杜秋麗

（濟南大學泉城學院，山東 煙臺 265600）

冬小麥黃矮病毒的分子生物學鑒定試驗研究

杜秋麗

（濟南大學泉城學院，山東 煙臺 265600）

本研究以檢測冬小麥黃矮病毒（BYDV-PAV）的分子生物學特征為目的。首先，通過電擊法將3種質(zhì)粒（UV1304、UV1306、UV1304rtd）轉(zhuǎn)化土壤農(nóng)桿菌（EHA105、4404，GV3101等）。然后，通過機械損傷使含有上述質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染小麥（西農(nóng)749、小偃6號、張氏3個品種），并將侵染后的小麥放在室外進行處理，至表現(xiàn)出感染病毒的癥狀時提取病毒RNA并進行檢測。經(jīng)過一段時間的處理后，只有西農(nóng)749表現(xiàn)出癥狀，RNA電泳也顯示出提取物中存在RNA，但是經(jīng)過RT-PCR反轉(zhuǎn)錄然后再PCR擴增cDNA后進行電泳出現(xiàn)負結(jié)果。3種質(zhì)粒的cDNA電泳結(jié)果出現(xiàn)相似現(xiàn)象：以CP5′＋MPR1為引物得到的cDNA電泳均無條帶；其他引物得到的cDNA電泳均顯示相似的條帶，而且因引物不同條帶位置也不同。

冬小麥黃矮病毒（BYDV-PAV）；土壤農(nóng)桿菌（GV3101）；反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）；聚合酶鏈式反應（PCR）

1 研究背景和意義

1.1 研究背景

大麥黃矮病毒(Barley Yellow Dwarf Viruses)，在全世界均有分布，其寄主廣泛，可侵染150多種單子葉植物，特別是大麥、小麥、燕麥、水稻等多種禾谷類作物。每年在全球范圍內(nèi)，此類病毒對糧食生產(chǎn)會造成一定程度的危害，大發(fā)生時會導致嚴重減產(chǎn)。這類病毒除了在經(jīng)濟上的重要性外，它們的基因表達機制、進化與傳播介體和寄主的作用機制，幾十年來一直吸引著人們的研究興趣[1～4]。

1.2 研究意義

小麥黃矮病是我國北方麥區(qū)的主要病毒病，由大麥黃矮病毒 (Barley Yellow Dwarf Virus，簡稱BYDV)引起。該病的流行難以預測，發(fā)病后又不可治愈，被稱為“小麥癌癥”，一般年份減產(chǎn)5%～10%，流行年份減產(chǎn)30%以上，歷史上因小麥黃矮病毒感染而導致巨大經(jīng)濟損失的實例普遍存在。本試驗通過農(nóng)桿菌介導法侵染冬小麥研究大麥黃矮病毒（BYDV-PAV）的分子生物學特性，并且研究BYDV-PAV在冬小麥中的表達情況，為培育抗病毒冬小麥提供條件。

2 試驗材料與方法

2.1 材料與器材

2.1.1 材料

小麥黃矮病毒（PAV）毒源（國外友人提供）；反轉(zhuǎn)錄酶；TaqDNA聚合酶和連接酶；PCR反應的引物；LB培養(yǎng)基；大腸桿菌DH5α；小麥品種：小偃、西農(nóng)749、張氏；土壤農(nóng)桿菌（EHA105、4404，GV3101等）；3種質(zhì)粒（UV1306、UV1304、UV1304rtd）由本實驗室測序正確并保存；RT-PCR試劑盒；cDNA電泳所需要的瓊脂膠。

2.1.2 器材

恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、離心機、電轉(zhuǎn)儀PCR儀、移液槍、微波爐、電泳儀、研缽和冰箱等。

2.1.3 LB培養(yǎng)基的配方

LB培養(yǎng)基的配方為蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、NaCl 10 g/L。待完全溶解后用5 mol/L的NaCl溶液調(diào)節(jié)pH值到7.0，加水定容至1 L，1.034 Pa高壓蒸汽滅菌20 min。配制固體培養(yǎng)基時，每200 mLLB中加入3～4 g瓊脂。

2.1.4 土壤農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備

①將所選用的農(nóng)桿菌菌株（EHA105、4404，GV3101等)從活化的平板上挑取單菌落，接種到加有3～5 mL LB培養(yǎng)基的試管中搖過夜培養(yǎng)。②按1%比例接種擴大培養(yǎng)。③5 000 rpm，5 min。收集菌體，用ddH2O洗6遍。④加入培養(yǎng)物體積0.003倍的10%甘油，分裝。⑤電轉(zhuǎn)化時取60 uL加小于2 uL的DNA質(zhì)粒，進行電轉(zhuǎn)。

