錢鐳，李秀軍，曲雙雙，肖光輝，劉婷，*

（1.黑龍江東方學(xué)院食品與環(huán)境工程學(xué)部，黑龍江哈爾濱150086；2.黑龍江飛鶴乳品有限公司，黑龍江齊齊哈爾 162100）

GPC-UPLC-MS/MS法測(cè)定食用油中壬基酚和雙酚A

錢鐳1，李秀軍1，曲雙雙1，肖光輝2，劉婷1，*

（1.黑龍江東方學(xué)院食品與環(huán)境工程學(xué)部，黑龍江哈爾濱150086；2.黑龍江飛鶴乳品有限公司，黑龍江齊齊哈爾 162100）

建立食用油中壬基酚和雙酚A的凝膠滲透色譜（GPC）-超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS/MS）分析檢測(cè)方法。食用油樣品經(jīng)乙酸乙酯-環(huán)己烷溶解，GPC凈化后，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析測(cè)定。儀器使用WATERS ACQUITYUPLCBEHC18色譜柱，以甲醇-0.1%氨水為流動(dòng)相，梯度洗脫分離后，串聯(lián)四極桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式檢測(cè)，采用內(nèi)標(biāo)法定量。分析結(jié)果表明，目標(biāo)物檢出限為1.0μg/kg，在1.0μg/kg～5.0×102μg/kg的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（R2>0.99），試驗(yàn)中平均添加回收率85.1%～112.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.57%～6.08%。

壬基酚；雙酚A；凝膠滲透色譜；超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；食用油

壬基酚（Nonylphenol，NP）和雙酚A（bisphenol A，BPA）是具有代表性的環(huán)境激素，兩者作為內(nèi)分泌干擾物質(zhì)，可以通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，并在人體內(nèi)富集。NP對(duì)人體癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和生殖能力具有嚴(yán)重影響，此前已被歐盟列為優(yōu)先危害物質(zhì)[1]。BPA主要是影響哺乳動(dòng)物的生殖以及后天的發(fā)育[2]，引起生殖器官異常和雄性雌性化等方面的危害[3]。食用被NP、BPA污染的農(nóng)作物生產(chǎn)的食用油時(shí)會(huì)使NP、BPA在人體內(nèi)積累，同時(shí)NP、BPA具有良好的增塑性，一些食品包裝企業(yè)使用NP、BPA作為包材增塑劑，大量應(yīng)用于食品包材及容器內(nèi)部涂層[4]。此外NP和BPA具有較強(qiáng)的脂溶特性，當(dāng)使用以NP、BPA作為增塑劑的容器盛裝食用油時(shí)，NP和BPA就會(huì)從容器中溶出，長(zhǎng)期食用該類食用油將會(huì)使NP、BPA在體內(nèi)大量富集從而影響人體的生殖和內(nèi)分泌系統(tǒng)，破壞人體健康。截止目前奧斯陸-巴黎公約（OSPAR）已經(jīng)將NP列入優(yōu)先控制污染物質(zhì)名錄當(dāng)中[5]。歐盟2003EC指令也規(guī)定商品中NP的含量不得高于0.1%，加拿大衛(wèi)生部于2008年宣布禁止進(jìn)口和銷售含有BPA的嬰兒奶瓶[6]。中國(guó)于2011年1月12日將NP、BPA添加至有毒物質(zhì)限制名單中，禁止NP、BPA化學(xué)品的進(jìn)出口[7]。

凝膠滲透色譜（gel permeation chro-matograph，GPC）又稱體積排除法，是使用目標(biāo)物質(zhì)的優(yōu)良溶劑作為流動(dòng)相，內(nèi)部分離介質(zhì)采用多孔交聯(lián)高分子凝膠的液相色譜法。GPC作為一種樣品凈化手段，在樣品富含脂肪、色素等物質(zhì)時(shí)分離效果較其他方法更加具有優(yōu)勢(shì)[8]。

