趙同心， 趙洪新， 王升厚

(1.沈陽師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,遼寧 沈陽 110034；2.浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310018；3.沈陽師范大學(xué) 實驗教學(xué)中心,遼寧 沈陽 110034)

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3種不同來源側(cè)耳品種親緣關(guān)系差異化分析

趙同心1， 趙洪新2， 王升厚3*

(1.沈陽師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,遼寧 沈陽 110034；2.浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310018；3.沈陽師范大學(xué) 實驗教學(xué)中心,遼寧 沈陽 110034)

采取拮抗實驗、酯酶同工酶、基因組進行多態(tài)性分析(RAPD)、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(ITS)對來源不同的特大鳳尾菇(Pleurotussajor-caju)、夏秀990(Pleurotusgeesteranus)和黑平A3三個側(cè)耳品種的親緣關(guān)系進行了對比分析。實驗結(jié)果表明：供試的3個側(cè)耳品種從形態(tài)學(xué)水平、蛋白質(zhì)水平和分子水平上看，其品種間親緣關(guān)系界定具有一致性。表現(xiàn)為特大鳳尾菇與夏秀990的親緣關(guān)系較近，與黑平A3的親緣關(guān)系較遠，夏秀990與黑平A3親緣關(guān)系較遠。本研究從不同的水平，為食用菌菌種屬間親緣關(guān)系的鑒定提供了綜合分析方法，對區(qū)分同種異名、雜交親本選擇以及判定雜交結(jié)果具有指導(dǎo)意義。

側(cè)耳；親緣關(guān)系；酯酶同工酶；隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)；轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(ITS)

側(cè)耳屬真菌常見的品種有糙皮側(cè)耳(Pleurotusostreatus，俗稱平菇)，金頂側(cè)耳(PleurotuscitrinopileatusSing，俗稱榆黃蘑)，漏斗狀側(cè)耳(Pleurotussajor-caju，俗稱鳳尾菇)，刺芹側(cè)耳(Pleurotuseryngi，俗稱杏鮑菇)，阿魏側(cè)耳(PleurotusferulaeLanzi，俗稱白靈菇)等,全世界約有50多種，我國現(xiàn)有36種[1]，是目前人工栽培數(shù)量較大、范圍較廣的食用大型真菌。隨著人工栽培規(guī)模的不斷擴大，特別是選育新品種的種植與推廣，新的商品名稱或代號的菌種不斷出現(xiàn)，出現(xiàn)了來源各異、同種異名或異種同名的混亂現(xiàn)象。由于不同種源對環(huán)境適應(yīng)能力的差異，給引種菇農(nóng)造成損失現(xiàn)象時有發(fā)生。為了對菌種做到科學(xué)管理、保護品種產(chǎn)權(quán)、杜絕生產(chǎn)領(lǐng)域的菌種亂引亂種現(xiàn)象，許多研究人員采取不同方法對側(cè)耳屬進行鑒別。黃奕存[2]提出了不同個體間的拮抗反應(yīng)，從菌絲的形態(tài)學(xué)方面進行不同鑒定。李榮春等[3]采用酯酶同工酶方法對不同菌株間的相似程度進行鑒定分析。鄭素月等[4]、張慶華等[5]、湯衛(wèi)真等[6]分別分析了菌株之間酯酶同工酶的差異。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，RAPD技術(shù)和ITS技術(shù)用于平菇分類。詹才新等[7]、陳明杰等[8]驗證了RAPD可用于金針菇和香菇親緣關(guān)系的鑒定，隨后譚琦等[9]用RAPD技術(shù)分析并建立了遺傳相關(guān)聚類圖，分析出香菇雜交非對稱雜交后代相似關(guān)系。White等[10]為真菌rRNA基因的ITS設(shè)計3對特異引物，即ITS1、ITS4、ITS5，可用于大多數(shù)擔子菌和子囊菌。譚琦等[11]分析了中國6個白靈菇商業(yè)菌株的DNA圖譜，證明6個菌株為同一個種。為提高品種間親緣關(guān)系鑒定方法的有效性、可靠性和實用性，本研究選擇不同來源側(cè)耳屬的3個品種為供試菌株，采取拮抗鑒定、酯酶同工酶分析、RAPD多態(tài)性分析和ITS間隔區(qū)序列比對，從表型、蛋白和分子3個水平進行綜合運用，為菌種間親緣關(guān)系鑒定提供一種更為科學(xué)有效的綜合方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 夏秀990(秀珍菇，Pleurotusgeesteranus)、黑平A3(Pleurotusostreatus)、特大鳳尾菇(Pleurotussajor-caju)，由沈陽師范大學(xué)特種菌業(yè)研究所保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 改良PDA培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀 2 g，硫酸鎂1 g，水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 ①拮抗實驗：取活化好的菌種，在改良PDA培養(yǎng)基上打孔，進行兩兩拮抗實驗， 25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周。②菌種培養(yǎng)：在液體PDA培養(yǎng)基中，200 r/min、25 ℃培養(yǎng)1周，取菌絲體提取蛋白質(zhì)和DNA。酯酶同工酶的方法參考文獻[12]。DNA提取用CTAB法。

