馬 嘯，郭志慧，張新全，白史且，李達旭，游明鴻，張昌兵

(1.四川農業(yè)大學動物科技學院草業(yè)科學系，四川 成都 611130；2.四川省草原科學研究院，四川 成都 611731)

利用形態(tài)性狀以及SSR標記鑒定4個川西北老芒麥品種(系)

馬 嘯1，郭志慧1，張新全1，白史且2，李達旭2，游明鴻2，張昌兵2

(1.四川農業(yè)大學動物科技學院草業(yè)科學系，四川 成都 611130；2.四川省草原科學研究院，四川 成都 611731)

基于23個形態(tài)性狀和SSR分子標記，對在川西北推廣應用的老芒麥(Elymus sibiricus)3個國審品種(‘川草2號’、‘阿壩’和‘康巴’)及1個新品系(‘雅江’)進行了鑒定研究.各品種表型性狀與遺傳背景差異較明顯.新品系‘雅江’表現(xiàn)出優(yōu)良的農藝性狀，在株高、葉長、葉寬、莖粗等形態(tài)性狀均值顯著高于3個對照品種(P＜0.05).13對多態(tài)性好、特異性強、條帶清晰的SSR引物在4個品種(系)共擴增出90條帶，其中具有多態(tài)性的條帶共68條，引物多態(tài)性條帶比例(PPB)、多態(tài)性信息含量(PIC)及Shannon多樣性指數(shù)(H)的平均值分別為76.32%、0.309及0.451，在供試品種(系)中均表現(xiàn)出較高的多態(tài)性.基于形態(tài)數(shù)據(jù)的歐氏距離和基于SSR數(shù)據(jù)的遺傳距離矩陣之間具有較強的相關性(r＝0.696，P＝0.08)，表明聯(lián)合形態(tài)學標記和遺傳標記能很好的用于品種鑒定，并且基于形態(tài)數(shù)據(jù)以及SSR分子標記的UPGMA聚類結果基本一致.篩選出4對引物可用于供試品種鑒定，并繪制了DNA指紋圖譜.新品系‘雅江’具有明顯區(qū)別于其它3個主推品種的形態(tài)特征和遺傳背景，這為川西北高原老芒麥主要品種的遺傳關系分析及品種的知識產權保護提供了支撐數(shù)據(jù).

老芒麥；形態(tài)性狀；SSR標記；品種鑒定；指紋圖譜

老芒麥(Elymus sibiricus)是禾本科(Gramineae)披堿草屬多年生的疏叢型優(yōu)良牧草，為異源四倍體，具有StStHH的染色體組構成[1].在我國主要分布在中國新疆、內蒙古和青藏高原等地區(qū)[2].老芒麥對寒冷干旱氣候具有良好的生態(tài)適應性，并且具有優(yōu)質、高產的特性[3]，在草甸草原、草甸群落中能夠形成優(yōu)勢種以及建群種[4]，廣泛用于放牧、栽培草地建植及牧草改良育種等，已經成為青藏高原地區(qū)栽培利用最為廣泛的當家草種之一，在草地畜牧業(yè)中發(fā)揮了巨大作用[5].

老芒麥為自花授粉植物，但其異交率較高[6]，而且對于多年生牧草而言，品種群體內的純度或表型整齊度不如大麥(Hordeum vulgare L.)、燕麥(Avena sativa L.)等自花授粉作物那樣重要，而是更加強調其牧草產量和適應性等方面，故而單株選擇、混合選擇和集團選擇均是老芒麥常用的育種方法.截至2015年通過全國牧草品種審定委員會已經審定登記了8個老芒麥品種，隨著品種數(shù)量越來越多，品種的真實性鑒定對于種子產業(yè)發(fā)展和知識產權保護愈發(fā)重要.鑒定栽培品種、品系等在內的優(yōu)異育種材料間的遺傳關系及多樣性是植物育種的重要基礎性工作.一般而言，牧草品種鑒定是指通過比較送驗樣品或田間植株與所屬種(或屬)以及品種的符合程度來判斷[7].主要包括品種的真實性和品種純度[8].而品種真實性是指樣品是否名實相符，這是品種鑒定的首要內容，也是進行純度檢測的基礎[8].由于品種群體內變異的存在，導致老芒麥品種的鑒定不像小麥(Triticum aestivum L.)、水稻(Oryza sativa L.)、大豆[Glycine max (L.)Merr]等純系品種利用單株進行鑒定那樣方便.另外，老芒麥品種多為野生種質材料馴化而來，這種育種的原始材料很有可能在野外與已經大面積在退牧還草等生態(tài)項目中大規(guī)模推廣使用的已有老芒麥品種發(fā)生雜交，或者原始材料就是已有品種的某些變異單株構成，這樣最終導致不同的育種原始材料遺傳關系相近，造成不同品種的遺傳基礎狹窄，增加了品種鑒定的困難.20世紀90年代，我國正式加入《國際植物新品種保護公約》，涉及植物品種權爭議和育種者權益保護的事例逐年增加，而權威、穩(wěn)定的檢測方法對植物新品種準確鑒定及保護具有重要意義.

