馮瑞章， 周誥均， 魏 琴， 周萬(wàn)海*， 范軼玲， 秦 歡

( 1． 宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院 香料植物資源開(kāi)發(fā)與利用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 宜賓 644000； 2． 四川省高縣月江森林經(jīng)營(yíng)所， 四川 宜賓 645152 )

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油樟內(nèi)生溶磷菌的篩選及其生物學(xué)特性

馮瑞章1， 周誥均2， 魏 琴1， 周萬(wàn)海1*， 范軼玲1， 秦 歡1

( 1． 宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院 香料植物資源開(kāi)發(fā)與利用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 宜賓 644000； 2． 四川省高縣月江森林經(jīng)營(yíng)所， 四川 宜賓 645152 )

篩選具有溶磷能力的植物內(nèi)生細(xì)菌，并探索該類(lèi)菌的促生和抗逆性能, 有助于擴(kuò)大溶磷微生物來(lái)源、研發(fā)微生物肥料、改善土壤磷素營(yíng)養(yǎng)和提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)量。該研究以從油樟組織中分離得到的50株內(nèi)生細(xì)菌為材料，通過(guò)溶磷圈法初篩得到24株具有溶磷潛能的菌株，利用鉬藍(lán)比色法測(cè)定它們的溶磷能力和培養(yǎng)液的pH值，并研究溶磷能力較強(qiáng)菌株產(chǎn)生吲哚乙酸(IAA) 、鐵載體、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶、幾丁質(zhì)酶等促生和抗逆性能。結(jié)果表明：24株油樟內(nèi)生細(xì)菌都能從磷酸鈣中釋放出有效磷(溶磷量為51.26～237.08 μg·mL-1)，其中，YG60、YG43、YG36、YG25、YG49、YG44株菌的溶磷量較高，均大于150 μg·mL-1。接種油樟內(nèi)生菌后，培養(yǎng)液的pH值均有一定程度的降低，但菌株溶磷量與培養(yǎng)液pH值間不存在顯著相關(guān)性。6株溶磷量大于150 μg·mL-1的菌株大部分具有分泌IAA、產(chǎn)鐵載體、ACC脫氨酶活性和幾丁質(zhì)酶活性的能力；其中YG43、YG60和YG25分泌IAA的能力較強(qiáng) (IAA分泌量分別為22.55、18.75和16.41μg·mL-1)，YG43和YG60產(chǎn)鐵載體的能力較強(qiáng)(As/Ar小于0.6)，YG43、YG60和YG25的ACC脫氨酶活性(分別為0.194、0.224、0.208 U·mg-1)較高，YG43和YG60的幾丁質(zhì)酶活性(分別為2.968 U和2.502 U)較高。綜合菌株的溶磷、促生和抗逆性能，認(rèn)為YG43、YG60和YG25 菌株在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高植物抗性及生物防治方面具有較好的應(yīng)用前景。

溶磷內(nèi)生菌, 溶磷能力, IAA, 鐵載體, ACC脫氨酶, 幾丁質(zhì)酶

磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需營(yíng)養(yǎng)元素之一，植物缺磷直接影響植物的生長(zhǎng)和作物的產(chǎn)量。目前，我國(guó)有74%的耕地土壤缺磷?；瘜W(xué)磷肥的施加雖然能夠改善植物磷素營(yíng)養(yǎng)，但由于磷在土壤中的固定導(dǎo)致磷肥當(dāng)季利用率較低(黃靜等，2010)。在我國(guó)南方的紅、黃壤中缺磷現(xiàn)象更為嚴(yán)重(王同等，2014)。研究表明接種溶磷微生物能提高植物磷素營(yíng)養(yǎng)(Illmer & Schinner，1992)。但是，由于受到土著微生物、土壤環(huán)境等因素的影響，土壤中溶磷微生物難以成功定殖，導(dǎo)致其應(yīng)用效果不穩(wěn)定(Reyes et al，2006；黃靜等，2010)。