1.2.2 RAPD 和ITS引物篩選與擴增 引物如表1所示。引物采取設(shè)計隨機引物的方法，從引物庫中進行篩選。引物合成和PCR產(chǎn)物測序，由上海生工生物公司完成。 RAPD PCR反應(yīng)體系：10 ×TaqPCR Buffer 2.5 μL，隨機引物2 μL(2 μmol/L)，TaqDNA聚合酶 0.5 μL，DNA 0.5 μL，dNTP 0.5 μL(10 mmol/L)，去離子無菌水 14 μL。PCR反應(yīng)程序: 94 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性1 min，36 ℃退火1 min，72 ℃延伸80 s，30個循環(huán)，72 ℃保持10 min，4 ℃保存。樣品取出置于冰箱-20 ℃中保藏。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，切膠分離PCR產(chǎn)物，回收，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1 RAPD 引物

ITS聚合酶鏈式反應(yīng)PCR 擴增參考文獻[7]，用2個真菌引物ITS4和ITS5進行擴增。PCR反應(yīng)體系 10 ×TaqPCR Buffer 2 μL，引物ITS4 0.5 μL，引物ITS5 0.5 μL，TaqDNA聚合酶 0.5 μL，DNA 2 μL，dNTP 0.5 μL(10 mmol/L)，去離子無菌水 14 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性 5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)，72 ℃保持10 min，4 ℃保存，取出樣品冰箱-20 ℃保藏。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物。切膠回收PCR產(chǎn)物，將回收的產(chǎn)物連接到T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌E.coli5α的感受態(tài)細胞中，Amp100抗性篩選，用菌落PCR篩選陽性的單菌落。用鼎國質(zhì)粒提取試劑盒(NEP011-1)提取純化質(zhì)粒后，送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 用SPASS進行數(shù)值分析，MAGE 6.0進行ITS序列分析親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗實驗

不同菌種之間均出現(xiàn)拮抗線(圖1)，說明3種平菇屬于不同的種。

圖1 3個平菇品種的拮抗反應(yīng)

2.2 酯酶同工酶譜帶分析

2.2.1 酶譜的類型 3個平菇品種共有18條酯酶同工酶條帶(圖2)，分子量大約在70～170 kDa。 遷移率不同的為13條，其中黑平A3有4條，與其他兩個品種相比，沒有相同分子量的條帶，說明與其他兩個品種之間差異較大。夏秀990有5條酶帶，與特大鳳尾菇相同，說明二者親緣關(guān)系較近；另外，特大鳳尾菇有自己特異的4條帶，與夏秀990不同?？赡苡捎谔卮篪P尾菇與夏秀990存在進化程度上的差異，或者特大鳳尾菇進化的快些，導(dǎo)致了較多的特異性條帶。