目前NP、BPA的檢測(cè)主要以生物、環(huán)境、玩具等方面為主[9]，應(yīng)用GPC法檢測(cè)食用油中的NP、BPA幾乎未見報(bào)道。研究建立GPC-UPLC-MS/MS的檢測(cè)方法法對(duì)食用油中的NP、BPA進(jìn)行定量分析。該法準(zhǔn)確高效，可以為食用油中的環(huán)境激素檢測(cè)分析提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食用油：市售色拉油；乙酸乙酯（色譜純）：美國(guó)SIGMA；環(huán)己烷（色譜純）：美國(guó)Fisher公司；甲醇（色譜純）：德國(guó)默克公司；氨水（優(yōu)級(jí)純）：哈爾濱試劑化工廠；壬基酚和雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品及同位素內(nèi)標(biāo)（純度> 99%）：Dr.EhrenstorferGmbH（上海安譜公司代購(gòu)）；試驗(yàn)用水：Milli-Q凈化系統(tǒng)過(guò)濾。

1.2 主要儀器與設(shè)備

UPLC-TQD超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Waters公司；AccuPrepTM自動(dòng)凝膠色譜系統(tǒng)：GPC，美國(guó)J2 Scientific公司，配有內(nèi)裝BIO-Beads S-X3填料的凈化柱（400mm×20mm，美國(guó)J2公司）；SI-0256渦旋振蕩器：美國(guó)SIVortex-Genie；Milli-Q超純水器：美國(guó)，Millipore公司；N-EVAP112水浴氮吹儀：美國(guó)OA公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取壬基酚和雙酚A的固體標(biāo)準(zhǔn)品各10mg，用甲醇溶解并定容至100mL，配制成100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于2℃～8℃冰箱冷藏。使用時(shí)根據(jù)需要，用甲醇稀釋成不同濃度的工作液。

分別稱取壬基酚和雙酚A的固體內(nèi)標(biāo)物各20mg，用甲醇溶解并定容至100mL，配制成200μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，置于2℃～8℃冰箱冷藏。

1.4 樣品處理

樣品提?。簻?zhǔn)確稱取食用油樣品0.2 g（精確至0.01 g）于10mL玻璃試管中，加入內(nèi)標(biāo)后再加入環(huán)己烷-乙酸乙酯（體積比1∶1）溶液溶解定容，渦旋均勻，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后，供GPC上機(jī)，同時(shí)進(jìn)行試劑空白試驗(yàn)。樣品經(jīng)GPC凈化后，供UPLC-MS/MS檢測(cè)分析。試驗(yàn)中所用玻璃器具，使用前在400℃馬弗爐內(nèi)灼燒4 h。

1.5 GPC凈化條件

凝膠柱300mm×20mm，Bio Beads SX-3作為柱填料；環(huán)己烷/乙酸乙酯（體積比為1∶1）作為流動(dòng)相；流速：5.0mL/min；進(jìn)樣量：5mL；收集時(shí)間：6min～16min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。

1.6 超高效液相色譜條件

捕集柱：Waters Isolator Column（P/N186004476），捕集柱位于進(jìn)樣閥之前；色譜柱：ACQUITYUPLCBEH C18柱，1.7μm，2.1mm×50.0mm；柱溫：35℃；流速：0.3mL/min；進(jìn)樣量：10μL；流動(dòng)相：A為0.1%的氨水，B為甲醇；梯度洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)相及梯度洗脫條件Table1 M obilephaseand gradientelution conditions

1.7 質(zhì)譜分析條件

質(zhì)譜條件：離子源，電噴霧電離ESI（-）；離子源溫度150℃；脫溶劑溫度400℃；脫溶劑氣流量800 L/h；錐孔氣流量50 L/h；毛細(xì)管電壓2.8 kV；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式采集。具體的離子采集參數(shù)見表2。

表2 壬基酚和雙酚A質(zhì)譜采集參數(shù)Table2 MSparametersof NP and BPA

2 結(jié)果與分析

2.1 流出時(shí)間的選擇

試驗(yàn)選用環(huán)己烷-乙酸乙酯作為流動(dòng)相，選擇流速：5.0mL/min；進(jìn)樣量：5mL；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm，在此條件下對(duì)目標(biāo)樣品進(jìn)行凝膠滲透色譜流出時(shí)間測(cè)定，得出最佳收集餾分時(shí)間，見圖1。