內(nèi)生菌作為植物植株整個(gè)微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，具有固氮、增強(qiáng)植物抗逆性、抗病蟲(chóng)害及促進(jìn)植物生長(zhǎng)等多種作用(黃靜等，2010)；同時(shí)大多數(shù)植物內(nèi)生菌屬兼性?xún)?nèi)生，它們不僅存在于植物體內(nèi)，而且也常見(jiàn)于根際土壤等環(huán)境中 (Lodewyckx et al，2002)。油樟(Cinnamomumlongepaniculatum)為樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum)的常綠喬木，也是重要的經(jīng)濟(jì)作物，其根、莖、葉、種子均可作為提取芳香油的原料。調(diào)查顯示，油樟本身幾乎不發(fā)生植物病害，亦有研究表明油樟油對(duì)水稻稻瘟病菌等6種植物病原真菌的菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)有強(qiáng)烈的抑制作用(魏琴等，2006)，這些特性可能與內(nèi)生菌參與構(gòu)成油樟植株內(nèi)部微生態(tài)環(huán)境有關(guān)(游玲等，2009)。因此，以油樟為材料，對(duì)其組織內(nèi)的溶磷細(xì)菌進(jìn)行分離篩選，利用內(nèi)生細(xì)菌的兼性特性，既可使這些微生物定殖于植物體內(nèi)發(fā)揮促生和防病效應(yīng)，也可使其定殖于植物根際土壤中發(fā)揮溶磷功能，為植物生長(zhǎng)提供磷素營(yíng)養(yǎng)，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)。

本研究以50株油樟內(nèi)生細(xì)菌為材料，篩選具溶磷能力的菌株，研究其溶磷能力和生物學(xué)特性，為植物內(nèi)生菌在提高植物磷素營(yíng)養(yǎng)、促進(jìn)植物生長(zhǎng)等方面的利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株為分離自油樟(Cinnamomumlongepaniculatum)組織中的50株內(nèi)生細(xì)菌，于宜賓學(xué)院香料植物資源開(kāi)發(fā)與利用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 油樟內(nèi)生溶磷菌株篩選

1.2.1.1 內(nèi)生溶磷菌株初選 將供試菌株活化后點(diǎn)接種至固體PKO培養(yǎng)基上，每株菌重復(fù)4次，28 ℃培養(yǎng) 7 d ，觀察能否有溶磷圈生成，測(cè)定各菌株的溶磷圈直徑和菌落直徑，分別以D、d表示，根據(jù)菌株是否產(chǎn)生溶磷圈初步判定該菌株有無(wú)溶磷潛能。

1.2.1.2 油樟內(nèi)生溶磷菌株搖瓶復(fù)選 將50 mL PKO液體培養(yǎng)基置于150 mL三角瓶，121 ℃，1.01 P條件高壓滅菌25 min，備用。將LB斜面培養(yǎng)基上生長(zhǎng)24 h的供試菌株制成菌數(shù)約為 108cell·mL-1菌懸液，按菌懸液與培養(yǎng)基1∶50比例接種，不接菌作為對(duì)照，每株菌重復(fù)3次，28 ℃、160 r·min-1搖床培養(yǎng)8 d，4 ℃、10 000 r·min-1離心15 min，取一定量的上清液，測(cè)其有效磷含量和pH值，有效磷含量即為菌株的溶磷量。有效磷含量用鉬銻抗比色法測(cè)定，菌株溶磷量為扣除不接種對(duì)照的值(μg P·mL-1)；pH值用酸度計(jì)測(cè)定。

1.2.2 油樟內(nèi)生溶磷菌株分泌IAA能力

1.2.2.1 定性測(cè)定 將篩選出的溶磷效果較好的菌株接種于盛有15 mL King 液體培養(yǎng)基的試管中，28 ℃、160 r·min-1搖床培養(yǎng)8 d，每株菌重復(fù)3次。藥品選擇和配置方法參考李振東等(2010)。分別取各菌株培養(yǎng)液50 μL滴置于白色的陶瓷板上，加入50 μL PC 比色液。以在比色液中加等量 50 mg·L-1生長(zhǎng)素(IAA)，不加菌株培養(yǎng)液作為對(duì)照。室溫條件下15 min內(nèi)觀察顏色變化，顏色變?yōu)榉奂t色表示可以分泌IAA，顏色越深表示分泌IAA濃度越大，不變色則表示不能分泌IAA。