圖2 酯酶同工酶電泳圖

2.2.2 聯(lián)合系數(shù) 根據(jù)sneath和sokal(1973年)提出的聯(lián)合系數(shù)，可以清楚地反映品種間的親緣關(guān)系。聯(lián)合系數(shù)在0～1之間變化，其值越大兩品種親緣關(guān)系越近，越小親緣關(guān)系越遠。特大鳳尾與夏秀990聯(lián)合系數(shù)為0.556，說明二者親緣關(guān)系較近，黑平菇的親緣關(guān)系較其他兩個關(guān)系較遠，見表2。

表2 3個平菇品種之間的聯(lián)合系數(shù)

2.3 RAPD 條帶分析

2.3.1 RAPD電泳條帶分析 10個RAPD 引物對3種側(cè)耳進行PCR擴增，篩選出S23、S88引物進行電泳分析。S23引物擴增結(jié)果，3個品種中有2條相同的條帶，特大鳳尾菇與夏秀990帶型一致，其中夏秀990的3條帶和特大鳳尾菇相同，特大鳳尾菇2條特異性條帶，黑平A3特異性條帶2條與另外兩種明顯不同。S88引物結(jié)果顯示，特大鳳尾菇5條帶其中2條與夏秀990相同，特異性條帶2條，夏秀990特異性條帶1條。黑平A3有1條與夏秀990相同，2條特異性條帶。結(jié)果見圖3?？傊?，根據(jù)RAPD結(jié)果分析可知夏秀990和特大鳳尾菇的條帶較為一致，親緣關(guān)系較近，在分子水平上可以看出它們有共同的特征條帶，不同品種間存在著差異。

圖3 3個平菇品種之間的RAPD條帶

2.3.2 聚類分析 用SPASS進行數(shù)值分析，有條帶的為1，無條帶的為0，得到的聚類分析圖見圖4。由圖4可以看出，特大鳳尾菇和夏秀990親緣關(guān)系較近，與黑平A3進化距離遠。

圖4 3個平菇品種之間的聚類分析Fig.4 Cluster analysis among three kinds Pleurotus spp.

2.4 ITS序列分析

2.4.1 目的片段的擴增 用引物ITS4和ITS5擴增3個品種的ITS區(qū),電泳圖譜如圖5所示，可以看出，PCR條帶基本一致，分子量約為680 bp。

圖5 3個平菇品種ITS PCR產(chǎn)物Fig.5 ITS PCR product among three kinds Pleurotus spp.1：特大鳳尾菇；2：夏秀990；3：黑平A31：Phoenix mushroom;2:Xiaxiu 990;3:Black oyster mushroom A3

2.4.2 ITS分析 對3種平菇的ITS序列分析比對發(fā)現(xiàn)，夏秀990和特大鳳尾菇的序列完全相同，無堿基差別，而黑平A3與夏秀990、特大鳳尾菇堿基序列差別較大。1～54 bp為18S RNA,55～286 bp為轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1即ITS1，287～444 bp為5.8S RNA，445～642 bp為轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2即ITS2，643～703 bp為28S RNA。

由序列比對可以看出，在ITS1發(fā)生了堿基替換，第161 bp的C→T，第71 bp的T→C。在ITS2區(qū)序列出現(xiàn)堿基的替換和插入，在第466 bp的A→T,第 469 bp和第496 bp的T→C，第481 bp的T→A，第514 ～515 bp的TG→CT, 第517 bp和第521 bp A→G，在469 bp和470 bp之間插入了序列GGTTTTTTTCC。

2.4.3 平菇的進化樹 用MAGE 6.0進行親緣關(guān)系遠近分析，結(jié)果顯示：1號的特大鳳尾菇和2號的夏秀990親緣關(guān)系較近，3號黑平A3親緣關(guān)系較遠。本研究通過對ITS區(qū)域的擴增測序, 分析平菇不同品種間的親緣關(guān)系并將平菇ITS區(qū)域序列登錄到核苷酸序列數(shù)據(jù)庫中，登錄號分別為KP877605、KP877606、KP877607，見圖6。

圖6 3個平菇品種ITS聚類分析Fig.6 ITS Cluster Analysis among three kinds Pleurotus spp.

