朱小峰，朱曉娣，王金梅#[.河南大學(xué)中藥研究所，河南開封 475004；2.賽諾菲（中國）投資有限公司上海分公司，上海 200040]

封丘產(chǎn)金銀花不同提取物的體外抗氧化、抗凝血及α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

朱小峰1，2＊，朱曉娣1，王金梅1#[1.河南大學(xué)中藥研究所，河南開封 475004；2.賽諾菲（中國）投資有限公司上海分公司，上海 200040]

目的：考察封丘產(chǎn)金銀花不同提取物的體外抗氧化、抗凝血及α-葡萄糖苷酶抑制活性。方法：以30%乙醇提取金銀花得總浸膏，用水分散后依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取得相應(yīng)部位萃取物。采用1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）自由基、2，2′-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽（ABTS）自由基清除試驗(yàn)和Fe3+還原/抗氧化能力試驗(yàn)考察金銀花不同提取物的體外抗氧化活性大小[分別以半數(shù)清除濃度（IC50）和Trolox當(dāng)量反映]；并考察4種不同提取物的體外凝血和抑制α-葡萄糖苷酶的活性強(qiáng)弱。結(jié)果：4種提取物中，乙酸乙酯部位抗氧化能力最強(qiáng)，ABTS、DPPH自由基的IC50分別為9.22、25.23μg/ml，Trolox當(dāng)量為（2 480.80± 5.51）μmol/g；水提物部位促凝血活性最強(qiáng)、正丁醇部位抗凝血活性最強(qiáng)，血漿復(fù)鈣時(shí)間分別為（210.28±2.19）、（149.20±1.25）s；總浸膏、乙酸乙酯部位均對(duì)α-葡萄糖苷酶活性有較強(qiáng)的抑制作用，復(fù)篩IC50分別為378.61、451.45 μg/ml。結(jié)論：封丘產(chǎn)金銀花有較好的體外抗氧化、抗凝血及α-葡萄糖苷酶抑制活性，可進(jìn)一步開發(fā)。

金銀花；封丘；抗氧化；凝血；α-葡萄糖苷酶；體外

金銀花（Lonicerae japonicae Flos）為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或帶初開的花[1]，始載于《名醫(yī)別錄》，被列為上品。其性寒、味甘，具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱之功，主治癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱等證[2]，為臨床常用中藥。研究表明，金銀花中的活性成分包括揮發(fā)油、黃酮、三萜皂苷、有機(jī)酸等，具有抑菌、抗病毒、解熱、抗炎、保肝、止血、抗氧化、降血脂等多種生物活性[3]。

我國金銀花資源豐富，傳統(tǒng)以河南所產(chǎn)“南銀花”和山東所產(chǎn)“東銀花”質(zhì)量最好，為道地藥材。河南新密、封丘為“南銀花”主產(chǎn)區(qū)，其中，封丘產(chǎn)金銀花中綠原酸和木犀草苷含量均高于新密產(chǎn)金銀花[4]，居全國各地金銀花之首，并于2003年 1月獲得國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局頒發(fā)的原產(chǎn)地標(biāo)記注冊證。文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，目前對(duì)封丘產(chǎn)金銀花的研究較少，僅田野[5]對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，但并未結(jié)合生物活性。本研究擬研究封丘產(chǎn)金銀花的體外抗氧化、抗凝血及α-葡萄糖苷酶抑制作用，為封丘產(chǎn)金銀花資源的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