1.2.2.2 定量測(cè)定 采用Glickmann et al (1995)的Salkowski比色法：配置2.5 mg·mL-1的色氨酸溶液過(guò)濾除菌，取1 mL加入4 mL已高壓滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，使色氨酸濃度達(dá)到0.5 mg·mL-1，分別接種各供試菌株，28 ℃、160 r·min-1搖床培養(yǎng)3 d，4 ℃、10 000 r·min-1離心10 min后取上清液1 mL，加入50 μL 的10 mmol·L-1正磷酸，加入2 mL Salkowski’s顯色劑，黑暗條件(25 ℃)顯色30 min，測(cè)定530 nm下的吸光值。以蒸餾水為對(duì)照調(diào)零，配制不同濃度的IAA作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算培養(yǎng)液的IAA濃度，以μg·mL-1表示。

1.2.3 油樟內(nèi)生溶磷菌株產(chǎn)鐵載體能力的測(cè)定

1.2.3.1 定性篩選 將篩選出的溶磷效果較好的菌株分別接種于鉻天青(chromea zural S，CAS) 平板培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2 d后觀察是否有橙紅色顯色圈出現(xiàn)，并測(cè)量顯色圈大小。

1.2.3.2 定量測(cè)定 將產(chǎn)生橙紅色顯色圈的菌株分別接種于MKB培養(yǎng)液和富鐵培養(yǎng)液中，28 ℃、160 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h，接種1 mL發(fā)酵液于MKB和富鐵培養(yǎng)液中，28 ℃、160 r·min-1搖床培養(yǎng)36 h，4 ℃、10 000 r·min-1下離心10 min，即可得到鐵載體上清液和其無(wú)鐵載體對(duì)照的上清液，備用。取鐵載體上清液于潔凈的試管中，加入相同體積CAS檢測(cè)液，充分混勻，于630 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，以As表示，取雙蒸水作為對(duì)照調(diào)零；另取相同體積的富鐵培養(yǎng)液(對(duì)照液)與CAS檢測(cè)液反應(yīng)，于630 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，以Ar表示， 計(jì)算As與Ar的比值(As/Ar)，參照Machuca & Milagres(2003)的標(biāo)準(zhǔn)和方法檢測(cè)各菌株產(chǎn)鐵載體的能力。

1.2.4 油樟內(nèi)生溶磷菌株ACC脫氨酶能力的測(cè)定

1.2.4.1 定性測(cè)定 參考Penrose & Glick(2003)的方法，分別接種各供試菌株于5 mL的無(wú)氮液體培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h；接種上述培養(yǎng)液0.1 mL于5 mL DF液體培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h；接種0.1 mL培養(yǎng)液于5 mL ADF液體培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r·min-1搖床培養(yǎng)24～48 h，以不接種菌株的ADF培養(yǎng)基為對(duì)照；將ADF培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)菌株重復(fù)轉(zhuǎn)接和培養(yǎng)3次，能夠生長(zhǎng)的菌株為ACC脫氨酶陽(yáng)性菌株。

1.2.4.2 定量測(cè)定 參照Seleh et al(2001)的方法，每分鐘形成1 mol 丁酮酸的量為1個(gè)酶活力單位。采用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白為牛血清白蛋白。酶活力的計(jì)算參照黃蓋等(2013)的方法，酶活力用U·mg-1表示。

1.2.5 油樟內(nèi)生溶磷菌株產(chǎn)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的測(cè)定

1.2.5.1 定性測(cè)定 分別接種各供試菌株于幾丁質(zhì)平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落周?chē)欠裼型该魅Ξa(chǎn)生，有則表明該株菌有產(chǎn)幾丁質(zhì)的能力，反之則沒(méi)有。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生溶磷菌株篩選及溶磷能力

通過(guò)溶磷圈法對(duì)前期分離純化得到的50株油樟內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行初篩，發(fā)現(xiàn)菌株在PKO固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生的透明圈差距較大。如表1所示，培養(yǎng)7 d后，D/d>3的細(xì)菌有6株(菌株YG43的D/d值最大，為3.84)， 占供試菌株數(shù)量的12%， 2.52的24株細(xì)菌通過(guò)液體培養(yǎng)研究它們的溶磷能力， 另外26個(gè)菌株，則側(cè)重研究其它方面的性能。