DUS(Distinctness，Uniformity，Stability)測試是由國際植物新品種保護聯(lián)盟(UPOV)提出，即植物品種特異性、一致性和穩(wěn)定性，主要測定植物部分表型性狀來描述和鑒定品種[9].但是表型鑒定所需周期長，性狀多，易受環(huán)境因子、栽培條件和個體發(fā)育的影響，對遺傳變異的檢測有限，不能滿足種質資源鑒定和品種工作的需要[10].隨著DNA分子標記的發(fā)展，極大地彌補了形態(tài)學標記的不足，其中，簡單重復序列(Simple Sequence Repeat，SSR)標記具有多態(tài)信息含量高、重復性好、引物設計簡單及共顯性遺傳的特點，是植物指紋圖譜構建及品種鑒定的首選標記[11-12].有效地結合表型性狀及SSR等分子標記，通過合理的統(tǒng)計方法，比較不同品種間表型及遺傳的差異，為更好地了解品種的適應性以及其推廣應用提供理論支持.

本研究選取了利用川西北高原野生種質選育而成的3個老芒麥品種(‘阿壩’、‘川草2號’及‘康巴’)和1個老芒麥新品系(‘雅江’老芒麥)，采用形態(tài)學標記以及SSR分子標記，鑒定不同老芒麥品種(系)在表型及分子水平上的多態(tài)性，以期為川西北高原老芒麥品種知識產權保護提供一些理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗選取3份老芒麥國審品種，‘川草2號’老芒麥、‘阿壩’老芒麥、‘康巴’老芒麥以及1份新品系‘雅江’老芒麥(表1)，供試材料2012年種植于四川省草原科學研究院紅原縣試驗地，隨機區(qū)組設計，每個品種4次重復，每個小區(qū)6 m2(3 m×2 m)種植12 株，株行距均為1 m.

表1 供試的老芒麥品種(系)Table 1 Elymus sibiricus cultivars(strains)in the experiment

1.2 形態(tài)性狀測定

在植株抽穗期(2014年7-8月)，每個品種的每個小區(qū)隨機抽取5株，共觀測20個單株，每個單株隨機取3個分蘗枝進行重復觀測，測定方法參照《老芒麥種質資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》[13].共測量23個形態(tài)性狀指標(表2)并求出其均值及標準差.

1.3 SSR分子標記

1.3.1 基因組DNA提取

基因組DNA提取采用混合單株 DNA樣本(Bulked Samples)進行，每個品種選取30個單株的葉片等量混合[8]，參照Doyle[14]描述的CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法，使用植物基因組DNA提取試劑盒(DP305，北京天根)提取基因組DNA，利用超微量分光光度儀(Nano 2000)檢測DNA的純度和濃度，經檢測合格的DNA樣品保存于-20℃冰箱中備用.

1.3.2 SSR-PCR擴增及電泳檢測

引物參考前人在老芒麥(ESGS)[15]、披堿草屬物種(Elw)[16]及小麥(Xgwm，WMS)[17]上發(fā)表的 SSR 和(或)EST-SSR序列，并由成都金杰生物技術有限公司合成165對引物.SSR-PCR擴增體系和反應程序主要參照R?der[17]，PCR擴增體系優(yōu)化為15 μL:模板DNA 3 μL(10 ng·μL-1)，上下游引物各0.8 μL(5 pmol·μL-1)，Mix混合液7.5 μL(含有10×PCR buffer、Mg2＋、dNTPs)(北京天根科技生化公司)，Taq酶0.4 μL(2.5 U·μL-1)(北京天根科技生化公司)，其余用ddH2O補足.在Bioradicycle PCR儀上進行PCR擴增，擴增程序為:94℃預變性4 min；94℃變性30 s，49～60℃(退火溫度根據(jù)不同的引物進行設置)變性30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存.擴增產物經8%非變性聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺：甲叉＝19：1)用1×TBE緩沖液進行垂直電泳分離，150 V電泳0.5 h，400 V電壓電泳約3 h，電泳結束后進行銀染和照相保存.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