2.1.5 RT-PCR體系

H2O：3.75 uL；10×Rtbuffer：1 uL；dNTPs：1 uL；Mg-Cl2：2uL；1﹟RNA反轉(zhuǎn)錄酶：0.5uL；2﹟RNAinhibitor：0.25uL；引物：0.5 uL；RNA：1 uL。

2.1.6 PCR體系

H2O：14uL；10×Buffer：2uL；Primer：1uL；Taq酶：1uL；dNTP：1 uL；模板：1 uL。

2.2 方法與步驟

2.2.1 質(zhì)粒DNA的提取

①將含有2 mL含卡納霉素的LB液體培養(yǎng)基加入到試管中，分別接入上述的含3種質(zhì)粒的大腸桿菌，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。②將培養(yǎng)物導入1.5 mL的離心管中，12 000 r/min離心30 s。③吸取培養(yǎng)液，使細胞沉淀盡可能干燥。④漿細胞沉淀懸浮于200 μL溶液I中，用渦旋振蕩器充分旋起沉淀，室溫放置5 min。⑤加300 μL溶液I（I新鮮配制），蓋緊管皿，輕輕滾動，上下顛倒，使溶液I與溶液II充分混勻，冰上放置5 min。⑥加入300 μL溶液III（冰上預冷），蓋緊管口，輕輕顛倒數(shù)次，混勻，冰上放置10 min。⑦加入250 μL氯仿，輕輕顛倒數(shù)次，使蓋上的蛋白質(zhì)沉淀。⑧12 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清（約600 μL）至新的離心管。⑨向上清中加入等體積的氯仿，反復混勻，12 000 r/min離心5 min，溶液分層，輕輕從離心機中取出。⑩小心吸取400 μL上清至新的離心管。向上清中加入2倍體積的無水乙醇，沉淀DNA后，進行混勻，室溫放置5～10 min。12 000 r/min離心5 min，棄上清，用吸水紙吸干管口。1 mL70%乙醇洗質(zhì)粒2次，輕輕彈起沉淀，離心，棄上清，空甩，風干5 min。

2.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化土壤農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞

①取3個1 mL離心管，每管裝入80 μL感受態(tài)細胞以及2 μL質(zhì)粒。②將質(zhì)粒和感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)移到電擊杯中。將電擊杯插入電轉(zhuǎn)儀內(nèi)，按下pulse鍵，幾秒后電轉(zhuǎn)儀指示燈發(fā)生變化時提出電擊杯。③將900 μL培養(yǎng)基吸入電擊杯內(nèi)，移液槍打洗混勻。④將電擊杯內(nèi)液體吸凈，轉(zhuǎn)入原來的管內(nèi)。

2.2.3 轉(zhuǎn)化后菌體培養(yǎng)

①將轉(zhuǎn)化完的菌液放入恒溫箱中，28℃培養(yǎng)1 h。②配制培養(yǎng)基，倒平板（20 mL培養(yǎng)基中加入50 μL利福平和20 μL卡那霉素）。③涂平板，并將涂好的平板放入27℃培養(yǎng)48 h。④挑菌（每塊板上挑取兩個克?。┓湃胧⒂? mL培養(yǎng)液（每20 μL培養(yǎng)液含50 μL利福平和8～9 μL卡那霉素）的試管中。⑤搖菌：27℃震蕩培養(yǎng)20～24 h。⑥再次擴大培養(yǎng)：取6支裝有20 mL的三角瓶，并標名（每瓶加50μL利福平、20μL四環(huán)素、20μL卡那霉素）分別加入400～600 uL菌液。⑦對應每支試管取兩支離心管。一支加入10%甘油150 μL加300 μL菌液，放入-80℃保菌；另一支加入菌液，4℃短期保菌。⑧試管中剩余的菌液，在三角瓶中擴大培養(yǎng)搖菌48h。⑨將菌液倒入大離心管中5 000 r/min，5 min棄去上清，加入10 mL小麥轉(zhuǎn)化液懸浮。⑩用人工損傷小麥，接種農(nóng)桿菌，對照組用小麥轉(zhuǎn)化液處理，處理后將小麥放入室外。

