唐培安 吳海晶 薛 昊 孔德英 宋 偉

印度谷螟18SrDNA的克隆及定量PCR方法的建立

唐培安1吳海晶1薛 昊1孔德英2宋 偉1

（南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心1，南京 210023）
（重慶出入境檢驗檢疫局2，重慶 400020）

利用分子生物學(xué)方法從印度谷螟幼蟲體內(nèi)克隆獲得了18S rDNA的基因全長序列（1 888 bp，GenBank登錄號為KJ836335）。利用鄰位連接法（neighbor-joining）分別構(gòu)建了基于18S rDNA基因全長、保守序列II以及多變區(qū)的系統(tǒng)發(fā)育樹，比較了與其他已知昆蟲18SrDNA基因的同源性和遺傳距離。與其他序列的系統(tǒng)發(fā)育樹相比，其全長序列的系統(tǒng)發(fā)育樹更能反映鱗翅目昆蟲的親緣關(guān)系，印度谷螟與大蠟螟的親緣關(guān)系最近。此外，建立了以18SrDNA為內(nèi)參基因的實時熒光定量PCR方法。

印度谷螟 18SrDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹 實時熒光定量PCR

核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）是生物體中核糖核酸（RNA）的一類，為核糖體的主要組成部分，其功能為提供tRNA與mRNA密碼子對應(yīng)的環(huán)境，從而完成蛋白質(zhì)的合成［1］。核糖體由1個大亞基和1個小亞基構(gòu)成，在真核生物核糖體的小亞基中含有1個沉降系數(shù)為18S的RNA，該RNA由染色體基因編碼，稱為18SrDNA 基因，長度約為1 800 bp［2］。在生物的進化過程中非常保守，是研究生物高級分類群系統(tǒng)演化的難得工具之一［3］。另外，18SrDNA基因在生物體內(nèi)的表達水平相對穩(wěn)定，可作為內(nèi)參基因廣泛應(yīng)用于基因表達研究中，是應(yīng)用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR）技術(shù)進行基因的相對定量檢測時常用的內(nèi)參基因之一［4-7］。

印度谷螟Plodia interpunctella （Hübener）隸屬于鱗翅目（Lepidoptera）螟蛾科（Pyralidae），是一種世界性儲糧害蟲，我國華北及東北地區(qū)受其危害尤其嚴重。主要以幼蟲為害各種谷物豆類、花生、干果、奶粉、中藥材、煙葉等，常吐絲連綴糧粒及排泄物，并結(jié)網(wǎng)封閉其表面，使其結(jié)塊變質(zhì)，大量發(fā)生時還可引起糧食發(fā)熱，對儲藏物的安全構(gòu)成嚴重威脅。然而，目前還未見有對印度谷螟18S rDNA基因及相關(guān)信息的研究報道，因此本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)克隆獲得了印度谷螟18SrDNA基因的全長序列，分析了利用18SrDNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的最適片段，探討了在低級分類階元中應(yīng)用的可能性，并以此基因為內(nèi)參基因建立了實時熒光定量PCR方法，對印度谷螟相關(guān)功能基因表達水平分析研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試昆蟲

供試昆蟲印度谷螟采自南京財經(jīng)大學(xué)糧食儲運國家工程實驗室的模擬糧倉中，并在養(yǎng)蟲室內(nèi)人工飼養(yǎng)數(shù)代。飼料為磨碎的稻谷顆粒，培養(yǎng)在溫度為（28±1）℃、濕度為（75±5）%、24 h無光照條件的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中。

1.1.2 主要儀器與試劑

ABI 7500實時熒光定量PCR儀、veriti梯度PCR儀：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；PQX型分段可編程人工氣候箱：寧波東南儀器有限公司；DP304基因組提取試劑盒：天根生化科技有限公司；zero cloning載體：北京全式金生物技術(shù)有限公司；DL2000 Marker、rTaq DNA聚合酶、DH5α感受態(tài)細胞、膠回收試劑盒、SYBR Premix Ex Taq：寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 的提取

