，，，

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院放療科，湖南 衡陽 421001；2.中山大學(xué)腫瘤防治中心；3.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

腫瘤微環(huán)境中不同部位CD68+巨噬細(xì)胞對(duì)鼻咽癌進(jìn)展和預(yù)后的影響

蔡曼波1，邵建永2，曾益新2，左建宏3*

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院放療科，湖南 衡陽 421001；2.中山大學(xué)腫瘤防治中心；3.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所)

目的研究免疫微環(huán)境對(duì)不同部位巨噬細(xì)胞對(duì)鼻咽癌(NPC)進(jìn)展和預(yù)后的影響。方法收集在中山大學(xué)腫瘤防治中心經(jīng)病理證實(shí)為鼻咽癌的石蠟標(biāo)本557例。采用免疫組化染色法檢測(cè)巨噬細(xì)胞分子標(biāo)志物CD68，觀察并計(jì)數(shù)CD68在癌巢和間質(zhì)不同部位的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)分析其陽性細(xì)胞數(shù)與臨床病理特征及鼻咽癌患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果CD68+巨噬細(xì)胞在間質(zhì)中浸潤(rùn)比癌巢中活躍(中位數(shù)：4.47/HPF相比1.87/HPF)。Kaplan-Meier生存曲線和log-rank統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，癌巢中的CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)量與NPC患者的無瘤生存時(shí)間及總體生存時(shí)間均顯著正相關(guān)。間質(zhì)中的CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)量與NPC患者的無瘤生存時(shí)間及總體生存時(shí)間亦顯著正相關(guān)。單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型顯示，癌巢中的CD68+巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)較多的患者相比于數(shù)量較少的患者發(fā)生治療后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)(HR=0.667，P=0.002)及死亡(HR=0.626，P=0.002)的風(fēng)險(xiǎn)較低。間質(zhì)中的CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)量較多的患者較數(shù)量較少的患者發(fā)生治療后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)(HR=0.664，P=0.005)及死亡(HR=0.66，P=0.008)的風(fēng)險(xiǎn)較低。結(jié)論免疫微環(huán)境中癌巢和間質(zhì)中CD68+巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量增多與鼻咽癌患者預(yù)后呈正相關(guān)，CD68+巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量增多可降低局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。

腫瘤微環(huán)境； 鼻咽癌； CD68； 巨噬細(xì)胞

腫瘤微環(huán)境在腫瘤的生長(zhǎng)和進(jìn)展中發(fā)揮非常重要的作用[1-2]。由癌細(xì)胞和腫瘤間質(zhì)(免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等)共同組成的組織微環(huán)境是腫瘤發(fā)生發(fā)展的主要戰(zhàn)場(chǎng)，其中免疫細(xì)胞是腫瘤間質(zhì)的重要微環(huán)境組分[3]。腫瘤微環(huán)境的免疫系統(tǒng)如何影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展一直是腫瘤免疫學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)具有挑戰(zhàn)性難題。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是外周血單核細(xì)胞浸潤(rùn)到實(shí)體腫瘤組織中而演變成的巨噬細(xì)胞,在腫瘤的基質(zhì)細(xì)胞中占很大的比例。本研究采用免疫組化染色法檢測(cè)巨噬細(xì)胞分子標(biāo)志物CD68，觀察并計(jì)數(shù)CD68+巨噬細(xì)胞在癌巢和間質(zhì)不同部位的表達(dá)數(shù)目與臨床病理特征及與鼻咽癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1臨床樣本選取2001年1月～2003年12月經(jīng)中山大學(xué)腫瘤防治中心病理科診斷為鼻咽癌并有相應(yīng)臨床隨訪資料的組織標(biāo)本557例。入選條件：(1)所收集蠟塊均為患者首次就診診斷為鼻咽癌的活檢標(biāo)本。(2)觀察HE切片，選擇癌巢較大的鼻咽癌石蠟標(biāo)本。(3)標(biāo)本齊全，有完整臨床隨訪資料。(4)死于其它疾病(非鼻咽癌)或意外死亡的病人被剔除。557例病人中，包括418個(gè)男性和139個(gè)女性病人，年齡19～78歲(年齡中位數(shù)為46歲)。病人的臨床分期依據(jù)1992年中國鼻咽癌分期系統(tǒng)進(jìn)行，Ⅰ～Ⅱ期病人148個(gè)，Ⅲ～Ⅳ期病人409個(gè)。依據(jù)WHO分型將病人分為分化型非角化性癌(WHO Ⅱ型)和未分化型非角化性癌(WHO Ⅲ型)，557例病人中，139例是WHO Ⅱ型病人，402例是WHO Ⅲ型病人。隨訪時(shí)間2～114個(gè)月，在隨訪過程中死亡的235例，113例病人發(fā)生轉(zhuǎn)移。

