吳浩

基因工程操作的核心是構(gòu)建基因表達(dá)載體，圍繞表達(dá)載體的考題有逐年增多的趨勢(shì)。下面從不同的角度對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行解讀。

一、基因表達(dá)載體的一般結(jié)構(gòu)及各部分的功能

如上圖，基因表達(dá)載體一般由目的基因（插入基因）、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因（抗生素抗性基因）等結(jié)構(gòu)組成。

啟動(dòng)子是復(fù)制原點(diǎn)附近的一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA，位于基因的首端。啟動(dòng)子和特定的物質(zhì)（如激素）作用后，通過一系列復(fù)雜的正反饋機(jī)制，激活復(fù)制原點(diǎn)（復(fù)制原點(diǎn)通常與某些酶結(jié)合）。

終止子位于基因的尾端，也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA。終止子相當(dāng)于一盞紅色信號(hào)燈，使轉(zhuǎn)錄或復(fù)制在所需要的地方停止下來。

復(fù)制原點(diǎn)處的A和T特別多，氫鍵相對(duì)較少，不穩(wěn)定，DNA容易解旋，因此易與引物結(jié)合，成為轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)或復(fù)制的起點(diǎn)。

抗生素抗性基因作為標(biāo)記基因，其作用是鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。標(biāo)記基因又稱報(bào)告基因，抗生素抗性基因是其中的一種。

二、基因表達(dá)載體中啟動(dòng)子、終止子的來源及特點(diǎn)

（1）如果目的基因是從自然界中已有的物種中分離出來的，在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，不需要在質(zhì)粒上目的基因的前后端接上特定的啟動(dòng)子、終止子，因?yàn)槟康幕蛑幸押袉?dòng)子、終止子。（2）如果目的基因是通過人工方法合成的，或通過cDNA文庫獲得的，則目的基因是不含啟動(dòng)子和終止子的。若只將基因的編碼序列導(dǎo)入受體細(xì)胞，目的基因沒有啟動(dòng)子、終止子，是無法轉(zhuǎn)錄或復(fù)制的，因此，在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，在與質(zhì)粒結(jié)合之前，需要在目的基因的前后端接上特定的啟動(dòng)子、終止子。（3）特異性啟動(dòng)子。組織特異性啟動(dòng)子又稱器官特異性啟動(dòng)子。在這類啟動(dòng)子調(diào)控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達(dá)，并表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。如用乳房生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白，使用的便是該類基因。

三、標(biāo)記基因是否為質(zhì)粒結(jié)構(gòu)

作為運(yùn)載體必須具備以下幾個(gè)特點(diǎn)：能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存；具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接；具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。質(zhì)粒是基因工程最常用的運(yùn)載體，它存在于許多細(xì)菌等生物體中，是能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀DNA分子。根據(jù)此分析可知，標(biāo)記基因是質(zhì)粒上固有的。但在實(shí)踐中，由于構(gòu)建載體的目的不同，需要的標(biāo)記基因也會(huì)不同，有的標(biāo)記基因是需要另外加上的，如將綠色熒光蛋白基因與目的基因做成融合基因，根據(jù)熒光蛋白的特性來確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位。

四、載體上標(biāo)記基因的標(biāo)記原理

載體上的標(biāo)記基因一般是一些抗生素抗性基因。目的基因要轉(zhuǎn)入的受體細(xì)胞沒有抵抗相關(guān)抗生素的能力。當(dāng)含有抗生素抗性基因的載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，使受體細(xì)胞能夠抵抗相應(yīng)抗生素，所以在受體細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入該種抗生素就可以只保留轉(zhuǎn)入載體的受體細(xì)胞，原理如上圖所示。