圖1 NP和BPA混合樣品凝膠滲透色譜流出圖Fig.1 NP and BPAm ixed samp leGPC outflow Figure

由圖1可以確定NP和BPA最佳的收集餾分時(shí)間為6min～16min，且兩種目標(biāo)物質(zhì)的回收率均大于80%。

2.2 凈化條件優(yōu)化

目前國(guó)內(nèi)的樣品凈化方式多為萃取柱提取，由于食用油中含有大量的脂肪以及色素類物質(zhì)，對(duì)于一般的提取方式而言有很大的干擾，會(huì)影響對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的提取效果。這種條件下凝膠滲透色譜可以更加有效的達(dá)到預(yù)期效果，它具有重現(xiàn)性好、回收率高、適用于多殘留分析等特點(diǎn)[10]。綜合考慮采用凝膠滲透色譜進(jìn)行樣品的凈化以及目標(biāo)物的提取。

2.3 樣品提取劑優(yōu)化

目前樣品提取所使用的試劑多為丙酮、甲醇、正己烷、二氯甲烷以及環(huán)己烷-乙酸乙酯等。本次試驗(yàn)針對(duì)上述不同試劑對(duì)NP、BPA提取效果做出分析，為NP、BPA選擇最佳的提取試劑，并計(jì)算各試劑提取NP、BPA的回收率。試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 不同提取劑提取雙酚A和壬基酚混合樣品回收率圖Fig.2 Differentextraction agentextraction of BPA and NPm ixed samp le recovery Figure

由圖2數(shù)據(jù)得出：丙酮、甲醇以及正己烷的回收率均達(dá)不到理想標(biāo)準(zhǔn)。二氯甲烷在提取BPA時(shí)回收率最高，但提取NP的效果相對(duì)較低，而環(huán)己烷-乙酸乙酯提取NP、BPA時(shí)的回收率都較好可以滿足試驗(yàn)要求，且回收率大體持平。綜合考慮，本試驗(yàn)選用環(huán)己烷-乙酸乙酯作為樣品的提取溶劑。

2.4 流動(dòng)相的選擇

選擇甲醇-水和乙腈-水作為流動(dòng)相，比較兩種流動(dòng)相發(fā)現(xiàn)，乙腈-水保留時(shí)間較短，但乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)的響應(yīng)值明顯低于甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)的響應(yīng)值，故首次試驗(yàn)選擇甲醇-水作為流動(dòng)相。在后續(xù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，使用甲醇-水時(shí)BPA的回收率相對(duì)較低，此現(xiàn)象表明流動(dòng)相存在一定的基質(zhì)干擾。而弱堿性緩沖液具有增加靈敏度的效果，但考慮堿性太強(qiáng)會(huì)使色譜柱壽命縮短[11]，所以本方法在流動(dòng)相中加入0.1%的氨水促進(jìn)目標(biāo)化合物的進(jìn)一步電離同時(shí)也避免高濃堿液對(duì)色譜柱的損害，從而提高了分離效果，在本試驗(yàn)條件下，兩種化合物在3min內(nèi)完全分離，達(dá)到預(yù)期效果。

2.5 質(zhì)譜條件的選擇

對(duì)NP、BPA進(jìn)行痕量分析，使用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）。NP、BPA均含有羥基基團(tuán)，如要得到理想的分離離子[M-H]-需要在負(fù)離子的模式下進(jìn)行分析[12]。先需要測(cè)定待測(cè)物的母離子以及子離子（正壬基酚只產(chǎn)生單一的子離子），再對(duì)各待測(cè)化合物的毛細(xì)管電壓、脫溶劑溫度、錐孔電壓等條件進(jìn)行確定，最佳質(zhì)譜條件如表2所示。NP、BPA的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）色譜圖見圖3。

圖3 雙酚A和壬基酚標(biāo)準(zhǔn)品的MRM譜圖Fig.3 Chromatogram sof BPA，NP standardsunder MRM mode

