徐彤硯 董亞飛 楊文鴿 徐大倫 張進杰 樓喬明

NMR結(jié)合GC-MS技術(shù)分析魷魚肝臟油脂及其脂肪酸組成

徐彤硯 董亞飛 楊文鴿 徐大倫 張進杰 樓喬明

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211）

利用NMR結(jié)合GC-MS技術(shù)對魷魚肝臟油脂及其脂肪酸組成分析。1H NMR結(jié)果表明，魷魚肝臟總脂脂肪酸中，多不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的含量比約為7∶5，n-3型多不飽和脂肪酸占脂肪酸總量的35%；13C NMR結(jié)果表明，魷魚肝臟總脂以甘油三酯（71.87%）為主，其次是游離脂肪酸（20.98%）和磷脂（5.29%），膽固醇（1.13%）和膽固醇酯（0.73%）含量較低，魷魚肝油中的DHA和EPA主要以游離形式存在，分別占DHA總量和EPA總量的61.24%和63.11%；GC-MS結(jié)果顯示，魷魚肝臟總脂脂肪酸主要為C16∶0、C18∶1、C20∶1、EPA和DHA，多不飽和脂肪酸的含量高達38.80%，且EPA和DHA占脂肪酸總量的31.50%，表明魷魚肝臟具有較高的營養(yǎng)價值及開發(fā)前景。

魷魚肝臟 NMR GC-MS 油脂 脂肪酸

魷魚屬軟體動物門（Mollusk），頭足綱（Cephalopods），十腕目（Decapoda），又名“槍烏賊”、“柔魚”，具有生長周期短、繁殖力強等特點，是世界上最具開發(fā)潛力的海產(chǎn)品之一。目前我國魷魚的年捕獲量約為80萬t，占據(jù)世界魷魚捕獲量的36%左右，是我國重要的遠洋捕撈品種。近年來隨著魷魚加工產(chǎn)量的日益擴大，加工產(chǎn)生的副產(chǎn)物也逐年遞增，這些副產(chǎn)物大部分直接被加工成經(jīng)濟價值較低的魚粉和飼料，有的甚至直接丟棄，造成環(huán)境污染和資源浪費。魷魚肝臟是魷魚加工的主要副產(chǎn)物，約占魷魚總重的15%～20%，魷魚肝臟脂質(zhì)含量高，富含EPA和DHA等多不飽和脂肪酸，具有抗動脈硬化，降血壓和降血脂的功效，可以作為多不飽和脂肪酸的重要膳食來源［1-2］。因此，魷魚肝臟如能得到進一步精深加工，不僅可以減少資源浪費和環(huán)境污染，還能獲得良好的經(jīng)濟價值和社會效益。

核磁共振（NMR）是一種新型無損檢測技術(shù)，具有快速、準(zhǔn)確、前處理簡單、不破壞樣品、重復(fù)性高等優(yōu)點，通過核磁共振技術(shù)不僅能判斷樣品的純度，還能測定樣品中不同組分所占的含量［3］。關(guān)于核磁共振技術(shù)和氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）技術(shù)分析油脂組分的研究報道很多，如Lech等［4］利用1H譜和13C譜分析了防護林土壤中不同脂質(zhì)組分的含量，Vidal等［5］利用1H譜分析了養(yǎng)殖鱸魚和野生鱸魚的脂質(zhì)組成差異，Davey等［6］利用1H譜實現(xiàn)了微藻中三酰甘油的快速檢測和定量，郭無瑕等［1］和高娟等［2］利用GC-MS技術(shù)分析了魷魚肝臟脂質(zhì)的脂肪酸組成。目前，將NMR技術(shù)結(jié)合GC-MS技術(shù)分析油脂組成的研究鮮見報道。因此，本研究采用NMR技術(shù)分析魷魚肝臟油脂組成，并結(jié)合GC-MS技術(shù)對魷魚肝臟油脂的脂肪酸組成進行分析鑒定，以便進一步了解魷魚肝臟油脂的組成，為肝臟油脂品質(zhì)鑒定及開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮魷魚肝臟：寧波豐群食品有限公司。

37種脂肪酸甲酯混標(biāo)：美國Sigma公司；氯仿、甲醇、正己烷、氘代氯仿、氯化鈉、無水硫酸鈉、濃硫酸等分析純：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

AVANCEⅢ400 MHZ核磁共振譜儀：德國Bruker公司；7890A型氣相色譜儀：美國Agilent儀器有限公司；M7-80EI型質(zhì)譜儀：北京普析通用儀器有限公司；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：西安安泰儀器科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 油脂提取