1.2免疫組化方法分子標(biāo)記物CD68用免疫組化SP法檢測(cè)。將組織芯片置入56 ℃恒溫箱，烘片30～60 min，將切片取出后，常規(guī)脫蠟、脫水；3% H202消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；抗原修復(fù)后，1∶500一抗孵育，4 ℃冰箱過夜；PBS沖洗后，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗后，滴加足以覆蓋整張組織切片的DAB顯色溶液，顯微鏡下控制染色深度；自來水終止顯色，鹽酸酒精分化，蘇木素復(fù)染，晾干或吹干后中性樹膠封片。

1.3免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷免疫組化結(jié)果判定采用雙盲法，由3名對(duì)病例資料完全不知情的病理醫(yī)生對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定，CD68+巨噬細(xì)胞的在腫瘤癌巢和簡(jiǎn)直中的計(jì)數(shù)均在400倍高倍顯微鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)不重復(fù)且具代表性的視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野下陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)，取其平均值即為各巨噬細(xì)胞的密度。

1.4統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料的檢驗(yàn)采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson法，Kaplan-Meier法比較生存情況(log-rank檢驗(yàn))，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行預(yù)后的多因素分析，并計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比(hazard ratio，HR)和95%置信區(qū)間(confidence interval，CI)，最終得到可以獨(dú)立預(yù)測(cè)預(yù)后的參數(shù)。所有統(tǒng)計(jì)分析均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CD68+巨噬細(xì)胞在NPC微環(huán)境癌巢和間質(zhì)中的表達(dá)情況NPC組織中浸潤(rùn)了大量巨噬細(xì)胞，本文分析了CD68+巨噬細(xì)胞在鼻咽癌癌巢(t表示)和間質(zhì)(s表示)中的表達(dá)。在鼻咽癌組織中，CD68表達(dá)于巨噬細(xì)胞胞膜。研究發(fā)現(xiàn)，CD68+巨噬細(xì)胞(黑色箭頭表示)在間質(zhì)中浸潤(rùn)比癌巢中活躍(中位數(shù)：4.47/HPF相比1.87/HPF)。見圖1。

2.2 CD68+巨噬細(xì)胞在癌巢和間質(zhì)中的數(shù)量與鼻咽癌患者預(yù)后的影響本文結(jié)合患者的臨床隨訪資料，進(jìn)一步分析這些免疫細(xì)胞是否會(huì)影響患者的預(yù)后。以ROC曲線建立的cut off值為臨界值，將巨噬細(xì)胞的數(shù)量分為高/低表達(dá)數(shù)量組。Kaplan-Meier生存曲線和log-rank統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，癌巢中的CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)量與NPC患者的無瘤生存時(shí)間(P=0.004)及總體生存時(shí)間(P=0.002)均顯著正相關(guān)。間質(zhì)中的CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)量與NPC患者的無瘤生存時(shí)間(P=0.005)及總體生存時(shí)間(P=0.007)亦顯著正相關(guān)。

圖1 CD68+巨噬細(xì)胞在鼻咽癌癌巢和間質(zhì)中的表達(dá) 用免疫組化方法在鼻咽癌芯片組織石蠟切片上進(jìn)行CD68免疫組化染色。t:癌巢；s:腫瘤間質(zhì)

2.3 CD68+巨噬細(xì)胞在癌巢和間質(zhì)中的數(shù)量對(duì)鼻咽癌患者進(jìn)展的影響采用單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型評(píng)價(jià)CD68巨噬細(xì)胞對(duì)患者治療后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及死亡的風(fēng)險(xiǎn)比(表1)。癌巢中的CD68+巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)較多的患者相比于數(shù)量較少的患者發(fā)生治療后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)(HR，0.667；P=0.002)及死亡(HR，0.626；P=0.002)的風(fēng)險(xiǎn)較低。間質(zhì)中的CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)量較多的患者較數(shù)量較少的患者發(fā)生治療后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)(HR，0.664；P=0.005)及死亡(HR，0.66；P=0.008)的風(fēng)險(xiǎn)較低。