表 1 不同 D/d 值菌株分布

Table 1 Distribution of strains with different D/d values

D/d值D/dValue菌株數(shù)Strainnumber 菌株編號(hào) CodeofstrainsD/d>36YY1、YG32、YG36、YG43、YG44、YG602．5

將初選得到的24株菌分別液體培養(yǎng)8 d后，測(cè)定其上清液可溶性磷含量，由表2可知，菌株對(duì)磷酸鈣的溶解能力存在較大差異，供試菌株的溶磷量在51.26～237.08 μg·mL-1之間，其中大于200.00 μg·mL-1的有2株菌，150～200 μg·mL-1的有4株菌，100～150 μg·mL-1的有10株菌，分別占供試菌株的8.33%、16.67%和41.67%。菌株YG60的溶磷量最大，為237.08 μg·mL-1，是溶磷量最小菌株YG33(51.26 μg·mL-1)的4.62倍。此外，從各菌株的溶磷能力定性與定量結(jié)果可知，對(duì)油樟內(nèi)生菌株而言，并非定性測(cè)定的D/d值越大，定量測(cè)定的溶磷量就越大，如YY1和YG60的D/d值均大于3，溶磷量卻分別為237.08 μg·mL-1和61.75 μg·mL-1，前者是后者的3.84倍。因此，固體平板培養(yǎng)只可對(duì)供試菌株是否具有溶磷能力作初步定性判斷，而液體培養(yǎng)測(cè)定的菌株溶磷能力在理論上更準(zhǔn)確。此外，各菌株在PKO培養(yǎng)基上生長(zhǎng)8 d 后，其培養(yǎng)液的pH值均較接種前明顯下降，各菌株培養(yǎng)液的pH值介于4.5～5.5，下降最大的為YG9，pH值下降為4.4。

表 2 菌株的溶磷量和培養(yǎng)液的pH值

Table 2 Available phosphorus and pH value of phosphate-solubilizing endophytic bacteria

菌株Strain溶磷量Availablephosphorus(μg·mL?1)pH值pHvalue菌株Strain溶磷量Availablephosphorus(μg·mL?1)pH值pHvalueYG60237．08±7．454．9YG38125．63±6．935．0YG43211．53±12．394．6YG30113．80±9．255．3YG36180．68±13．175．2YG23108．63±8．155．1YG25166．85±11．215．5YG6104．28±6．125．4YG49151．28±7．414．6YG996．23±4．314．4YG44150．20±5．234．6YG6191．60±10．755．3YG2145．90±8．494．8YG1883．50±5．824．7YG32143．30±10．275．1YY769．36±8．585．2XY8139．30±8．405．4YG467．11±6．407．0YG46137．00±9．295．2YY161．75±3．235．8YG35135．45±10．575．1YG5755．15±5．116．0YG7126．74±7．824．9YG3351．26±4．345．3

為進(jìn)一步發(fā)掘油樟溶磷內(nèi)生菌的功能，選擇溶磷量大于150 μg·mL-1的6株菌(分別為YG60、YG43、YG36、YG25、YG49、YG44)研究其生物學(xué)特性。

2.2 內(nèi)生菌分泌IAA性能分析

油樟內(nèi)生細(xì)菌分泌IAA能力的定性顯色反應(yīng)結(jié)果表明(表3)。6株供試菌株不但具有較高的溶解難溶性磷的能力，同時(shí)均具有分泌生長(zhǎng)素的功能，YG43的顯色反應(yīng)為深紅色， YG60、YG25和YG44菌株呈粉紅色， YG49和YG36呈淺粉紅色。定量測(cè)定結(jié)果表明各菌株分泌IAA量在4.92～22.55 μg·mL-1之間，其中分泌IAA量超過(guò)20 μg·mL-1的有1株(YG43，22.55 μg·mL-1)， 超過(guò)10 μg·mL-1的有2株(YG60、 YG25，IAA分泌量分別為18.75 μg·mL-1和16.41 μg·mL-1)，其余3株的IAA分泌量均低于10 μg·mL-1，定量測(cè)定與定性測(cè)定結(jié)果相對(duì)一致。