表型性狀數(shù)據(jù)利用Excel 2016和SPSS19.0軟件求出均值、標準差，并將表型性狀的數(shù)據(jù)進行標準化處理后計算出各品種間的歐氏距離(Euclidean Distance，ED).由于老芒麥為異源四倍體，SSR分子標記可能導致擴增位點不止一個，并且難以使用基因分型方法統(tǒng)計，而為保證結果的穩(wěn)定性，試驗采用混合單株DNA樣本的原則，僅統(tǒng)計符合期望擴增片段分子量附近的強帶，并在相同遷移位置有帶記為1，無帶記為0，形成原始數(shù)據(jù)矩陣.統(tǒng)計擴增條帶總數(shù)(Total number of bands，TNB)及多態(tài)性條帶數(shù)(Number of polymorphic bands，NPB)，并計算多態(tài)性條帶比例(Percentage of polymorphic bands，PPB)，Shannon多樣性指數(shù)(Shannon diversity index，H)[18]及多態(tài)性信息含量(Polymorphism information content，PIC)[19].對形成的二元數(shù)據(jù)矩陣用Dice系數(shù)[20]估算各品種間的遺傳相似性(GS)，Dice系數(shù)實際上等同于Nei-Li[21]遺傳相似系數(shù)，Nei-Li遺傳距離(GD)＝1-GS.

基于形態(tài)性狀的歐氏距離(ED)及SSR分子標記的遺傳距離(GD)，采用非加權配對算數(shù)平均法(UPGMA)，使用NTSYS-pc 2.10軟件[22]分別繪制樹狀關系圖.使用Winboot軟件[23]基于bootstrap分析(9999次置換)來檢驗樹狀圖的可靠性.同時使用TFPGA軟件[24]用Mantel test[25](9999次置換)對由形態(tài)學指標計算所得的歐氏距離矩陣和SSR遺傳距離矩陣之間的相關性進行檢測.

2 結果與分析

2.1 老芒麥品種(系)形態(tài)學標記結果

2.1.1 表型性狀的多樣性分析

由形態(tài)性狀統(tǒng)計分析的結果(表2)可以看出，老芒麥品種(系)的形態(tài)特征存在差異.比較均值發(fā)現(xiàn):旗葉長、旗葉寬、倒二葉長、莖節(jié)間數(shù)、莖節(jié)間長、穗寬、小穗數(shù)、外稃長、第1穎長、第1穎寬及主穗軸第1節(jié)間長這11個性狀均以‘雅江’老芒麥最大；倒二葉寬、旗葉與穗基部長度、莖粗、穗長、小花數(shù)、外稃寬、外稃芒長、第1穎芒長和穗節(jié)數(shù)這9個性狀以‘康巴’老芒麥最大；‘川草2號’老芒麥的株高、小穗長及小穗寬3個性狀較其他品種為最大.同時，為更好地了解不同品種(系)之間的遺傳多樣性以及顯著性差異，采用方差分析方法，其結果顯示(表2)，23個表型性狀中僅有3個性狀(旗葉寬、穗軸節(jié)數(shù)和小穗長)差異不顯著，其余性狀均為顯著或極顯著，不同老芒麥品種(系)之間存在較大差異.

2.1.2 形態(tài)特征聚類分析

基于品種(系)23個性狀的歐氏距離(ED)，采用UPGMA法對4個老芒麥品種(系)的形態(tài)性狀數(shù)據(jù)進行聚類分析，構建聚類圖(圖1).并以歐氏距離的平均值(ED＝4.8)為截值，可將4份種質分為3大類群.其中，‘阿壩’和‘川草2號’老芒麥聚為一類，剩下兩個品種(系)分別為單獨一類.結果說明，‘阿壩’和‘川草2號’老芒麥品種親緣關系更近，兩者在形態(tài)性狀之間差異相對更小，單純從形態(tài)性狀可能很難區(qū)分兩者，而‘康巴’老芒麥與其他3個品種的遺傳距離最遠.

圖1 基于形態(tài)數(shù)據(jù)的4個老芒麥品種(系)的樹形圖Fig.1 Dendrogram of cluster analysis of four Elymus sibiricus cultivars(strains)based on morphological data

2.2 老芒麥品種(系)SSR標記分析

2.2.1 SSR標記多態(tài)性分析

從165對SSR引物中篩選出13對多態(tài)性好、特異性強、條帶清晰的引物(表3)，并對4個老芒麥品種(系)進行SSR-PCR擴增，共擴增出90條帶，平均每對SSR引物擴增的條帶為6.923條，其中具有多態(tài)性的條帶共68條，多態(tài)性條帶比例(PPB)在60%～ 100%之間，平均為 76.32%，其中，WMS169和 Xgwm190的多態(tài)性比率為100%(表3).各引物等位位點多態(tài)性信息量(PIC)在0.188～0.450之間，平均值為0.309；引物的 Shannon多樣性指數(shù)(H)在0.281～ 0.641之間，平均值為0.451.結果表明SSR分子標記在老芒麥中具有良好的多態(tài)性，也說明該標記是用于分析老芒麥材料遺傳變異或進行種質鑒定的有效工具.