參照Folch法［7］提取，取10 g新鮮魷魚肝臟勻漿，加70 mL甲醇，振蕩30 min后加140 mL氯仿，浸提24 h后過濾，濾液中加40 mL 0.9%的氯化鈉溶液，振蕩靜置分層后，分離下層氯仿層，用無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，得到魷魚肝臟總脂。

1.2.2 核磁共振

取總脂20 mg，加0.6 mL氘代氯仿，轉(zhuǎn)移至核磁管中用于核磁共振分析，以四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標(biāo)，采用標(biāo)準(zhǔn)的一維氫譜脈沖程序和氫去耦的碳譜脈沖程序分別采集氫譜和碳譜。采集氫譜的參數(shù)為：探針溫度298 k，波譜頻率400.23 MHz，采點數(shù)12 082，譜峰寬度8 223.68 Hz；采集碳譜的參數(shù)為：探針溫度298 k，波譜頻率100.64 MHz，采點數(shù)32 768，譜峰寬度24 038.46 Hz。

1.2.3 脂肪酸分析

甲酯化衍生：取10 mg油脂，加入1 mL 5%的濃硫酸-甲醇溶液，于70℃水浴加熱1 h，冷卻后加1 mL正己烷，靜置分層，取上層清液經(jīng)無水硫酸鈉干燥后用于GC-MS分析。

氣相色譜條件：DB-WAX毛細管柱（60 m×0.25 mm ×0.25 μm），進樣量1 μL，不分流模式，進樣口溫度250℃，檢測器溫度250℃，柱流量為1 mL／min。升溫程序為50℃保持1 min，以20℃／min升至200℃，再以3℃／min升至230℃，保持15 min，

最后以3℃／min升至240℃，保持13 min，整個過程用時50 min。

質(zhì)譜條件：GC-MS接口溫度250℃，電離方式為EI，電離能量70 eV，離子源溫度250℃，掃描周期2.84 次／s，質(zhì)量掃描范圍m／z50～500 u。

2 結(jié)果與分析

2.1 核磁共振譜圖分析

2.1.1 氫譜分析

核磁共振譜峰積分和濃度成正比，因此可以根據(jù)特征譜峰計算油脂中不同組分所占的含量［8］。如圖1所示，化學(xué)位移為0.94～0.97 ppm的譜峰為n-3型多不飽和脂肪酸（n-3 PUFA）的-CH3信號，而0.82～0.89 ppm的譜峰為除n-3 PUFA外所有脂肪酸的-CH3信號，通過比較兩者的譜峰積分可得n-3 PUFA與其他脂肪酸的比例，由此可得n-3 PUFA占脂肪酸總量的35%。化學(xué)位移為2.25～2.33 ppm和2.34～2.40 ppm的譜峰分別為飽和脂肪酸（SFA）和多不飽和脂肪酸（PUFA）的-CH2-COOH信號，由此可得PUFA和SFA的含量比為7∶5。

圖1 魷魚肝臟總脂氫譜譜峰

2.1.2 碳譜分析

核磁共振氫譜譜峰化學(xué)位移分散度低，同核耦合產(chǎn)生裂分影響分辨率，并且不能觀察不含氫的碳基團，而采用碳譜能得到更加精細的譜峰，能夠提供結(jié)構(gòu)鑒定的重要信息，因此是分析油脂常用的方法［9-11］。試驗對魷魚肝臟總脂進行了13C NMR分析，并將部分譜峰歸屬列于表1，總脂碳譜譜圖如圖2、圖3所示。由圖2可知，甘油三酯、游離脂肪酸、膽固醇、膽固醇酯和磷脂的特征譜峰化學(xué)位移分別為61.99、180～177、71.69、73.67 和61.05 ppm。通過比較特征譜峰的積分得到不同組分的含量，其結(jié)果如表2所示，魷魚肝臟總脂以三酰甘油（71.87%）為主，其次是游離脂肪酸（20.98%）和磷脂（5.29%），膽固醇（1.13%）和膽固醇酯（0.73%）含量較低。此外，圖3中化學(xué)位移為129.41和127.57 ppm的譜峰代表游離型DHA的C4和C5信號，化學(xué)位移為129.30 ppm的譜峰代表酯型DHA的C5信號；化學(xué)位移為128.94和128.70 ppm的譜峰代表游離型EPA的C5和C6信號，而128.86和128.82 ppm 代表酯型EPA的C5和C6信號。因此可以根據(jù)譜峰積分得到酯型DHA和EPA與游離型DHA和EPA分別所占的含量，從而可知游離型DHA占DHA總量的61.24%，游離型EPA占EPA總量的63.11%，說明魷魚肝臟油脂中的DHA和EPA主要以游離形式存在。