表 3 菌株分泌 IAA和產(chǎn)鐵載體的性能

Table 3 IAA and siderophore producing ability of phosphate solubilizing endophytic bacteria

菌株StrainIAA含量ContentofIAA顯色反應(yīng)1SpottestIAA值(μg·mL?1)IAAvalue鐵載體Siderophore定性檢測(cè)2Qualitativeanalysis定量檢測(cè)(As/Ar)QuantitativeanalysisYG43+++22．55±2．21+++0．579±0．0334YG60++18．75±1．97+++0．459±0．0479YG25++16．41±2．01++0．699±0．0298YG44+9．68±1．17+0．847±0．0641YG49+7．67±1．39--YG36+4．92±0．84+0．821±0．3957

注： 1. +++、++、 + 分別表示深粉紅色、粉紅色和淺粉色； 2. +++、++、+、-分別表示橙黃色暈圈較大、中等、較小和沒(méi)有。

Note: 1. +++、++、 + - + . means deep pink, pink and light pink respectively; 2. +++、++、+、- means larger, moderate, small and without orange-red hole respectively.

通過(guò)“拍立得”的推廣活動(dòng)，我們可以得出這樣一個(gè)結(jié)論：在耳邊說(shuō)一千遍的道理，都不如讓顧客親眼看到更有影響力。

2.3 內(nèi)生菌產(chǎn)鐵載體能力分析

將6株油樟內(nèi)生細(xì)菌接種于CAS平板上培養(yǎng)2 d后，檢測(cè)到除YG49之外的其它5菌株(YG43、YG60、YG25、YG44、YG36)的菌落周?chē)霈F(xiàn)橙黃色暈圈，說(shuō)明這些菌株在CAS培養(yǎng)基上產(chǎn)生了鐵載體，其中YG43、YG60和YG25菌落周?chē)纬傻某燃t色暈圈較大，表明這3株菌能夠產(chǎn)生較多的鐵載體。定量檢測(cè)鐵載體的方法以As與Ar的比值(As/Ar，Ar為對(duì)照吸光值)大小比較不同菌株產(chǎn)生鐵載體的能力，As/Ar值越小，說(shuō)明菌株產(chǎn)鐵載體的能力越強(qiáng)。由表3可知，YG43和YG60的As/Ar值小于0.6，分別為0.579和0.458，說(shuō)明這2株菌產(chǎn)生鐵載體的能力較強(qiáng)；YG25的As/Ar值為0.694，說(shuō)明產(chǎn)鐵載體的能力中等；YG44和YG36的As/Ar值均大于0.8，說(shuō)明這2株菌能產(chǎn)生鐵載體，但產(chǎn)鐵載體能力較弱。

2.4 內(nèi)生菌產(chǎn)脫氨酶(ACC)能力分析

將溶磷能力較高的6株油樟內(nèi)生細(xì)菌接種于SMA固體培養(yǎng)基后的ACC脫氨酶活性定性篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(表4)，經(jīng)5次傳代后YG49不能正常生長(zhǎng)，其它5株菌(YG60、YG43、YG36、YG25、YG44)均能夠在SMA固體培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，說(shuō)明除YG49外，其它菌株都具有ACC脫氨酶活性。定量檢測(cè)結(jié)果顯示(表4)，各菌株的ACC脫氨酶活性大小順序?yàn)閅G60>YG25>YG43> YG36> YG44，酶活大小介于0.052～0.224 U·mg-1；YG49無(wú)產(chǎn)ACC脫氨酶能力。

2.5 內(nèi)生菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶能力

將6株油樟內(nèi)生溶磷細(xì)菌接種于產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的固體平板上培養(yǎng)7 d，發(fā)現(xiàn)均有明顯的透明圈產(chǎn)生，說(shuō)明供試菌株皆有一定的產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的能力，但各菌株的透明圈差異較大，透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)的比值(D/d)介于1.59～3.12。通過(guò)液體培養(yǎng)定量測(cè)定供試菌株的幾丁質(zhì)酶活性的結(jié)果表明(表4)，各菌株的幾丁質(zhì)酶活性大小順序?yàn)閅G60>YG25>YG43>YG36>YG44>YG49，酶活大小介于0.618～2.968 U·mg-1。

