向 梟 周興華 曾本和 羅 莉 文 華

蛋氨酸水平對羅非魚蛋白質代謝及血清生化指標的影響

向 梟1周興華1曾本和1羅 莉2文 華3

（西南大學榮昌校區(qū)水產系；淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室；水產科學重慶市市級重點實驗室1，重慶 402460）
（西南大學動物科技學院2，重慶 400715）
（中國水產科學院長江水產研究所；中國水產科學院淡水生態(tài)與健康養(yǎng)殖重點開放實驗室3，荊州 434000）

為了探討不同蛋氨酸水平對羅非魚生長過程中蛋白質代謝及血液生化指標的影響。通過在半精制基礎飼料中添加包膜DL-蛋氨酸，配制成蛋氨酸水平分別為0.26%、0.55%、0.85%、1.14%、1.44%和1.73%的6 種等氮等能（32.09%粗蛋白質，17.82 kJ／g總能）的試驗飼料。以初始體質量（66.76 ±2.29）g的羅非魚為試驗對象，每種試驗飼料設3個重復，每個重復放養(yǎng)試驗魚25尾，養(yǎng)殖系統(tǒng)為室內養(yǎng)殖系統(tǒng)，每天表觀飽食投喂3次，養(yǎng)殖時間為60 d。結果表明，隨飼料蛋氨酸水平的增大，羅非魚的增重率（WGR）、飼料蛋白沉積率（PDR）及脂肪沉積率（LDR）均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。且WGR和LDR均在蛋氨酸水平為1.14%時達到最大（分別為361.91%和107.54%）；PDR則在飼料蛋氨酸水平為1.44%時達到最大（47.22%）。隨著飼料中蛋氨酸水平的提高，羅非魚肝臟中的肝臟中谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）活性及AST／ALT比值均呈先升后降的變化趨勢。當?shù)鞍彼崽砑铀綖?.14%時，羅非魚肝臟中AST、ALT、AST／ALT均達到最高（分別為165.33 U／mg、48.38 U／mg和3.43）；肝臟中谷氨酸脫氫酶（GDH）活性及血氨水平均隨著飼料中蛋氨酸水平的提高呈先降后升的變化趨勢，且當?shù)鞍彼崽砑铀綖?.14%時均達到最低（分別為103.97 U／mg和564.72 μmol／L）（P ＜0.05）。隨飼料蛋氨酸水平的增加，羅非魚血清中膽固醇（CHO）、甘油三酷（TG）均隨飼料蛋氨酸水平的升高而呈先升高后穩(wěn)定的變化趨勢。說明適宜的蛋氨酸水平有利于促進機體的蛋白質和脂質代謝，提高羅非魚的生長速度。

羅非魚 蛋氨酸 蛋白質代謝 生化指標

蛋氨酸是動物都需要的一種必需氨基酸。與動物谷胱甘肽等含硫化合物的代謝有密切的關系。在魚類的生長發(fā)育過程中，蛋氨酸可直接參與蛋白質合成，也可轉化成半胱氨酸用于合成魚體蛋白質，同時蛋氨酸是重要的甲基供體，能為肌酸、膽堿等的合成提供甲基。陳乃松等［1］研究表明，飼料中蛋氨酸水平為1.23%（占飼料蛋白質的2.77%）時，大口黑鱸（Micropterus salmoides）的蛋白沉積率最大。Yan等［2］認為，飼料蛋氨酸水平能顯著影響許氏平鲉（Sebastes schlegeli）的蛋白質沉積率；飼料中補充DL-蛋氨酸會顯著提高異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）幼魚的特定生長率和蛋白質沉積率［3］。蛋氨酸在魚體內可合成胱氨酸，防止大西洋鮭（Salmo salar L.）脂肪肝等疾病的產生，增加其對脂肪的消化率利用率［4］。杜瀅［5］用缺乏蛋氨酸等必需氨基酸的飼料處理小鼠7 d后發(fā)現(xiàn)能不同程度地減少其脂肪含量；蛋氨酸［6］和MHA［7］對幼建鯉（Cyprinus carpio Var.Jian）的體蛋白和脂肪沉積率均有極顯著或顯著的影響。且蛋氨酸是豆粕等魚類常用植物蛋白質源的第一限制性氨基酸，則其缺乏或添加不足將引起飼料氨基酸不平衡，使飼料可利用率下降，影響蛋白質和脂肪代謝。因此，在飼料中補充適量的蛋氨酸能促進動物生長，增加動物肌肉組織中蛋白質的沉積。本研究以吉富羅非魚（Genetic Improvement of Farmed Tilapia，Oreochromis niloticus）為研究對象，探討蛋氨酸水平對吉富羅非魚生長過程中蛋白質代謝及血清生化指標的影響，旨在為設計吉富羅非魚養(yǎng)殖中所需的高效、環(huán)保的飼料配方提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 飼料