AL104電子天平、DELTA 320 pH計(jì)（美國Mettler-Toledo公司）；LABOROTA 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidolph公司）；Multiskan MK3酶標(biāo)儀（美國Thermo Electron公司）；LRH-150恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）自由基（日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào)：D0909，純度：90%）；2，2′-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽（ABTS）、三吡啶三啞嗪（TPTZ）（美國Fluka公司，批號(hào)：101112411、1306929，純度：均不低于99.0%）；6-羥基-2，5，7，8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧（Trolox，美國Aldrich公司，批號(hào)：10327AD，純度：97.0%）；沒食子酸丙酯（PG，批號(hào)：A019043001，純度：98%）、丁基羥基茴香醚（BHA，批號(hào)：A019438801，純度：96%）、二丁基羥基甲苯（BHT，批號(hào)：A020158601，純度：99%）均購自比利時(shí)Acros Organics公司；α-葡萄糖苷酶（批號(hào)：129K1426，活力：194 U/mg）、對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG，批號(hào)：026K1516，純度：≥99.0%）、阿卡波糖（批號(hào)：16869，純度：≥99.0%）均購自美國Sigma公司；維生素K1注射液（批號(hào)：1108023，規(guī)格：1 ml∶10 mg）、2.775 g/L氯化鈣溶液（批號(hào)：1109051）均購自天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司；注射用燈盞花素（湖南恒生制藥有限公司，批號(hào)：20110202，規(guī)格：20 mg/瓶）；其余試劑均為分析純。

1.3 藥材

金銀花于2012年7月采集于河南省封丘縣，由河南大學(xué)中藥研究所李昌勤教授鑒定為忍冬科（Caprifoliaceae）植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或帶初開的花，標(biāo)本現(xiàn)存于河南大學(xué)中藥研究所。

1.4 動(dòng)物

獺兔，♂，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由河南大學(xué)中藥研究所提供（合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字09-1-2號(hào)）。

2 方法

2.1 金銀花不同提取物的制備

取金銀花1.0 kg，30%乙醇回流提取2次，合并提取液，減壓回收乙醇，得到總浸膏。將總浸膏分散于水中，用50%硫酸調(diào)溶液pH至2.0，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別得相應(yīng)部位萃取物。

2.2 體外抗氧化活性測定

2.2.1 Fe3+還原/抗氧化能力（FRAP）試驗(yàn)[6]將金銀花30%提取物總浸膏、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水提物樣品分別用甲醇制備成2 mg/ml的溶液，按需稀釋成不同質(zhì)量濃度的樣品溶液。用微量移液器取0.2 ml樣品或?qū)φ掌罚≒G、BHT、BHA）溶液加入到3.8 ml新鮮制備的TPTZ工作液中，混勻，于37℃條件下反應(yīng)30 min后用酶標(biāo)儀測定其在593 nm波長處的吸光度，每份樣品平行操作3次，取平均值。還原能力強(qiáng)弱以Trolox當(dāng)量（每克樣品相當(dāng)于水溶性維生素E的微摩爾數(shù)）表示。

2.2.2 ABTS自由基清除試驗(yàn)[7]按“2.1”項(xiàng)下方法制備金銀花不同提取物的溶液，按需稀釋成不同質(zhì)量濃度的樣品溶液。用微量移液器取0.15 ml樣品或?qū)φ掌罚≒G、BHT、BHA）溶液加入到2.85 ml ABTS自由基工作液中，混勻，10 min后用酶標(biāo)儀測定其在734 nm波長處的吸光度（A），每份樣品平行操作3次，取平均值。計(jì)算ABTS自由基清除率：清除率（%）＝（A對(duì)照－A樣品）/A對(duì)照×100%，其中A對(duì)照為ABTS自由基工作液在734 nm波長處的A值，A樣品為樣品或?qū)φ掌放cABTS作用后并去除樣品自身吸收后的A值。當(dāng)樣品初篩質(zhì)量濃度為2 000 μg/ml時(shí)，若清除率≥50%，則進(jìn)行復(fù)篩試驗(yàn)，即將樣品配制成不同質(zhì)量濃度，按上述方法測定清除率，用Origin軟件繪制樣品質(zhì)量濃度與抑制率相關(guān)的曲線，求出半數(shù)清除濃度（IC50）；否則，不進(jìn)行復(fù)篩試驗(yàn)。