表 4 菌株ACC脫氨酶活性和幾丁質(zhì)酶活性

Table 4 ACC deaminase activity and chitosanase activity of phosphate solubilizing endophytic bacteria

菌株StrainACC脫氨酶ACCdeaminase定性檢測(cè)QualitativeanalysisACC脫氨酶活性ACCdeaminaseactivity(U·mg?1)幾丁質(zhì)酶ChitosanaseD/d值D/dvalue幾丁質(zhì)酶活性Chitosanaseactivity(U)YG43+0．194±0．0173．122．968±0．314YG60+0．224±0．0232．432．502±0．23YG25+0．208±0．0091．590．618±0．179YG44+0．052±0．0111．871．972±0．157YG49--2．011．428±0．169YG36+0．081±0．0142．351．624±0．201

注： +，陽(yáng)性; -，陰性。

Note: +, positive; -, negative.

3 討論與結(jié)論

植物內(nèi)生細(xì)菌因其對(duì)宿主的多種有益的生物學(xué)作用，逐漸成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。作為我國(guó)特有的天然產(chǎn)芳香油植物，可經(jīng)高溫蒸餾從油樟(Cinnamomumlongepaniculatum)葉片中提取幾十種不同沸點(diǎn)的化學(xué)物質(zhì)，這些物質(zhì)精加工后的產(chǎn)物均是國(guó)防、醫(yī)藥、輕工等方面重要的稀有原料。具有溶磷能力的油樟內(nèi)生促生細(xì)菌的篩選及促生、抗逆等生物學(xué)特性的研究，對(duì)溶磷微生物資源收集，植物內(nèi)生細(xì)菌與宿主相互作用機(jī)制的理解及土壤磷素營(yíng)養(yǎng)改善途徑的開(kāi)發(fā)都具有重要意義(黃靜等，2010)。

本研究從油樟內(nèi)生細(xì)菌中初篩到24株具有溶磷潛能的菌株，液體培養(yǎng)結(jié)果顯示，溶磷量大于200.00 μg·mL-1的菌株有2株，150～200 μg·mL-1的菌株有4株，黃靜等(2010)從玉米葉中分離的內(nèi)生細(xì)菌溶磷量高達(dá)537.6 μg·mL-1，姚玉玲等(2014)從矮生嵩草中分離的內(nèi)生細(xì)菌溶磷量為60.52 μg·mL-1，說(shuō)明油樟內(nèi)生細(xì)菌對(duì)無(wú)機(jī)磷的溶解能力較強(qiáng)。微生物在溶磷過(guò)程中會(huì)分泌如甲酸、草酸、蘋(píng)果酸等在內(nèi)的各類(lèi)有機(jī)酸，這些酸類(lèi)物質(zhì)既可降低培養(yǎng)基質(zhì)的pH 又能與鈣、鐵、鋁等離子形成螯合物從而使難溶性磷酸鹽溶解(Rashid et al，2004)。本研究中24株菌在PKO培養(yǎng)基上生長(zhǎng)8 d 后，其培養(yǎng)液的pH值較接種前均有明顯下降，但菌株溶磷量與培養(yǎng)液pH值之間無(wú)顯著線(xiàn)性關(guān)系(P>0.05)。表明內(nèi)生溶磷細(xì)菌在培養(yǎng)期間，介質(zhì)的酸度有一定降低，但培養(yǎng)液中的有機(jī)酸含量及種類(lèi)、磷酸酶活性及產(chǎn)生多糖等的動(dòng)態(tài)變化，均會(huì)對(duì)菌株的溶磷能力產(chǎn)生影響(李顯剛等，2012)。

植物內(nèi)生菌可通過(guò)自身合成或者促進(jìn)植物合成如生長(zhǎng)素(IAA)、赤霉素(GA)、細(xì)胞分裂素(CTKs) 、脫落酸 (ABA)和乙烯等植物生長(zhǎng)激素促進(jìn)植物體的生長(zhǎng)發(fā)育，其中生長(zhǎng)素(IAA)是最活躍的成分(楊波等，2013)。一定濃度的IAA既可直接促進(jìn)植物生長(zhǎng)，又能通過(guò)增加細(xì)胞的體積和質(zhì)量、改變細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境達(dá)到促生的目的(李顯剛等，2012)。本研究發(fā)現(xiàn)，6株溶磷能力較強(qiáng)的油樟內(nèi)生細(xì)菌均具有分泌生長(zhǎng)素的功能，且3株分泌IAA的能力較強(qiáng)(YG43、YG60和YG25)，這一結(jié)果對(duì)油樟內(nèi)生細(xì)菌作為促生菌促進(jìn)植物生長(zhǎng)開(kāi)辟了新的途徑。