以印度谷螟三齡幼蟲為材料，按照DNA提取試劑盒說明書的操作步驟，提取基因組DNA。

1.2.2 引物設(shè)計

從GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索印度谷螟近緣物種的18SrDNA基因序列，用DNAMAN軟件進行多重比對，找出保守序列，并據(jù)此保守序列設(shè)計擴增引物：

上游引物P1：TCACCTACGGAAACCTTGT

下游引物P2：ACCTGGTTGATCCTGCCAGT

根據(jù)克隆獲得的印度谷螟18S rDNA基因序列，使用Primer 3.0 在線引物設(shè)計軟件（http：／／Frodo.wi.mit.edu／primer3／）設(shè)計real-time PCR 引物，其序列如下：

上游引物R1：TTCACCGACGATATGCTCCG

下游引物R2：ATTGGAGGGCAAGTCTGGTG

以上引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2.3 PCR反應(yīng)及產(chǎn)物的克隆及測序

以印度谷螟基因組DNA為模板，利用上述引物進行PCR擴增后，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、EB染色后，利用膠回收試劑盒對目的電泳條帶進行回收純化，純化產(chǎn)物克隆到zero cloning質(zhì)粒載體中，再轉(zhuǎn)化進入DH5α感受態(tài)細胞內(nèi)，在含有氨芐青霉素AMP的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h（37℃），隨機挑選陽性菌落，在LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，經(jīng)PCR擴增檢測后送公司測序，測序工作由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2.4 序列及遺傳信息分析

從GenBank中下載鱗翅目、鞘翅目、毛翅目和長翅目中不同科昆蟲的18SrDNA基因序列（表1），結(jié)合本研究所得到的印度谷螟18S rDNA基因序列，用MegAlign進行多重序列比對和同源性分析，選取不同的核苷酸片段用MEGA6.0軟件分析其遺傳距離和親緣關(guān)系，并采用鄰位連接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。其中的分支置信度由1 000次自舉法（Bootstrap）檢驗。

1.2.5 實時熒光定量PCR條件的優(yōu)化

采用SYBR Green I染料法，在實時熒光定量PCR儀上進行擴增，數(shù)據(jù)分析采用系統(tǒng)自帶的軟件7500 software 2.0.5進行，以最小的Ct值和最高的熒光值為標(biāo)準，分別對循環(huán)條件、退火溫度、引物濃度進行優(yōu)化。

1.2.6 熔解曲線分析

為排除引物二聚體或非特異性擴增對定量結(jié)果造成影響的可能性，在PCR擴增后進行熔解曲線分析，以確定產(chǎn)物為單一的目的產(chǎn)物。溫度以0.5℃／10 s的速度從60℃緩慢遞增到95℃，連續(xù)測定樣品的熒光強度以獲取熔解曲線。

1.2.7 標(biāo)準品的制備及標(biāo)準曲線的建立

以印度谷螟基因組為模板，利用上述定量PCR引物進行常規(guī)PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、EB染色后，利用膠回收試劑盒對目的電泳條帶進行回收純化。對純化的片段進行10倍系列梯度稀釋，以優(yōu)化的反應(yīng)條件進行實時熒光定量PCR擴增。以模板的相對濃度為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)建立相對定量標(biāo)準曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 印度谷螟18SrDNA基因的克隆與序列分析

以印度谷螟基因組DNA為模板，利用引物P1和P2進行PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳并染色后，獲得一條目的基因片段（圖1），經(jīng)基因克隆后進行基因序列測定，得到結(jié)果見圖2，該基因全長為1 888 bp，基因中T、C、A、G各堿基個數(shù)占基因總數(shù)的比例分別為25.0%、22.8%、24.8% 和27.4%，G+C 個數(shù)占基因總數(shù)的比例為50.2%，堿基組成基本無偏異（GenBank登錄號為KJ836335）。