以明膠、魚粉、花生粕、包膜氨基酸混合物（包被材料為卡拉膠、羥甲纖維素鈉、α-淀粉作為包膜材料，比例為1∶1∶1）為主要蛋白源，豆油為脂肪源。氨基酸的包膜參照王冠［8］的方法。模擬與羅非魚全魚相似的氨基酸組成，除蛋氨酸和甘氨酸（平衡氮）的水平不同外，其余的必需和非必需氨基酸按照羅非魚全魚氨基酸組成模式。配制成低蛋氨酸的基礎飼料（見表1），并設定為對照組。在基礎飼料中分別添加0%、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%和1.5%的包膜DL-蛋氨酸，同時用包膜L-甘氨酸節(jié)飼料中L-甘氨酸的含量，以0.3%的水平遞減，調節(jié)飼料中氮的水平。設計6種等氮（粗蛋白含量為32.09% ）等能（總能為17.82 kJ／g）的實驗飼料。各原料均粉碎過80目篩，稱重后混勻，量少的組分采用逐級擴大法混合，用實驗室小型絞肉機制成直徑為2 mm的硬顆粒料，自然晾干后于-20℃保存。經測定6種試驗飼料中蛋氨酸的質量分數(shù)分別為0.26%、0.55%、0.85%、1.14%、1.44%和1.73%，占飼料蛋白質的質量分數(shù)分別為0.81%、1.71%、2.65%、3.55%、4.49% 和5.39%。飼料的氨基酸組成見表2。

表1 基礎飼料配方及主要營養(yǎng)成分（風干基礎）

1.2 魚及飼養(yǎng)管理

羅非魚購自重慶白市驛漁場，體重（66.76±2.29）g。購回后先用5%的食鹽水消毒后放入暫養(yǎng)池，用商品飼料暫養(yǎng)7 d。試驗開始前，對暫養(yǎng)魚進行24 h饑餓處理，選擇健康、無傷病的羅非魚450尾，隨機投入18個試驗水泥池（150 cm×100 cm×50 cm）中。并隨機分成6組，每組3個重復，每個重復25尾魚，分別投喂6種不同蛋氨酸水平的飼料。每天按魚體重的3%～5%投喂飼料（根據(jù)魚的攝食情況及水溫等環(huán)境狀況及時調整投喂率），每天8：00、13：00、16：00各投飼1 次，投喂前虹吸清污，飽食后30 min迅速虹吸殘餌并風干測定其質量。養(yǎng)殖期間每天換水1次，每次換水量為養(yǎng)殖水體的1／3。試驗用水為曝氣后的自來水，每日監(jiān)測水溫、水質、試驗魚的攝食行為和死亡數(shù)量等。水溫維持在28～30 ℃，溶氧高于6.0 mg／L，pH 為7.0 ～7.5，養(yǎng)殖時間60 d。

表2 基礎飼料中氨基酸組成分析／%干物質

1.3 樣品采集

試驗開始和結束前1天停食24 h，對每尾魚進行體質量及體長測量。每個重復組中隨機各取3尾實驗魚，于-80℃下保存，用于魚體粗蛋白、粗脂肪分析。試驗結束后，每個試驗組中隨機取5尾魚用50 mg／L的MS-222溶液麻醉，測定體質量和體長后，用1 mL注射器于尾靜脈取血，并用離心機（4℃，3 500 r／min）離心15 min，制備血清，用于測定血清生化指標；再在冰盤上解剖并分離出肝臟，用4℃預冷的生理鹽水沖洗，然后用濾紙吸干，精度稱量肝臟團的質量。加入相當于其重20倍的生理鹽水，迅速用冰凍玻璃勻漿器勻漿后用離心機（4℃，3 500 r／min）離心20 min，取上清液作為粗酶提取液，測定肝臟代謝指標。