3 討 論

本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)的拮抗反應(yīng)，蛋白質(zhì)水平酯酶同工酶，分子水平的RAPD和ITS區(qū)序列分析得出了供試3種側(cè)耳屬品種間的親緣關(guān)系。拮抗反應(yīng)是真菌鑒定的常用手段，但往往不能有效區(qū)分出兩個在遺傳上有相似背景或親緣關(guān)系很近的菌株，可作為初級分類的方法；同工酶是由不同等位基因或不同基因位點編碼的[13]，特別是在屬內(nèi)種間及品種之間的分類鑒定是非常有效的。同工酶技術(shù)也具有易受培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)溫度的影響而表現(xiàn)出不一致性的缺點，并且不能直接反映 DNA 水平的情況[14]。因此做好分子水平的鑒定就成為完整實驗方法的重要組成。本研究從ITS序列比對結(jié)果看，特大鳳尾菇和夏秀990序列完全相同，說明它們的進化程度一致，同時也說明了ITS區(qū)序列長度有限，相對全基因組而言，有限的序列信息要想真正反映物種的進化規(guī)律，還需要其他的形態(tài)學(xué)等方面的數(shù)據(jù)。從序列比對可以看出的ITS區(qū)域的差異主要表現(xiàn)在ITS2區(qū)域，與司源等[15]的ITS1相對變化、ITS2相對保守的觀點不同，進化的快慢可能是由于不同的生物ITS區(qū)，但是ITS2相對變化這一觀點與Yao等[16]將ITS2區(qū)域作為動植物的DNA標記觀點一致。

本研究從宏觀水平、蛋白質(zhì)水平和DNA水平等多個層面說明了平菇之間的進化程度與親緣關(guān)系，同時也證明進行分類時應(yīng)結(jié)合多種手段來說明它們之間的親緣關(guān)系。

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Found projecd: National Natural Science Foundation of China (31160371, 30860165); National Key Technology Research and

Development Program of China (2012BAD19B02); National High Technology Research and Development Program of China (863

Program) ( 2011AA10A206)

Brief introduction to the writer: Cheng liang male, Ph D student. Research field: natural product.

Tel:0971-5313283, E-mail:liangcheng1979@163.com

Draft accepted date: 2015-04-03; Revision returned date: 2015-08-31

Alliance Variance Analysis of ThreePleurotusSpeciesfrom Different Sources

ZHAO Tong-xin1, ZHAO Hong-xin2, WANG Sheng-hou3

(1.Coll.ofChem. &LifeSci.ShenyangNormalUni.,Shenyang110034; 2.Coll.ofLifeSci.ZhejiangSci-Tech.Uni.,Hangzhou310018; 3.Exper’lTeach.Ctr.,ShenyangNormalUni.,Shenyang110034)

In this study the alliance among threePleurotusofphoenixtail mushroom,xiaxiu990 andblackoyster mushroom A3 from different sources with different morphology were carried out contrast analysis. The results showed that the tested threePleurotusspecies possessed the congruity among species alliance definition in morphology level, protein level and molecular level. The alliance betweenphoenixtail mushroom andxiaxiu990 displayed closer, but further fromblackoyster mushroom A3, and the alliance betweenxiaxiu990 andblackoyster mushroom A3 was further. This study provided comprehensive methods to analyze the characterization of the alliance of edible fungi of inter-genus in different levels, and had directive significance to separate different name of the same species, to select hybrid parents, and to judge the results of hybridization.

Pleurotusostreatus; alliance; esterase isozyme; random amplified polymorphic DNA (RAPD); transcribed spacer sequence (ITS)

遼寧省科學(xué)事業(yè)公益項目(2014003020)

趙同心 女，碩士研究生。研究方向為微生物制藥。E-mail:txzhao@sina.com

* 通訊作者。男，教授，碩士生導(dǎo)師。主要從事藥用真菌資源的開發(fā)與利用。E-mail：wshhwq2009@163.comn

2015-06-01；

2015-08-03

Q93-331

A

1005-7021(2016)02-0062-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.02.011