鐵載體的產(chǎn)生是植物內(nèi)生細(xì)菌促進(jìn)宿主生長(zhǎng)發(fā)育的另一條重要途徑，植物內(nèi)生微生物或者植物根際通過(guò)分泌產(chǎn)生多種對(duì)鐵具有高親和力的鐵載體，鐵載體可將Fe3+還原為植物體可以高效吸收和利用的Fe2+，溶解和結(jié)合土壤中的鐵元素供植物細(xì)胞利用；同時(shí)微生物產(chǎn)生的鐵載體通過(guò)與植物根際的病原微生物爭(zhēng)奪有限的鐵營(yíng)養(yǎng)，抑制病原微生物的生長(zhǎng)和繁殖，從而起到生物防治作用(Buyer et al，1993)。目前還無(wú)可作為各類(lèi)微生物鐵載體的標(biāo)品用于其標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定，因此，國(guó)際上通用As/Ar 值作為微生物鐵載體定量檢測(cè)的指標(biāo)(何苗等，2011)。本研究中，5株油樟內(nèi)生細(xì)菌能夠產(chǎn)生鐵載體，且YG43和YG60的As/Ar值小于0.6，產(chǎn)鐵載體的能力較強(qiáng)。因此，產(chǎn)鐵載體可能是油樟內(nèi)生細(xì)菌的促生機(jī)理之一。

ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylate，1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸)脫氨酶是許多植物促生細(xì)菌(Plant growth promoting bacteria，PGPB)共有的一個(gè)特征性酶，具有該種酶活性的內(nèi)生細(xì)菌和植物根際對(duì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育、提高植物抗高低溫、鹽、旱、澇、及重金屬等各種脅迫起到重要作用(Iniguez et al，2004)。黃蓋等(2013)從苜蓿根際分離的ACC 30菌株的酶活力為0.217 U·mg-1，該菌株能夠促進(jìn)苜蓿根的伸長(zhǎng)。本研究中除YG49外，其它5株菌均具有ACC脫氨酶活性，且YG49、YG60和YG25的酶活力在0.2 U·mg-1左右。因此，油樟內(nèi)生細(xì)菌具有極大的促生、抗逆潛能。

幾丁質(zhì)酶水解真菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)產(chǎn)生的中間產(chǎn)物幾丁寡糖可以作為植物功能調(diào)節(jié)劑，刺激植物生長(zhǎng)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防御反應(yīng)，從而提高植物的抗病性(郭玉蓮，2005)。此外，幾丁質(zhì)酶與β-1,3-葡聚糖酶、其它PRP等防衛(wèi)蛋白存在協(xié)同作用，可以增大作用范圍，從而提高抑菌效果。本研究中的6株油樟內(nèi)生細(xì)菌皆有較高的產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的能力，酶活大小介于0.618～2.968 U·mg-1，這些內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶對(duì)植物病蟲(chóng)卵的入侵和感染起到重要的防治作用(Barboza-Corona et al，2009)，這也可能是油樟生長(zhǎng)中幾乎不發(fā)生植物病、蟲(chóng)害的原因之一。研究表明，真菌和細(xì)菌的幾丁質(zhì)酶活性最高，細(xì)菌對(duì)真菌的抑制作用上最強(qiáng)(陳三鳳和李季倫，1994)，因此，本研究可豐富幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌及生防菌資源。

通過(guò)溶磷圈法和液體培養(yǎng)法從50株油樟內(nèi)生細(xì)菌中篩選到6株(YG60、YG43、YG36、YG25、YG49、YG44)溶磷能力較強(qiáng)的菌株，綜合各菌株的溶磷、促生和抗逆性能，認(rèn)為YG43、YG60和YG25 菌株在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高植物抗性及生物防治方面具有較好的應(yīng)用前景。