圖2 癌巢和間質(zhì)組織中CD68+巨噬細(xì)胞與患者的Kaplan-Meier累計(jì)生存曲線 A:無瘤生存曲線；B:總體生存曲線. 黑線，巨噬細(xì)胞較少；灰線，巨噬細(xì)胞較多

表1總生存和無瘤生存的單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型

PatientsOS%95%CIHRP值DFS%95%CIHRP值CD68t低27962.4054.8高27775.100.462～0.8480.6260.00267.90.506～0.8790.6670.002CD68s低16960.4052.7高38772.400.486～0.8950.660.00864.90.502～0.8800.6640.005

2.4癌巢和間質(zhì)中巨噬細(xì)胞與各項(xiàng)臨床參數(shù)之間的相關(guān)性腫瘤微環(huán)境中的CD68+巨噬細(xì)胞能顯著影響患者的預(yù)后，浸潤(rùn)數(shù)量增多能明顯降低患者治療后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及死亡風(fēng)險(xiǎn)。進(jìn)一步分析癌巢和間質(zhì)中巨噬細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與各項(xiàng)臨床參數(shù)之間的相關(guān)性。結(jié)果如表2所示，CD68+巨噬細(xì)胞在NPC癌巢中的數(shù)量與腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)明顯負(fù)相關(guān)(Pearson’s R=-0.134P=0.002)。而間質(zhì)中的CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)量亦與與腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)顯著負(fù)相關(guān)(Pearson’s R=-0.118P=0.006)。由此可見，NPC局部組織浸潤(rùn)的CD68+巨噬細(xì)胞能有效的發(fā)揮抗腫瘤的免疫效應(yīng)，是預(yù)后良好的指標(biāo)。

表2CD68+巨噬細(xì)胞癌巢和間質(zhì)中的細(xì)胞數(shù)量與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

CD68s低(n=170)高(n=387)P值CD68t低(n=279)高(n=278)P值年齡(年)0.0720.031 <4676205128153 >=4694182151125性別0.9280.941 男128290209209 女42977069腫瘤分級(jí)0.5810.973 T1+T263153108108 T3+T4107234171170淋巴結(jié)狀態(tài)0.610.681 N047997175 N1-3123288208203復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移0.0060.002 Yes8013512689 No89252153188TNM臨床分期0.550.517 Ⅰ+Ⅱ421057770 Ⅲ+Ⅳ128282202208組織學(xué)類型0.780.027 NKUC121281193209 NKDC44957366

TNM:腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；CD68t:癌巢CD68;CD68s:腫瘤間質(zhì)CD68

3 討 論

早在1889年，Stephen Paget就提出了腫瘤的“種子土壤”學(xué)說，他認(rèn)為腫瘤是“癌細(xì)胞”(種子)在適宜的“腫瘤間質(zhì)”(土壤)中長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果[1]。由癌細(xì)胞和腫瘤間質(zhì)(免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等)共同組成的組織微環(huán)境是腫瘤發(fā)生發(fā)展的主要戰(zhàn)場(chǎng)，其中免疫細(xì)胞是腫瘤間質(zhì)的重要微環(huán)境組分。免疫微環(huán)境作為腫瘤微環(huán)境有機(jī)整體的重要組成部分被視為腫瘤的“第七大標(biāo)記性特征”，其所起作用越發(fā)受到重視[4]。新近研究發(fā)現(xiàn)，免疫微環(huán)境可直接或間接地影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)是近年來腫瘤免疫微環(huán)境研究的熱點(diǎn),在腫瘤組織中廣泛存在,是構(gòu)成腫瘤基質(zhì)細(xì)胞最主要的成分,其顯著的免疫組化標(biāo)記物是CD68。單核/巨噬細(xì)胞作為機(jī)體固有免疫的重要組成細(xì)胞，同時(shí)又是一類主要的抗原呈遞細(xì)胞(APC)，在誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答的過程中起著關(guān)鍵的作用?，F(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，如能夠刺激腫瘤血管生成和增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移[2]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在缺氧的情況下，可通過分泌如VEGF、IL-8和 PGE2等不同血管活性因子以及MMP9等蛋白酶誘導(dǎo)腫瘤血管生成。也有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞也可以與腫瘤細(xì)胞相互作用，通過破壞細(xì)胞外間質(zhì)和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲而進(jìn)入血管[5-8]。而且在很多實(shí)體瘤相關(guān)報(bào)道中，TAM的細(xì)胞數(shù)目與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，例如卵巢癌和肝癌等[9-10]。而在腸癌、胃癌、淋巴瘤和肺癌和黑色素瘤的研究中得出相反的結(jié)果。巨噬細(xì)胞可分泌免疫調(diào)節(jié)因子( 如:干擾素,白介素和TNF-α) 和酶,并將腫瘤抗原呈遞給細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞而發(fā)揮抗腫瘤免疫作用。