2.2.3 DPPH自由基清除試驗(yàn)[6]按“2.1”項(xiàng)下方法制備金銀花不同提取物溶液，按需稀釋成不同質(zhì)量濃度的樣品溶液。用微量移液器取0.1 ml樣品或?qū)φ掌罚≒G、BHT、BHA）溶液加入到3.5 ml DPPH甲醇溶液（0.06 mmol/L）中，混勻，靜置30 min后用酶標(biāo)儀測定其在515 nm波長處的吸光度（A），每份樣品平行操作3次，取平均值。計(jì)算DPPH自由基清除率：清除率（%）＝（A對(duì)照－A樣品）/A對(duì)照×100%，其中A對(duì)照為DPPH自由基工作液在515 nm波長處的A值，A樣品為樣品與DPPH作用后并去除樣品自身吸收后的A值。當(dāng)樣品初篩濃度為2 000 μg/ml時(shí)，若清除率≥50%，則進(jìn)行復(fù)篩試驗(yàn)，即將樣品配制成不同質(zhì)量濃度，按上述方法測定清除率，用Origin軟件繪制樣品質(zhì)量濃度與抑制率相關(guān)的曲線，求出IC50；否則，不進(jìn)行復(fù)篩試驗(yàn)。

2.3 體外抗凝血活性測定

[8]，設(shè)定空白組、4個(gè)樣品組（30%提取物總浸膏、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水提物）和2個(gè)陽性對(duì)照組（燈盞花素和維生素K1）。燈盞花素、維生素K1和各樣品分別加入乙醇-丙二醇-注射鹽水（2∶2∶6）溶液，超聲振蕩至溶解，制成質(zhì)量濃度均為1 mg/ml的溶液。于兔耳緣靜脈采血3.6 ml，加至含38 g/L枸櫞酸鈉400 μl的4 ml離心管中，混勻，離心后取血漿，備用。取1.5 ml道夫管，空白組加入血漿0.1 ml及空白溶劑0.1 ml；4個(gè)樣品組分別加入血漿0.1 ml及30%提取物總浸膏、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水提物溶液各0.1 ml；2個(gè)陽性對(duì)照組分別加入血漿0.1 ml及相應(yīng)藥液0.1 ml。于37℃溫育1 min后分別向每管加入2.775 g/L氯化鈣溶液0.1 ml，計(jì)時(shí)，直到檢測到纖維蛋白絲時(shí)停止計(jì)時(shí)，即為血漿復(fù)鈣時(shí)間。維生素K1、燈盞花素對(duì)照組和空白組分別平行測定3次，4個(gè)樣品組分別平行測定6次。結(jié)果以±s表示，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析法（One-way ANOVA），P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 體外α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

2.4.1 酶活力測定 參照文獻(xiàn)[9]，取96微孔板，每孔加入8 μl二甲基亞砜（DMSO）、112 μl磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 6.8）和40 U/ml的α-葡萄糖苷酶溶液20 μ（l溶于PBS緩沖液），振蕩后于37℃溫育15 min，然后加入2.5 mmol/L PNPG溶液（溶于PBS），振蕩后于37℃溫育15 min，再加入0.2 mol/L的Na2CO3溶液80 μl，混勻。用酶標(biāo)儀測定各孔在405 nm波長的光密度（OD）值。適量調(diào)整α-葡萄糖苷酶溶液濃度，使OD值在1.9～2.3之間，可進(jìn)行樣品抑制活性測定。

2.4.2 體外α-葡萄糖苷酶活力抑制能力測定 4個(gè)樣品均用DMSO制備成質(zhì)量濃度為30 mg/ml的溶液，按需用DMSO稀釋成相應(yīng)質(zhì)量濃度的樣品溶液。根據(jù)反應(yīng)體系，加入8 μl樣品溶液、112 μl PBS（pH 6.8）、20 μl α-葡萄糖苷酶溶液（40 U/ml），振蕩后于37℃溫育15 min，加入2.5 mmol/L PNPG溶液，振蕩后于37℃溫育15 min，再加入80 μl Na2CO3溶液（0.2 mol/L），用酶標(biāo)儀測定其在405 nm波長下的光密度（OD）。同時(shí)設(shè)相同體系下不加酶的樣品空白組、不加樣品的空白對(duì)照組以及加阿卡波糖的陽性對(duì)照組。計(jì)算不同樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率：酶活性抑制率（%）＝（OD樣品+酶－OD樣品）（/ODDMSO+酶－ODDMSO）×100%，當(dāng)樣品初篩質(zhì)量濃度為1 500 μg/ml時(shí)，若抑制率≥50%，則進(jìn)行復(fù)篩試驗(yàn)，即將樣品配制成不同質(zhì)量濃度，按上述方法測定抑制率，用Origin軟件繪制樣品質(zhì)量濃度與抑制率相關(guān)的曲線，求出IC50；否則，不進(jìn)行復(fù)篩試驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 體外抗氧化活性測定結(jié)果