1.4 指標測定

1.4.1 生長指標的測定

根據(jù)測定的數(shù)據(jù)計算魚的增重率（weight gain rate，WGR）、蛋白質沉積率（Protein deposition rate，PDR）、脂肪沉積率（Lipid deposition rate，LDR），計算公式：

式中：W0為魚初始體質量／g；Wt為魚終末體質量／g；P0為魚初始體蛋白質含量／%；Pt為魚終末體蛋白質含量／%；P為飼料中粗蛋白質含量／%；L0為魚初始體脂肪含量／%；Lt為魚終末體脂肪含量／%；L為飼料中粗脂肪含量／%；F為飼料攝入總質量／g。

1.4.2 飼料及魚體營養(yǎng)成分的測定

飼料水分、粗蛋白、粗脂肪、灰分和總能級試驗魚粗蛋白的測定參照AOAC的方法［11］。水分采用105℃干燥恒重法；粗蛋白質采用凱氏定氮法；粗脂肪采用索氏提取法；灰分采用馬福爐550℃灼燒法；飼料能量采用氧彈熱量計（WGR-1，中國）測定。

1.4.3 蛋白質及脂肪代謝指標的測定

肝臟中谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷氨酸脫氫酶（GDH）、血氨、甘油三酷（TG）、膽固醇（CHO）、均采用南京建成生物工程研究所相應試劑盒測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)以平均值±標準差（Means±SD）表示，采用SPSSStatistics 19.0統(tǒng)計軟件中one-way ANOVA進行方差分析，若組間差異顯著，再用Duncan′s進行多重比較，差異顯著水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 蛋氨酸水平對羅非魚蛋白質和脂肪沉積率的影響

由表3可知，飼料蛋氨酸水平能顯著影響羅非魚的增重率、蛋白質沉積率及脂肪沉積率。隨飼料蛋氨酸水平的升高，羅非魚的增重率（WGR）、蛋白質沉積率（PDR）和脂肪沉積率（LDR）均呈先升后降的變化趨勢。在飼料蛋氨酸水平為1.14%時，羅非魚的WGR及LDR均達到最大。WGR在飼料蛋氨酸水平為0.85%～1.44%時差異不顯著（P ＞0.05）；LDR在飼料蛋氨酸水平為1.14%～1.44%時差異不顯著外（P＞0.05），與其余各試驗組差異顯著（P＜0.05）；PDR在飼料蛋氨酸水平為1.44% 時達到最大。除0.85%～1.44%蛋氨酸組差異不顯著外（P＞0.05），與其余各試驗組差異顯著（P ＜0.05）。

表3 蛋氨酸水平對羅非魚蛋白質和脂肪沉積率的影響（n＝3）

2.2 蛋氨酸水平對羅非魚蛋白質代謝酶的影響

由表4可知，隨著飼料中蛋氨酸水平的提高，羅非魚肝臟中的肝臟中谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）活性及AST／ALT比值均呈先升后降的變化趨勢。當?shù)鞍彼崽砑铀綖?.14%時，魚肝臟中AST、ALT、AST／ALT 均達到最高。AST、ALT、AST／ALT 除與0.85%蛋氨酸組差異不顯著外（P＞0.05），與其余各試驗組均有顯著差異（P＜0.05）；谷氨酸脫氫酶（GDH）活性則隨著飼料中蛋氨酸水平的提高呈先降后升的變化趨勢，且當?shù)鞍彼崽砑铀綖?.14%時達到最低，與其余各試驗組差異顯著（P＜0.05），而0.85%蛋氨酸組與1.44%～1.73%蛋氨酸組的差異不顯著（P ＞0.05）。