本課題組曾在鼻咽癌組織中發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞高密度表達(dá)者的無瘤生存率明顯高于低密度表達(dá)者的無瘤生存率，但其對(duì)鼻咽癌進(jìn)展和預(yù)后的影響僅為初步探討,未針對(duì)腫瘤微環(huán)境進(jìn)行觀察，且當(dāng)時(shí)研究的臨床病例數(shù)較少(60例),隨訪時(shí)間較短(3年),患者預(yù)后需要進(jìn)一步觀察[11]。因此，在本研究中，我們收集了557例鼻咽癌患者5年完整隨訪資料，并對(duì)其組織芯片中癌巢和間質(zhì)不同部位的CD68標(biāo)志物進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CD68+巨噬細(xì)胞在腫瘤間質(zhì)中浸潤(rùn)比癌巢中明顯增多。癌巢中的CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)量與NPC患者的無瘤生存時(shí)間及總體生存時(shí)間顯著正相關(guān)。間質(zhì)中的CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)量與NPC患者的無瘤生存時(shí)間及總體生存時(shí)間亦顯著正相關(guān)。提示CD68+巨噬細(xì)胞在鼻咽癌中可能發(fā)揮抗腫瘤的免疫作用。單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型顯示，癌巢中的CD68+巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量增多的患者發(fā)生治療后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及死亡的風(fēng)險(xiǎn)較低。同樣的，間質(zhì)中的CD68+巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增多的患者發(fā)生轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及死亡的風(fēng)險(xiǎn)降低。由此可見，免疫微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞在癌巢或間質(zhì)中的浸潤(rùn)在鼻咽癌中均傾向于促進(jìn)機(jī)體的免疫應(yīng)答,均抑制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,這為臨床研究鼻咽癌的免疫治療提供了新思路。

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InfluenceofCD68+MacrophagesinDifferentPartsintheTumorMicroenvironmentonProgressionandPrognosisofNasopharyngealCarcinoma

CAI Manbo,SHAO Jianyong,ZENG Yixin,et al

(DepartmentofRadiotherapy,theFirstAffiliatedHospitalofUniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveThis study was to investigate the influence of tumor-associated macrophages on the progression and prognosis of nasopharyngeal carcinoma (NPC).Methods557 nasopharyngeal carcinoma paraffin specimens were collected in cancer center of Sun yat-sen university.Immunohistochemical staining method was used to detect macrophages molecular markers CD68,observe and count CD68 express numbers in nests and stroma,statistics are used to analyze the relationship between the positive cells from different parts with the clinical pathological characteristics and the prognosis of NPC patients.ResultsCD68+macrophage infiltration in the stroma was more active than that in the nests (median:4.47 / HPF:1.87/HPF).Kaplan-Meier survival curve and the log-rank statistical analysis results show that the number of CD68+macrophages in nests had significant positive correlation with disease-free survival time and overall survival of NPC patients.The number of CD68+macrophages in interstitial also had significant positive correlation with disease-free survival time and overall survival of NPC patients.Single factor Cox proportional hazards model shows that the recurrent transfer (HR=0.667,P=0.667) and death (HR=0.626,P=0.626) risk is lower with the more infiltration of CD68+macrophage in the nests than a small number of patients after treatment.More number of CD68+macrophages in the stroma has lower recurrence of transfer (HR=0.664,P=0.664) and death risk (HR=0.66,P=0.66) of patients after treatment in patients than a small number.ConclusionThe number of CD68+macrophages infiltration in the nests and stroma of the immune microenvironment was positively related with the prognosis of NPC patients,and it reduced the risk of local recurrence and distant metastasis.

tumor microenvironment,nasopharyngeal carcinoma; CD68; macrophages

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.03.005

2016-01-21；

2016-04-15

國家高新技術(shù)研究和發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃) (No:2012 AA02A501),國家基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃) (No:2011 CB504805,2011 CB504300)，國自基金(81272960)和省重點(diǎn)項(xiàng)目(2013WK2010).

*通訊作者，E-mail：jhzuoch@sina.com.

R739.6

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秦旭平)