2.2.2 SSR標記聚類分析

為進一步了解不同品種(系)之間的遺傳關系，計算得到品種(系)的Nei-Li遺傳距離(GD)，GD變異范圍在0.140(‘川草2號’vs.‘阿壩’)～0.500(‘康巴’vs.‘雅江’)之間，平均值為0.335.基于相似性系數(shù)，采用UPGMA法進行聚類分析(圖2)，在GD＝0.335的水平下，供試材料可分為2個類群，第I聚類組共有3個品種(系)，分別為‘阿壩’、‘川草2號’和‘雅江’老芒麥；第II聚類組僅有‘康巴’老芒麥.結果說明，‘阿壩’和‘川草2號’老芒麥親緣關系接近，‘康巴’老芒麥較其他3個品種(系)遺傳背景可能更復雜.

表3 4個老芒麥品種(系)SSR的擴增結果Table 3 The various statistics of SSR amplified results for four Elymus sibiricus cultivars(strains)

圖2 4個老芒麥品種(系)的SSR遺傳多樣性聚類圖Fig.2 Dendrogram of cluster analysis of four Elymus sibiricus cultivars(strains)based on SSR markers

2.2.3 老芒麥品種(系)SSR標記指紋圖譜

由表2結果顯示，13對引物中的Elw0669s043、WMS169、Xgwm190及Xgwm311共4個引物可直接鑒定4個老芒麥品種(系)，其余引物只能鑒別其中的1個或2個品種.基于這4對SSR引物構建供試老芒麥品種(系)的分子標記圖譜(圖3).

圖3 基于4對SSR引物擴增的供試老芒麥品種(系)指紋圖譜注:1，阿壩(Aba)；2，川草2號(Chuancao No.2)；3，康巴(Kangba)；4，雅江(Yajiang)；引物依次為WMS169、Elw0669s043、Xgwm190及Xgwm311.Fig.3 SSR fingerprintings for Elymus sibiricus cultivars(strains)，amplified by 4 primer pairsNote:1，Aba；2，Chuancao No.2；3，Kangba；4，Yajiang；Order of primers:WMS169，Elw0669s043，Xgwm190 and Xgwm311.

3 討論

形態(tài)學標記與分子標記是植物育種過程非常重要的手段，形態(tài)學特征具有直觀、簡便、易測等優(yōu)點，但同時也易受光、溫、水肥等環(huán)境條件或栽培條件的影響，特別對于一些在形態(tài)學特征上的差異較小的品種，單純依靠植物的形態(tài)學特征來鑒別品種存在很大的不確定性[26].分子標記不受發(fā)育時期及環(huán)境條件的影響，標記聯(lián)合使用不僅有利于深入研究種質資源，而且為品種鑒定提供更加科學的理論依據(jù)[27].

本研究利用23個形態(tài)學性狀及13個SSR標記，分析了4個老芒麥品種(系)表型性狀的顯著性及分子遺傳的多樣性.基于表型測定的結果表明，品種間的不同形態(tài)性狀差異顯著，其中，‘雅江’老芒麥的13個形態(tài)性狀均值顯著高于其他3個品種，表現(xiàn)出優(yōu)良的農藝性狀，‘阿壩’老芒麥和‘川草2號’老芒麥形態(tài)差異不顯著，因此很難直接根據(jù)某幾個性狀區(qū)分所有品種(系).分子標記能較好的彌補不足，盡管SSR分子標記在種質鑒別應用中，遺傳距離越近，鑒別越有難度[28]，但是在本研究中利用的SSR引物，不僅供試種質中均變現(xiàn)出較高的多態(tài)性(PPB＝76.32%，PIC＝0.309，H ＝0.451)，而且獲得 4對引物(Elw0669s043，WMS169，Xgwm190，Xgwm311)，可用于繪制DNA指紋圖譜，快速準確鑒定品種之間的差異，這為今后的品種鑒定提供了理論基礎.

