)等高線圖 (b)響應(yīng)面圖

圖6 加酶量和酶解pH的交互作用對真姬菇SDF提取率的影響

Figure 6 Effect of interaction between enzyme dosage and enzymolysis pH on SDF extraction rate ofH.marmoreus

(a)等高線圖 (b)響應(yīng)面圖

圖7 酶解溫度和酶解時(shí)間的交互作用對真姬菇SDF提取率的影響

Figure 7 Effect of interaction between enzymolysis temperature and enzymolysis time on SDF extraction rate ofH.marmoreus

(a)等高線圖 (b)響應(yīng)面圖

圖8 酶解溫度和酶解pH的交互作用對真姬菇SDF提取率的影響

Figure 8 Effect of interaction between enzymolysis temperature and enzymolysis pH on SDF extraction rate ofH.marmoreus

(a)等高線圖 (b)響應(yīng)面圖

圖9 酶解時(shí)間和酶解pH的交互作用對真姬菇SDF提取率的影響

Figure 9 Effect of interaction between enzymolysis time and enzymolysis pH on SDF extraction rate ofH.marmoreus

對比響應(yīng)面的三維立體圖，在試驗(yàn)所選范圍內(nèi)有極值，即響應(yīng)面會出現(xiàn)最高點(diǎn)，同時(shí)也是等值線最小橢圓的中心點(diǎn)。如圖5所示，由等高線的中心紅點(diǎn)和其對應(yīng)的坐標(biāo)軸可以看出，在加酶量為0.64%、酶解溫度為50 ℃的條件下，真姬菇SDF有最高的提取率，溫度的拋物線較為平緩，加酶量的拋物線坡度較為陡峭，說明溫度對提取率的影響沒有加酶量顯著。由圖6可以看出，等高線圖的中心點(diǎn)顯示加酶量為0.65%、酶解pH為5的時(shí)候，真姬菇SDF的提取率達(dá)到最高值，響應(yīng)面圖顯示兩因素都成拋物線，說明加酶量和環(huán)境pH對真姬菇SDF的影響都有一個(gè)適中范圍，過大或過小都會降低提取率。圖7表明，在酶解溫度為52 ℃、提取時(shí)間在3 h，SDF提取率最高，因?yàn)檫^高的溫度會使酶失活，過長的酶解時(shí)間會使SDF進(jìn)一步降解，這些都會降低提取率。由圖8可知，酶解溫度和酶解pH對真姬菇SDF的提取率影響都成拋物線趨勢，但是在適當(dāng)?shù)拿附鉁囟群兔附鈖H下可以使提取率達(dá)到最高。由圖9可知，在酶解時(shí)間為3.1 h，酶解pH為5的時(shí)候，真姬菇SDF的提取率達(dá)到最大，因?yàn)檫^長的酶作用時(shí)間會使SDF降解，成為不能被醇沉的物質(zhì)。

綜上所述，要達(dá)到最佳的真姬菇SDF提取率，纖維素酶添加量為0.66%左右，酶作用時(shí)間在3.0-3.2 h之間，酶解溫度在50-52 ℃之間，酶解pH為5?？傮w上看這4個(gè)試驗(yàn)因素對SDF提取率的影響除了因素的線性慣性外，交互項(xiàng)和平方項(xiàng)對響應(yīng)值也有很大影響。

2.2.4 最適條件優(yōu)化及驗(yàn)證性試驗(yàn) 根據(jù)模型和回歸方程所得的真姬菇干粉優(yōu)化條件結(jié)果為：纖維素酶添加量為0.57%、酶解溫度為57.98 ℃、酶解時(shí)間為3.70 h、酶解pH為5.15，在此條件下SDF提取率的最大理論值為10.20%。

為了檢驗(yàn)上述模型的可靠性，根據(jù)上述最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。為了實(shí)驗(yàn)的方便性，選取纖維素酶添加量為0.6%、酶解溫度為58 ℃、酶解時(shí)間為3.5 h、酶解pH為5做三次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，測得真姬菇SDF提取率為(10.18±0.39)%，和模型的預(yù)測值十分接近，表明此回歸模型的預(yù)測準(zhǔn)確性較高，具有實(shí)用價(jià)值。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)采用纖維素酶提取真姬菇的可溶性膳食纖維。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法建立SDF提取率與加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH之間的二次回歸模型，通過回歸方程優(yōu)化獲得了最佳提取工藝參數(shù)為纖維素酶添加量為0.6%、酶解溫度為58 ℃、酶解時(shí)間為3.5 h、pH為5。在此條件下提取率可達(dá)(10.18±0.39)%，與預(yù)測值(10.20%)基本一致。綜合來看，本模型具有較好的預(yù)測性能，對生產(chǎn)實(shí)踐具有一定的借鑒意義。

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(責(zé)任編輯：陳曉雯)

Optimization of the SDF extraction ofHypsizigusmarmoreusby cellulase

ZHENG Shou-Jing1， WANG Yi-Chen2， YANG Hui-Fang1， ZHENG Ming-Feng2*

(1.JinshanCollegeofFujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou，F(xiàn)ujian35002，China;2.CollegeofFoodScience，F(xiàn)ujianAgricultureandForestryUniversity，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian35002，China)

Cellulase was prepared for extracting the soluble dietary fiber(SDF)from Hypsizigus marmoreus scraps. The technological parameters such as enzymatic amount, enzymolysis temperature, enzymolysis time and enzymolysis pH value were subjected to the single factor test, and optimized by response surface analysis. The results showed that the extraction rate could be up to10.20%, when the enzymatic amount was 0.57%, enzymolysis temperature 57.98 ℃, enzymolysis time 3.70 h and the pH 5.15.

Hypsizigusmarmoreus； soluble dietary fiber； cellulase；extraction

2016-08-30; 發(fā)表日期： 2016-10-31

鄭守晶(1985-)，女，碩士，助教。研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。Email:417734132@qq.com。*

TS209； TQ925

A

1001-4276-(2016)01-0119-08

鄭守晶，王益晨，楊慧芳，等,2016.響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶提取真姬菇SDF工藝研究[J].武夷科學(xué)，32：119-126.