表1 昆蟲的18SrDNA基因序列數(shù)據(jù)來源

圖1 印度谷螟18SrDNA基因PCR擴增結(jié)果

2.2 基因同源性和遺傳距離

印度谷螟與其他13種昆蟲18S rDNA基因序列的同源性以及兩兩間的遺傳距離見表2。鱗翅目的8種昆蟲18S rDNA全序列的遺傳距離介于0.003～0.018之間，同源性達98%以上，印度谷螟與鹿紋天蠶蛾Hemileuca sp．和大蠟螟Galleria mellonella的同源性最高，分別為99.14%和98.97%；而不同目之間昆蟲的同源性相對較低，均低于90%，且遺傳距離較遠，均大于0.12。說明18SrDNA基因具有較高的保守性，并與物種的進化關(guān)系具有較高的一致性，可以作為分類學(xué)中系統(tǒng)進化分析的重要參考依據(jù)。

圖2 印度谷螟18SrDNA基因核苷酸序列

表2 昆蟲18SrDNA序列的同源性（上三角，%）和兩兩間的遺傳距離（下三角）

2.3 基因同源區(qū)和多變區(qū)

通過多重序列比對分析，共得到2 104個堿基排列位點，其中保守堿基位點有1 558個，可變堿基位點480個，簡約信息位點354個，單堿基變化位點105個。分析結(jié)果表明，昆蟲18S rDNA在不同區(qū)段保守性不同，一般包含4個保守程度較高同源區(qū)（保守序列Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）（圖3）。其中，保守序列Ⅱ的長度為395 bp，相當(dāng)于印度谷螟18S rDNA第265至660 bp區(qū)域，其插入和缺失序列最少，保守性最強。

圖3 印度谷螟18SrDNA同源區(qū)和多變區(qū)的分布

2.4 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

利用MEGA6.0軟件采用鄰位連接法（NJ），經(jīng)過全局重排，采用Kimura-2參數(shù)堿基替代模型，靴帶檢驗（Bootstrap test）設(shè)定重復(fù)值為1 000，分別構(gòu)建14種昆蟲18SrDNA基因全長、保守序列Ⅱ以及多變區(qū)的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。

在本研究所建立的所有系統(tǒng)發(fā)育樹中，鱗翅目與其他目以較高的置信度完全分開，而鱗翅目內(nèi)部的拓撲結(jié)構(gòu)在不同的系統(tǒng)發(fā)育樹中略有不同。從圖4可以看出3個系統(tǒng)樹之間的差異主要在樹的基部，不同發(fā)育樹上鱗翅目被分成了5～6個分支。將鱗翅目分成5個分支的是基于18S rDNA全序列和保守序列Ⅱ構(gòu)建的發(fā)育樹，其結(jié)果與傳統(tǒng)分類最為接近。將鱗翅目分成6支的是基于多變區(qū)構(gòu)建的發(fā)育樹，本研究構(gòu)建系統(tǒng)進化樹使用的多變區(qū)為保守序列Ⅱ與保守序列Ⅲ之間的區(qū)域（序列長度為136 bp），結(jié)果顯示，6個分支中僅分出了毒蛾科和鳳蝶科兩支，其余科昆蟲均未能很好聚類，與傳統(tǒng)分類明顯不符。

圖4 基于昆蟲18SrDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 標(biāo)準曲線的制作

以Ct值為縱坐標(biāo)，以模板濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，獲得相對定量標(biāo)準曲線（圖5）。結(jié)果表明，本方法有很好的相關(guān)性，其Ct值與模板濃度的回歸方程為Y ＝ -2.958x+18.113，Y 為Ct值，x為模板濃度，其相關(guān)系數(shù)為0.998，擴增效率為117.8%。

圖5 18SrDNA的標(biāo)準曲線

2.6 擴增產(chǎn)物的熔解曲線

擴增產(chǎn)物的熔解曲線只有1個特異峰（圖6），表明產(chǎn)物是唯一的，無引物二聚體或非特異性擴增產(chǎn)物，說明本試驗設(shè)計的定量PCR引物具有很好的特異性，PCR反應(yīng)條件得到了較好的優(yōu)化。