金銀花水提物對(duì)Fe3+還原能力和清除ABTS、DPPH自由基的活性均不好；金銀花乙酸乙酯部位的抗氧化能力在4個(gè)提取物中最強(qiáng)，其Trolox當(dāng)量大于BHT，清除DPPH自由基的IC50值低于BHT；其次是總浸膏，但總浸膏的作用均弱于陽性對(duì)照，結(jié)果詳見表1。

3.2 體外抗凝血活性測定結(jié)果

表1 金銀花不同溶劑提取部位的抗氧化活性測定結(jié)果Tab 1 Antioxidant activity of different extracts from L.japonicae

總浸膏組與空白組比較血漿復(fù)鈣時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；乙酸乙酯部位組、正丁醇部位組與空白組比較血漿復(fù)鈣時(shí)間顯著縮短（P＜0.01），且與維生素K1組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，乙酸乙酯部位和正丁醇部位表現(xiàn)出較強(qiáng)的體外促凝活性。水提物組與空白組比較血漿復(fù)鈣時(shí)間顯著延長（P＜0.001），與燈盞花素組比較血漿復(fù)鈣時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，金銀花水提物表現(xiàn)出較好的體外抗凝活性。綜上所述，具有促凝血作用的樣品促凝順序?yàn)榫S生素K1＞正丁醇部位＞乙酸乙酯部位；具有抗凝血活性的樣品抗凝作用順序?yàn)闊舯K花素＞水提物，結(jié)果詳見表2。

表2 金銀花不同溶劑提取部位對(duì)體外血漿復(fù)鈣時(shí)間的影響（±s，s）Tab 2 Effect of different extracts from L.japonicae on plasma recalcification time in vitr（o±s，s）

表2 金銀花不同溶劑提取部位對(duì)體外血漿復(fù)鈣時(shí)間的影響（±s，s）Tab 2 Effect of different extracts from L.japonicae on plasma recalcification time in vitr（o±s，s）

注：與空白組比較，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001Note：vs.blank group，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001

30%乙醇提取物總浸膏乙酸乙酯部位正丁醇部位水提物空白組維生素K1燈盞花素6666333 191.88±8.98 153.80±7.69＊＊149.20±1.25＊＊210.28±2.19＊＊＊174.13±1.35 146.33±4.40＊＊215.55±5.30＊＊樣品n 體外血漿復(fù)鈣時(shí)間

3.3 體外α-葡萄糖苷酶抑制活性測定結(jié)果

金銀花水提物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的體外抑制作用較差。在初篩質(zhì)量濃度為1 500 μg/ml時(shí)，金銀花30%乙醇提取物總浸膏和其乙酸乙酯部位的抑制率分別為108.09%、102.81%，均大于陽性對(duì)照阿卡波糖的52.74%；且其IC50分別為378.61、451.45 μg/ml，均小于阿卡波糖的1 358.34μg/ml?？梢姡疸y花30%乙醇提取物總浸膏、乙酸乙酯部位對(duì)α-葡萄糖苷酶活性均有較強(qiáng)的抑制作用，且金銀花乙酸乙酯部位效果要優(yōu)于總浸膏，結(jié)果詳見表3。

4 討論

在前期研究[10]中，筆者從金銀花30%乙醇提取物中的乙酸乙酯部位分離出5個(gè)化合物，經(jīng)過結(jié)構(gòu)鑒定分別為二十五烷醇、β-谷甾醇、5-羥基-7，4′-二甲氧基黃酮、α-D-葡萄糖和棕櫚酸，其中二十五烷醇和α-D-葡萄糖首次從該屬植物中分離得到。本研究采用體外抗氧化活性的測定、體外凝血活性的測定以及α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的測定，考察了金銀花不同提取物的生物活性。其中，抗氧化試驗(yàn)選擇常用的食品抗氧化劑PG、BHT、BHA作為陽性對(duì)照，這3種物質(zhì)的Trolox當(dāng)量和對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力均不同，可更加全面地評(píng)價(jià)金銀花各樣品的抗氧化活性。在體外凝血活性測定試驗(yàn)中，以臨床常用的止血藥物維生素K1（可促使肝臟合成凝血酶原）作為促凝血活性的陽性對(duì)照，以活血藥物燈盞花素（具有抗血小板聚集作用）作為抗凝血活性的陽性對(duì)照，可分別評(píng)價(jià)金銀花不同樣品的促凝血或抗凝血活性。