表4 蛋氨酸水平對羅非魚肝臟蛋白質代謝的影響（n＝3）

2.3 蛋氨酸水平對羅非魚血液生化指標的影響

由表5可知，羅非魚血氨水平則隨飼料蛋氨酸水平的升高而呈先降后升的變化趨勢。1.14%蛋氨酸組血氨含量最低，除與0.85%蛋氨酸組差異不顯著外（P＞0.05），與其余各試驗組差異顯著（P＜0.05）；膽固醇（CHO）、甘油三酷（TG）均隨飼料蛋氨酸水平的升高而呈先升高后穩(wěn)定的變化趨勢。蛋氨酸水平小于1.14%時，CHO和TG隨著蛋氨酸水平的增加而增加（P＜0.05），而當?shù)鞍彼崴酱笥诘扔?.14%時，蛋氨酸水平對羅非魚CHO和TG無顯著影響（P ＞0.05）。

表5 蛋氨酸水平對羅非魚血液生化指標的影響（n＝3）

3 討論

蛋氨酸是水產動物所需的一種含硫必需氨基酸，與動物體內各種含硫化合物的代謝有密切的關系。當?shù)鞍彼岷坎蛔銜r將導致飼料中氨基酸的不平衡，降低飼料利用效率［9］。在以植物蛋白為主的實用飼料中添加適量的結晶D-蛋氨酸能顯著改善奧尼羅非魚（Oreochromis niloticus ×O．aureus）的蛋白沉積率［10］；添加DL-蛋氨酸可顯著提高異育銀鯽幼魚的蛋白質沉積率［3］；且其蛋白質貯積率隨飼料蛋氨酸含量增加而增加，而達到最適需求量之后則呈下降趨勢［11］；Zhou 等［12］研究證明，蛋氨酸能顯著影響黑鯛（Sparus macrocephalus）的生長速度和體蛋白沉積率；對大西洋鮭、鯉（Cyprinus carpio）的研究均表明，飼料中蛋氨酸缺乏將顯著降低魚類蛋白質和脂肪的沉積量［13-14］。本試驗中飼料蛋氨酸水平對羅非魚的蛋白質沉積率（PDR）及脂肪沉積率（LDR）有顯著的影響。隨飼料蛋氨酸水平的升高，羅非魚的PDR和LDR均呈先升后降的變化趨勢，且PDR在飼料蛋氨酸水平為1.44%時達到最大；LDR在飼料蛋氨酸水平為1.14%時達到最大，與向梟等［15］報道的蛋氨酸水平對羅非魚生長速度和飼料系數(shù)影響的結論相一致。這說明飼料中各種氨基酸平衡時，動物體內各種物質的合成代謝大于分解代謝，蛋白質和脂肪的沉積率最高；當?shù)鞍彼崛狈虿蛔銜r，飼料中的氨基酸模式失衡，限制了魚類對其他氨基酸的利用，加強了多余氨基酸的脫氨基作用，導致體蛋白合成的受限［16］。蛋氨酸是蛋白質合成中核糖體在mRNA起始位置結合的第1個氨基酸。當?shù)鞍彼崛狈r，單位RNA所合成的蛋白質減少［17］，使魚體合成蛋白質的兩減少；蛋氨酸添加過量則導致蛋氨酸的氧化，使有毒的代謝物質積聚［18］，從而抑制魚體蛋白質的沉積。但解緩啟［19］認為，蛋氨酸水平對長吻鮠（Leiocassis longirostris）的蛋白質貯積率無顯著影響，Rodehustocrd 等［20］發(fā)現(xiàn)，虹鱒（Oncorhynchus mykiss）的蛋白質貯積率隨蛋氨酸水平的增加呈先增加后逐漸趨于穩(wěn)定的變化趨勢，與本研究結論有一定的差異這可能與魚的種類、生長階段、飼料有效成分等有關。

谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）是人和動物體內重要的氨基酸代謝酶［21］，在肝臟中負責特定氨基酸的氨基轉移，肝臟中AST、ALT的活性能較好地反應動物體內蛋白質和氨基酸的代謝狀況。AST、ALT活性升高，尤其是AST／ALT比值的升高表明氨基酸代謝旺盛，蛋白質分解下降而合成加強，有利于氮在體內的蓄積［22］。本試驗中，羅非魚肝臟中的肝臟中AST、ALT活性及AST／ALT比值均隨著飼料中蛋氨酸水平的提高呈先升后降的變化趨勢，且均在蛋氨酸添加水平為1.14%時達到峰值。說明添加適量的蛋氨酸能促進了羅非魚體內的氨基酸代謝和蛋白質合成。遲淑艷等［23］研究表明，添加蛋氨酸能顯著提高軍曹魚（Rachycentron canadum）AST、ALT活性及AST／ALT比值；顯著提高了中期草魚（Ctenopharyngodon idellus）肝胰臟中AST、ALT活性，且當?shù)鞍彼崴椒謩e達7.18 g／kg 和12.21 g／kg 時，草魚肝胰臟中AST 和ALT 活性達到最大［24］，柯帥［6］也認為幼建鯉肝臟中AST的活性隨蛋氨酸水平的提高呈先升后降的變化趨勢，與本研究結果相一致。說明添加一定量的蛋氨酸可促進動物對蛋白質的周轉代謝，當氨基酸趨于平衡后，合成代謝高于分解代謝，有利于蛋白質在體內的沉積。

動物代謝過程中，很多氨基酸都是轉化為谷氨酸來參與代謝的。因此谷氨酸脫氫酶（GDH）是蛋白質分解代謝和非必需氨基酸合成的關鍵酶，其活性的高低一定程度上反映了動物體內蛋白質分解代謝的情況［25］。本試驗中，羅非魚肝臟中GDH活性隨飼料中蛋氨酸水平的提高呈先降后升的變化趨勢。尚曉迪等［26］研究表明，草魚肝臟中GDH活性與飼料中異亮氨酸的水平呈先降后升的二次回歸曲線關系。飼料中蛋氨酸缺乏或過量時，肝臟對氨基酸的分解代謝作用加強，肌肉中的蛋白質合成降低，而當飼料氨基酸趨于平衡時，通過抑制GDH活性而使氨基酸合成體蛋白質的能力增強，肝臟分解氨基酸的速度減慢；氨是水產動物氨基酸分解代謝的主要產物。肝臟代謝過程中所產生的氨將在血液中逐漸累積，最后排出體外。則血氨的濃度與飼料氨基酸的含量有密切的關系［27］。本試驗中，羅非魚血氨水平隨飼料蛋氨酸水平的升高而呈先降后升的變化趨勢。其原因可能為，當飼料中蛋氨酸水平不足或過量時，飼料氨基酸不平衡而引起氨基酸分解代謝加強，體蛋白質的沉積減少，血氨濃度上升。一定范圍內，隨著蛋氨酸添加量的增強，飼料氨基酸組成逐漸趨于平衡，則氨基酸合成代謝加強而分解代謝減弱，血氨濃度下降。肖偉偉認為，血氨濃度與肝胰臟AST、ALT活性呈極顯著或顯著負相關，適宜水平的MHA可顯著降低幼建鯉的血氨含量。與本研究結論相一致。

甘油三酯和膽固醇與機體脂肪代謝狀況有關［28］。本試驗中，羅非魚血清膽固醇（CHO）、甘油三酷（TG）含量均隨蛋氨酸水平的升高而呈先升高后穩(wěn)定的變化趨勢。隨著蛋氨酸水平的提高，卵形鯧鲹（Trachinotus Ovatus）血清CHO、TG含量顯著提高［29］。飼料蛋氨酸水平為0.64%～1.15% 時，胭脂魚（Myxocyprinus asiaticus）血清CHO、TG含量先隨蛋氨酸水平的提高而顯著增加，而后則隨氨酸水平的繼續(xù)增加而趨于穩(wěn)定［30］。與本試驗的結論相一致。含硫氨基酸對人和動物血清脂質含量有明顯的影響［31］，Susgiyama 等［32］在麥谷蛋白的氨基酸混合物中增加蛋氨酸的含量而除去除胱氨酸，可使大鼠血清中CHO、TG的濃度升高；Oda等［33］研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠飼料中添加蛋氨酸能使其肝微粒體中膽固醇合成的關鍵酶3-羥基-3-甲基戊二酞輔酶A還原酶的活性增加。說明蛋氨酸在動物脂質代謝中有重要作用。當?shù)鞍彼崽砑恿吭龃蠛?，造成氨基酸組成的不平衡，使被氧化的氨基酸量增加，大量的氨基酸脫氨后進入三羧酸循環(huán)被氧化而供能，減少了蛋白質的沉積，而轉化成糖和脂肪［34］，增大了血清中CHO、TG的濃度。