圖6 熔解曲線分析

3 討論與結(jié)論

3.1 18SrDNA系統(tǒng)進化分析

18SrDNA在蛋白質(zhì)合成中具有重要的功能，且其基因序列及二級結(jié)構(gòu)高度保守，所以被廣泛應(yīng)用于研究分子系統(tǒng)學(xué)及物種的分類鑒定［8-9］。本研究構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與傳統(tǒng)分類基本一致，進一步證明了18SrDNA在昆蟲綱中具有適中的保守性，可以用于昆蟲分類研究。然而，普遍認為18S rDNA可用于科以上水平的系統(tǒng)發(fā)育分析［10-11］。本研究分析獲得的3個系統(tǒng)發(fā)育樹也證明高階元分類與傳統(tǒng)分類學(xué)接近，而低階元聚類結(jié)果則存在較大差異。故18SrDNA只能用于綱目等高級階元間關(guān)系的研究，而由其獲得的總科以下階元間的關(guān)系并不可靠。18SrDNA的全長序列還是其中的某一段序列更適合？本論文的研究結(jié)果表明，基于多變區(qū)構(gòu)建的發(fā)育樹與傳統(tǒng)分類學(xué)存在明顯的差異，而全長序列發(fā)育樹和保守序列Ⅱ發(fā)育樹則更能反映昆蟲的親緣關(guān)系，這與大部分人的研究結(jié)論一致［12-17］。雖然18SrDNA的全長序列包含了更多的信息，但是保守序列Ⅱ具有堿基數(shù)量少、易于擴增和測序，更適于大規(guī)模的分類學(xué)研究。據(jù)此，建議選擇昆蟲18SrDNA中較短的保守序列Ⅱ代替全長構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

3.2 18S rDNA作為內(nèi)參基因的定量PCR方法的建立

實時熒光定量PCR技術(shù)具有高度的敏感性、特異性，且能對模板進行精確的量化，受到科學(xué)家的廣泛關(guān)注。借助實時熒光定量PCR技術(shù)，可以對昆蟲不同品系、不同組織或不同個體間的基因表達水平進行比較研究，從分子水平上探究昆蟲的生命活動過程［18-20］。本研究利用18S rDNA作為內(nèi)參基因，初步探索建立了以印度谷螟18SrDNA為內(nèi)參基因的基于SYBR Green染料技術(shù)的實時熒光定量PCR方法。本研究設(shè)計的定量PCR引物具有較好的特異性，建立的方法具有快速、高通量、線性范圍廣等特點，為18S rDNA作為內(nèi)參基因?qū)τ《裙让嚓P(guān)基因的實時熒光定量PCR分析提供了有利的方法學(xué)基礎(chǔ)。

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Cloning of the 18SrDNA and Establishment of Quantitative Real-Time PCR Plodia interpunctella

Tang Peian1Wu Haijing1Xue Hao1Kong Deying2Song Wei1
（College of Food Science and Engineering／Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety，Nanjing University of Finance and Economics1，Nanjing 210023）
（Chongqing Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau2，Chongqing 400020）

The full-length sequence of 18SrDNA gene （1 888 bp，GenBank accession number：KJ836335）was obtained by cloning from the Plodia interpunctella larva using molecular biology method in this paper.The neighbor joining method was used to construct phylogenetic trees based on full-length sequence，conservative sequenceⅡand the variable area of 18SrDNA gene respectively，comparing the homology and genetic distance with 18S rDNA gene of other known insects.The phylogenetic tree based on the full-length sequence can better reflect the genetic relationship of Lepidoptera insects compared with that based on the other sequences，Plodia interpunctella has the closest genetic relationship with the Galleria mellonella．In addition，the quantitative real-time PCR method was established with 18SrDNA as a reference gene.

Plodia interpunctella，18SrDNA，phylogenetic tree，quantitative real-time PCR

Q751

A

1003-0174（2016）11-0099-07

糧食公益性行業(yè)科研專項（201413007-2，201513002-5），江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程（JSYXK201403）

2015-03-25

唐培安，男，1981年出生，副教授，糧食儲藏