同時，對形態(tài)性狀的歐氏距離和SSR分子遺傳距離矩陣之間進行Mantel相關性分析，一般定義當0.5＜r＜0.8，兩變量之間中度相關[29]，本研究結果(r＝0.695 7，P＝0.084 8)顯示形態(tài)性狀的歐氏距離和SSR分子遺傳距離矩陣之間具有強的正相關性，表明聯(lián)合形態(tài)學標記和遺傳標記能很好的用于品種鑒定.基于形態(tài)數(shù)據(jù)以及SSR分子標記的聚類結果基本一致且均顯示‘阿壩’老芒麥和‘川草2號’老芒麥差異不顯著，親緣關系接近，‘康巴’老芒麥與其他3個品種的親緣關系最遠.出現(xiàn)這種結果的原因可能是由于野生牧草馴化品種群體多為混合選擇或輪回選擇而來，其群體內雜合性可能要高于原始材料較純合或單一的育成品種[30].具體而言，‘阿壩’老芒麥和‘川草2號’老芒麥品種均是以四川省紅原、若爾蓋、阿壩等縣天然草地的野生老芒麥種群作為選育原始材料[31-32]，其地理距離較小，遺傳背景差異可能不大；‘康巴’老芒麥的遺傳基礎可能更復雜，來自甘孜州高原農牧區(qū)多縣的野生老芒麥種群[33]，來自多份材料的可能的混雜后代，又進行混合選擇選育出來，而其他3個品種遺傳基礎相對單一，即原始來源僅1～3份材料.另外，老芒麥雖為自花授粉的繁育方式，但存在較高異交率，屬于兼性自交[34-36]，故而采用開放授粉選育的品種群體內部具有一定的雜合性；以及在品種繁育推廣過程中機械或生物學混雜等[28]原因造成了品種之間的遺傳分化較弱.

4 結論

采用形態(tài)學標記和分子標記對原始群體來自川西北高原的4個老芒麥品種(系)的結果表明，各品種表型性狀與遺傳背景差異較明顯，并篩選出4個引物將供試品種鑒定出來，繪制了DNA指紋圖譜，表明‘雅江’老芒麥新品系具有明顯區(qū)別于其它3個主推品種的形態(tài)特征和遺傳背景，這為川西北高原老芒麥主要品種的遺傳關系分析及品種的知識產權保護提供了支撐數(shù)據(jù).

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(責任編輯：李建忠，付強，張陽，羅敏；英文編輯：周序林，鄭玉才)

Identification of four Elymus sibiricus cultivar(strains)from Northwest Plateau of Sichuan using morphological traits and SSR markers

MA Xiao1，GUO Zhi-hui1，ZHANG Xin-quan1，BAI Shi-qie2，LI Da-xu2，YOU Ming-hong2，ZHANG Chang-bing2
(1.College of Animal Science and Technology，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，P.R.C.；2.Sichuan Academy of Grassland Science，Chengdu 611731，P.R.C.)

Based on 23 morphological traits and SSR markers，three cultivars(Chuancao No.2，Aba and Kangba)and a new strain(Yajiang)of Elymus sibiricus which were utilized in the Northwest Plateau of Sichuan were identified.There was an obvious difference among varieties at phenotypic traits and genetic background.Morphological traits were measured，such as plant height，leaf length，leaf width，culm diameter and so on，of which the new strain‘Yajiang’were significantly higher than those of the other three varieties(P＜0.05)and showed excellent agronomic traits.Besides，13 pairs of SSR primers with good polymorphism，specificity and clarity were amplified in the four cultivars(strains)and generated 90 bands，among which a total of 68 were polymorphic.According to the mean of percentage of polymorphic bands(PPB＝76.32%)，polymorphism information content(PIC＝0.309)and Shannon diversity index(H＝0.451)，the four cultivars(strains)presented high polymorphisms.A positive correlation(r＝0.696，P＝0.08)existed between Euclidean distance and Dice genetic distance，indicating that the combination of morphological traits and genetic markers could be used for cultivar identification.Two UPGMA dendrograms based on morphological and SSR data were similar and there were differences among all cultivars(strains)for phenotypic and geneticbackground.Furthermore，four pairs of primers(Elw0669s043，Xgwm190，WMS169 and Xgwm311)were selected for DNA fingerprinting construction and cultivar identification.In general，the present study demonstrated that the new strain‘Yajiang’was significantly different from the other three E.sibiricus cultivars，and provided supportive data for genetic relationship analysis and intellectual property rights protection for cultivars in the Northwest Plateau of Sichuan.

Elymus sibiricus；morphological trait；SSR marker；cultivar identification；DNA fingerprinting

S54

A

2095-4271(2016)04-0364-09

10.11920/xnmdzk.2016.04.002

2016-05-15

馬嘯(1977-)，男，博士，教授，博士生導師.E-mail:maroar＠126.com.

四川省科技支撐計劃(13ZC1635，2015SZ0200)