4 結論

本試驗條件下，飼料蛋氨酸水平對羅非魚蛋白質沉積和代謝，血清中CHO、TG均有顯著影響，說明蛋氨酸能有效地改善羅非魚對飼料蛋白質和脂質的代謝能力，因此，飼料中添加適量的蛋氨酸可增強羅非魚的代謝能力，提高其生長速度。

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Effects of Methionine Levels on Protein Metabolism and Serum Biochemical Indices of Tilapia

Xiang Xiao1Zhou Xinghua1Zeng Benhe1Luo Li2Wen Hua3
（Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development，Ministry of Education，Key Laboratory of Aqucatic Science of Chongqing，Department of Fisheries in Rongchang Compust，Southwest University1，Chongqing 402460）
（Department of Fishery Science，Collage of Animal and Technology of Southwest University2，Chongqing 400715）
（Key Laboratory of Freshwater Ecology and Aquaculture，Yangtze River Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences3，Jingzhou 434000）

In order to discuss the effects of different methionine levels on protein metabolism and blood biochemical indices of tilapia in the process of growth，six kines of experience feeds with （32.09%crude protein）and isoenergetic （17.82 kJ／g gross energy）semipurified diets were formulated with the graded methionine levels （0%，0.3%，0.6%，0.9%，1.2%and 1.5%dry diet，respectively），using gelatin，fishmeal，peanut meal and crystalline amino acids mixtures as the main dietary protein sources.Amino acid pattern in diet was to simulate the amino acid pattern found in the whole body protein of Oreochromis niloticus except for methionine.The six trial diets were determined to contain methionine of 0.26%，0.55%，0.85%，1.14%，1.44%and 1.73%dry diet，respectively.Each diet was randomly assigned to triplicate groups of 25 fish and fed to apparent satiation by hand thrice daily

（8：00，13：00 and 16：00）for 60 days.The results showed that the weight gain rate（WGR），protein deposition rate（PDR）and Lipid deposition rate（LDR）all initially increased with increasing dietary methionine levels but then decreased.The WGR，LDR were all highest（361.91%and 107.54%respectively）when the dietary methionine level was 1.14% （P ＜0.05），the PDR was the highest（47.22%）（P ＜0.05）when the dietary methionine level was 1.44% （P ＜0.05）.The AST and ALT activities，AST／ALT in liver all initially increased with increasing dietary methionine levels but then decreased.The AST and ALT activities，AST／ALT were all highest（165.33 U／mg、48.38 U／mg and 3.43 respectively）when the dietary methionine level was 1.14% ，at the same time，the GDH activities in liver and the serum ammonia concentration all first decreased with increasing dietary methionine levels but then increased，the GDH activities and serum ammonia concentration were all the lowest（103.97 U／mg and 564.72 μmol／L respectively）when the dietary methionine level was1.14%.The cholesterol（CHO）and triglyceride（TG）in serum first increased with increasing dietary methionine levels and then leveled off.Results of above show that the optimum dietary methionine level could promote the protein and lipid metabolism，enhance the growth of Oreochromis niloticus．

Oreochromis niloticus，methionine，protein metabolism，biochemical indices

S963.3

A

1003-0174（2016）11-0092-08

重慶市基礎與前沿研究計劃（cstc2013jcyjA 80033），國家羅非魚現(xiàn)代產業(yè)技術體系建設（CARS-49），農業(yè)部公益性行業(yè)科研專項（2010 03020）

2015-04-02

向梟，男，1973年出生，副教授，水產動物營養(yǎng)與飼料