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Screening and characterization of phosphate dissolving endophytic bacteria fromCinnamomumlongepaniculatum

FENG Rui-Zhang1， ZHOU Gao-Jun2， WEI Qin1，ZHOU Wan-Hai1*， FAN Yi-Ling1， QIN Huan1

( 1．KeyLabofAromaticPlantResourcesExploitationandUtilizationinSichuanHigherEducation，CollegeofLifeSciences&FoodEngineering,YibinUniversity， Yibin 644000， Sichuan, China； 2．GaoCountyYuejiangForestManagementStation, Yibin 645152， Sichuan, China )

Screening endophytic strains with phosphate-dissolving and exploring the characterization of growth promoting and resistance were conducive to broad the phosphate dissolving microbial resources, to develop microbial fertilizers, to improve soil phosphorus nutritious and to increase agricultural yield. We isolated 50 endophytic bacteria from interior tissues ofCinnamomumlongepaniculatum, and 24 phosphate dissolving endophytic bacteria strains were screened using phosphate solubilizing zone (PKO) inorganic culture medium, subsequently, the capacity of dissolving phosphorus of 24 strains were determined by phosphor-molybdate blue color methods, and the characteristics benefited to plant-microbe interaction-indoleacetic acid (IAA), siderophore, 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid deaminase (ACC) and chitosanase activities were also evaluated. The results showed that 24 strains could release phosphate from tricalcium phosphate with the range of dissolving phosphate from 51.26 μg·mL-1to 237.0 μg·mL-1, and the maximum phosphate content in the solution was obtained with strain YG60. Among 24 strains, 6 strains (YG60, YG43, YG36, YG25, YG49, YG44) showed the higher phosphate solubilization capacity (237.08, 211.53, 180.68, 166.85, 151.28, 150.20 μg·mL-1respectively). Furthermore, 24 strains could decrease the pH of the medium with the pH value range from 4.5 to 5.5, and the relationship between pH and phosphorus solubizition was also discussed; however, there were no close relationship between them. The further experimental results showed that most of the 6 strains with higher phosphate dissolving capacity had the ability to produce IAA and siderophores, and had ACC deaminase and chitosanase activity. Among them, YG43, YG60 and YG25 possessed higher IAA producing capacity (22.55, 18.75 and 16.41 μg·mL-1respectively); YG43 and YG60 possessed higher siderophores of As/Ar<0.6 (0.459, 0.579 respectively ); YG43, YG60 and YG25 had strong ACC deaminase activity (0.194, 0.224, 0.208 U·mg-1)，YG43 and YG60 had strong chitosanase activity (2.968 U，2.502 U). In terms of all the properties of dissolving phosphate, secreting IAA, siderophores, ACC deaminase and chitosanase, strains YG43, YG60 and YG25 isolated from interior tissues ofC.longepaniculatumhave abundant biological characteristics related to plant growth promotion， stress homeostasis regulation and biocontrol activity. They are possible to be further developed as excellent strains for application.

phosphate-dissolving endophytic bacteria, capacity of dissolving phosphorus, IAA, siderophores, ACC deaminase, chitosanase

10.11931/guihaia.gxzw201506007

2015-09-10

2015-12-09

宜賓市科技創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)(2012ZNY006)；四川省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目 (20151064b17); 四川省高?？蒲袆?chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(14TD0031)；四川省青年科技創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)培育計(jì)劃項(xiàng)目(2011JTD0035) [Supported by Program for Science and Technology Bureau of Yibin City (2012ZNY006)； Training Programs of Innovation and Entrepreneurship Undergraduates in Sichuan Province (201510641017); Scientific Research Fund of Sichuan Provincial Education Department (14TD0031)； Sichuan Youth Science and Technology Innovation Teams (2011JTD0035)]。

馮瑞章(1978-)，女，甘肅武威人，博士，副教授，研究方向?yàn)槲⑸镔Y源開(kāi)發(fā)利用，(E-mail)ruizhangfeng@126.com。

*通訊作者： 周萬(wàn)海，博士，副教授，主要從事農(nóng)業(yè)資源環(huán)境研究，(E-mail)wanhaizhou@126.com。

Q939.96

A

1000-3142(2016)11-1396-07

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