2.6 線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

在上述UPLC-MS/MS儀器條件下測(cè)定2種待測(cè)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，分別配置濃度1.0μg/kg～5.0×102μg/kg的NP、BPA標(biāo)準(zhǔn)溶液。以定量離子的峰面積Y對(duì)相應(yīng)的濃度X（μg/kg）進(jìn)行回歸分析。NP、BPA的線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)以及方法檢出限見表3。

由表3可知NP、BPA物質(zhì)在1.0μg/kg～5.0×102μg/kg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

表3 BPA、NP的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table3 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients and LODsof BPA and NP

2.7 回收率與精密度

在樣品中添加不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)水平為1.0、3.0、5.0μg，每個(gè)水平設(shè)6個(gè)平行，按上述試驗(yàn)條件進(jìn)行處理和測(cè)定，得出食用油中NP與BPA的平均加標(biāo)回收率在85.1%～112.5%之間，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.57%～6.08%，由此可見，該方法精密度良好。具體結(jié)果見表4。

表4 食用油中壬基酚和雙酚A的加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table4 Recoveriesand RSDs for NP，BPA in edibleoil

2.8 實(shí)際樣品的測(cè)定

應(yīng)用上述試驗(yàn)方法，隨機(jī)對(duì)市售食用油選取其中六種品牌相同包裝的產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)分析，分析結(jié)果見表5。

表5 實(shí)際樣品的測(cè)定Table5 Determ ination of realsamples

根據(jù)上述試驗(yàn)方法（GPC-UPLC-MS/MS）對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行分析檢測(cè)。由表5可以看出市售食用油樣品2以及樣品5中均未檢出NP和BPA。NP在樣品1、3、4中檢測(cè)含量為3.03、2.04、5.56μg/kg，BPA在樣品1樣品6中檢測(cè)含量為0.62、2.12μg/kg。表明部分市售食用油當(dāng)中可以檢出少量NP、BPA，該項(xiàng)檢測(cè)方法使用前景廣闊。

3 結(jié)論

初步建立了食用油中NP和BPA的GPC-UPLCMS/MS分析檢測(cè)方法。樣品以環(huán)己烷-乙酸乙酯（體積比1∶1）溶液溶解，經(jīng)GPC凈化，以UPLC-MS/MS檢測(cè)，方法所得NP與BPA的平均加標(biāo)回收率在85.1%～112.5%之間，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.57%～6.08%。該方法準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單且靈敏度高，能夠較好的應(yīng)用于食用油中NP和BPA的分析檢測(cè)。

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Determ ination of NP and BPA in Edible Oil by GPC-UPLC-MS/MS

QIAN Lei1，LIXiu-jun1，QUShuang-shuang1，XIAOGuang-hui2，LIUTing1，*
（1.Instituteof Food Engineering，Heilongjiang EastCollege，Harbin 150086，Heilongjiang，China；2.Heilongjiang Feihe Dairy Co.，Ltd.，Qiqihaer162100，Heilongjiang，China）

Amethod that gel permeation chromatography（GPC）-ultra performance liquid chromatographymassspectrometry（UPLC-MS/MS）used toanalysisand detectnonylphenoland bisphenol A in fatskind foods was established.Samples were dissolved in ethyl acetate-cyclohexane，using ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis after GPC purification.The experiment used WATERSACQUITY UPLCBEH C18 column，withmethanol-0.1%aqueousammonia as themobile phase gradientelution rear tandem quadrupole mass spectrometry with multiple reaction monitoring mode detection using internal standardmethod.The analysis showed thatselected objectdetection limitof1.0μg，in the range of1.0μg/kg～5.0×102μg/kg showed a good linear relationship（R2>0.99），the add recovery ratio on average of85.1%-112.5%and the relative standard deviation of2.57%-6.08%.

NP；BPA；GPC；UPLC-MS/MS；edible oil

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.034

2016-03-17

錢鐳（1981—），男（漢），副教授，工學(xué)博士，研究方向：乳品工程。

*通信作者