2.2.4 RNA提取

①取黃花葉片4～5片，剪碎，立即液氮研磨成粉末狀。②將粉末盡快轉(zhuǎn)入細胞裂解液中并劇烈震蕩至組織分散，室溫下放置5 min。③加入0.2 mL氯仿充分震蕩，室溫下放置2～3 min。4℃，12 000 r/min，離心15 min。④冰浴上取上清液250 μL于離心管中，并加入250 μL異丙醇，靜置10min，4℃，12000r/min，離心10min。⑤棄去上清，沉淀用DEPC水配制的70%～75%乙醇洗2次。⑥用30 uLDEPC滅菌水溶解，放在-80℃保存。

2.2.5 RNA電泳檢測(瓊脂糖凝膠電泳)

具體操作步驟略。

2.2.6 RT-PCR

用實驗室已購買好的試劑盒加入模板進行反應。

2.2.7 cDNA進行PCR

CP5′＋MPR1為引物，應該得到500 bp；CP5′＋PAV3R為引物，應該得到603 bp；PAV3F＋dMPR1為引物，應該得到100 bp；ORF6＋PAV3R為引物，應該得到391 bp（陰性對照只加入水，陽性對照分別加入冰箱內(nèi)保存的1304、1306、1304 rtd質(zhì)粒）。

2.2.8 cDNA進行電泳檢測（瓊脂糖凝膠電泳）

3 結(jié)果與分析

3.1 試驗結(jié)果

3.1.1 小麥出現(xiàn)的癥狀

西農(nóng)749表現(xiàn)出病毒感染的癥狀，張氏和小偃6號這兩個品種表現(xiàn)出被病毒侵染的癥狀。

3.1.2 RNA電泳結(jié)果

提取的RNA每一大管分為兩小管，進行電泳，結(jié)果如表1所示。

表1 RNA電泳結(jié)果表

3.1.3 反轉(zhuǎn)錄后進行電泳的結(jié)果

①以dMP1和PAV3R為引物進行反轉(zhuǎn)錄PCR，反轉(zhuǎn)錄成的cDNA經(jīng)過PCR擴增，并將擴增產(chǎn)物進行電泳，沒有出現(xiàn)條帶。②以CP5′和PAV3R為引物進行反轉(zhuǎn)錄PCR，反轉(zhuǎn)錄成的cDNA經(jīng)過PCR擴增，并將擴增產(chǎn)物進行電泳，3種質(zhì)粒均出現(xiàn)大小稍微大于500 bp的條帶。③以dMP1和PAV3F為引物進行反轉(zhuǎn)錄PCR，反轉(zhuǎn)錄成的cDNA經(jīng)過PCR擴增，并將擴增產(chǎn)物進行電泳，3種質(zhì)粒均出現(xiàn)大小為200 bp左右的條帶。④以dMP1和PAV3R為引物進行反轉(zhuǎn)錄PCR，反轉(zhuǎn)錄成的cDNA經(jīng)過PCR擴增，并將擴增產(chǎn)物進行電泳，3種質(zhì)粒均出現(xiàn)大小600 bp左右的條帶。

3.2 結(jié)果分析

由于試驗具有隨機性，又重復做了幾次，反轉(zhuǎn)錄后進行PCR擴增后再電泳但都是出現(xiàn)類似結(jié)果，不能確定病毒的存在，無法對其進行分子生物學鑒定，所以試驗得到的是負結(jié)果。

推測出現(xiàn)這種結(jié)果導致試驗沒有得出正結(jié)果的原因可能有以下幾種：第一，試驗過程中某些操作沒嚴格執(zhí)行，影響了結(jié)果；第二，反轉(zhuǎn)錄步驟出現(xiàn)了問題，只是轉(zhuǎn)錄了其中的一部分片段而且這一個片段的大小大于500 bp；第三，提取出的RNA為小麥RNA，并沒有BYDV-PAV病毒的RNA，用農(nóng)桿菌介導侵染小麥后病毒基因并沒有得到復制和表達，而表現(xiàn)的癥狀是其他病毒引起的；第四，試驗進行時外界環(huán)境不合適。

[1]晉治波.黃矮病毒GAV基因組全序列分析及運動蛋白介導的抗病毒小麥的研究[D].中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所,2003.

[2]廣和.世界大麥黃矮病研究概況[J].世界農(nóng)業(yè),1989,(7):38 241.

[3]吳云峰,李毅,魏寧生,等.大麥黃矮病毒的循回傳播機理[J].西北農(nóng)業(yè)大學學報,1997,25(6).

[4]常勝軍,王錫鋒,馬占鴻,等.大麥黃矮病毒GAV株系外殼蛋白基因的克隆和序列分析[J].病毒學報,1999,15(4):1 000.

1005-2690（2016）08-0113-02

：S512.11；S435.12

：B

2016-07-12）