表3 金銀花各溶劑部位對(duì)體外α-葡萄糖苷酶活性的影響Tab 3 Effect of different extracts from L.japonicae on the activity of α-glucosidase in vitro

結(jié)果表明，金銀花乙酸乙酯部位的抗氧化活性以及對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用均要優(yōu)于其總浸膏、正丁醇部位及水提物；金銀花水提物的抗凝血作用效果較好，而金銀花的正丁醇部位的促凝血效果要優(yōu)于乙酸乙酯部位，原因可能與金銀花各部位所含的化學(xué)成分有關(guān)。劉慧瓊等[11]研究半夏中β-谷甾醇的抗氧化作用發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇對(duì)氧自由基具有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)油脂也有較強(qiáng)的抗氧化作用。從金銀花乙酸乙酯部位中分離出的化合物中含有β-谷甾醇和黃酮類化合物，因此根據(jù)本研究結(jié)果認(rèn)為金銀花乙酸乙酯部位的抗氧化活性較好，此觀點(diǎn)與文獻(xiàn)[11]相符。

綜上，本研究體外活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金銀花具有一定的抗氧化、抗凝血及抑制α-葡萄糖苷酶活性，其中以乙酸乙酯部位活性最強(qiáng)。

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（編輯：林 靜）

Study on in vitro Antioxidant，Anticoagulant and α-glucosidase Inhibitory Activities of Different Extracts of Lonicerae japonicae from Fengqiu

ZHU Xiaofeng1，2，ZHU Xiaodi1，WANG Jinmei1（1.Institute of TCM，Henan University，Henan Kaifeng 475004，China；2.Shanghai Branch，Sanofi（China）Investment Co.，Ltd.，Shanghai 200040，China）

OBJECTIVE：To investigate in vitro antioxidant，anticoagulant and α-glucosidase inhibitory activities of different extracts of Lonicerae japonicae from Fengqiu.METHODS：The total extract was obtained from L.japonicae by extraction with 30% ethanol，and dispersed in water，from which the extracts of corresponding parts were obtained after extraction successively with trichloromethane and ethyl acetate.The in vitro antioxidant activity of different extracts from L.japonicae[reflected by IC50，Trolox equivalent value]was investigated by 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）radical，2，2′-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）（ABTS）radical scavenging test and Fe3+reduction and antioxidant capacity test.The α-glucosidase inhibitory activity and coagulant activity of 4 extracts were also studied in vitro.RESULTS：The ethyl acetate extract of L.japonicae had the highest antioxidant activity among 4 extracts，IC50of ABTS and DPPH were 9.22，25.23μg/ml and Trolox equivalent value was（2 480.80± 5.51）μmol/g.Procoagulant activity of water extract and anticoagulation activity of n-butyl alcohol extract were the highest；the plasma recalcification time were（210.28±2.19）s and（149.20±1.25）s.Both total extract and ethyl acetate part inhibited the activity of α-glucosidase，and IC50of re-screening were 378.61，451.45 μg/ml.CONCLUSIONS：L.japonicae from Fengqiu have good antioxidant，anticoagulant and α-glucosidase inhibitory activities in vitro，and could be further developed and studied.

Lonicerae japonicae；Fengqiu；Antioxidant；Coagulant；α-glucosidase；in vitro

R284

A

1001-0408（2016）34-4804-03

2016-03-21

2016-08-09）

＊碩士。研究方向：中藥化學(xué)。電話：0371-23880680。E-mail：zxfw0802@126.com

#通信作者：講師，碩士。研究方向：中藥活性成分研究。電話：0371-23880680。E-mail：wangjinmeiscp@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.34.16