圖2 魷魚肝臟總脂13 C NMR全譜峰

圖3 魷魚肝臟總脂碳譜局部譜峰（132～127 ppm）

表1 魷魚肝臟總脂碳譜譜峰歸屬

表2 魷魚肝臟油脂各組分含量及其化學(xué)位移

2.2 魷魚肝臟脂肪酸組成分析

魷魚肝臟總脂經(jīng)甲酯化處理后，采用GC-MS對其脂肪酸組成進行分析，其總離子流色譜圖如圖4所示。通過標(biāo)準(zhǔn)品對照和數(shù)據(jù)庫檢索對其脂肪酸進行定性，并按峰面積歸一化方法進行定量，其結(jié)果列于表3。

圖4 魷魚肝臟總脂脂肪酸組成的GC-MS總離子流色譜圖

表3 魷魚肝臟總脂脂肪酸組成

如表3所示，從魷魚肝臟總脂中共鑒定出25種脂肪酸，主要為C16∶0、C18∶1n-9、C20∶1n-11、DHA和EPA。其中，多不飽和脂肪酸（PUFA，38.80%）＞單不飽和脂肪酸（MUFA，32.96%）＞飽和脂肪酸（SFA，28.24%），SFA 以C16∶0（18.19%）和C18∶0（4.79%）為主，MUFA 以C18∶1n-9（8.20%）和C20∶1n-11（7.42%）為主。PUFA 與SFA 的含量比為6.9∶5，n-3 PUFA占脂肪酸總量的34%，這與核磁共振氫譜所得結(jié)果無顯著差異（P＞0.1）。魷魚肝臟總脂中n-3 PUFA主要為DHA和EPA，兩者總量高達31.50%，高于鰩魚（28.29%）［16］、墨魚（30.19%）［17］和鱈魚（21.60%）［18］。EPA 和DHA具有抑制血小板凝聚、抗血栓、提高免疫力、抑制炎癥和促進嬰幼兒大腦發(fā)育等生理功效［19］。魷魚肝臟總脂中富含EPA和DHA等n-3型多不飽和脂肪酸，表明其具有較高的營養(yǎng)價值和保健功能，可以作為EPA和DHA等功能性脂肪酸的重要膳食來源。

3 結(jié)論

3.11H NMR結(jié)果表明，在魷魚肝臟總脂脂肪酸中，多不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的含量比約為7∶5，n-3型多不飽和脂肪酸占總脂肪酸的35%；13C NMR結(jié)果表明，肝臟總脂以三酰甘油（71.87%）為主，其次為游離脂肪酸（20.98%）和磷脂（5.29%），膽固醇（1.13%）和膽固醇酯（0.73%）含量較低；肝油中DHA和EPA主要以游離形式存在，分別占DHA總量和EPA總量的61.24%和63.11%。

3.2 GC-MS結(jié)果顯示，魷魚肝臟總脂脂肪酸以C16∶0、C18∶1n-9、C20∶1n-11、DHA 和EPA 為主，多不飽和脂肪酸的含量高達38.80%，EPA和DHA占脂肪酸總量的31.50%，表明魷魚肝臟油脂具有較高的營養(yǎng)價值和開發(fā)前景，可以作為n-3型多不飽和脂肪酸的重要膳食來源。

3.3 利用NMR結(jié)合GC-MS技術(shù)能更全面地分析油脂組成，為油脂的品質(zhì)鑒定及加工利用提供理論依據(jù)。

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Analysis of Lipids and Fatty Acids Compositions of Squid Liver by NMR and GC-MS

Xu Tongyan Dong Yafei Yang Wenge Xu Dalun Zhang Jinjie Lou Qiaoming
（School of Marine Science，Ningbo University，Ningbo 315211）

NMR spectroscopy，in conjunction with GC-MStechniques，was used to study the compositions of lipids and fatty acids of squid liver oil.The results of 1H NMR indicate that the content ratio of PUFA and SFA was 7∶5 in total fatty acids of squid liver oil，and n-3 PUFA accounts for 35%of the total fatty acids.The 13C NMR demonstrates that the main constituent of total lipids of squid liver was triglycerides（71.87%），followed by free fatty acids（20.98%）and phospholipids （5.29%），the contents of cholesterols （1.13%）and cholesterol esters（0.73%）were low，DHA and EPA mainly exist in free from in squid liver oil，the contents of free DHA and EPA were 61.24%and 63.11%in total DHA and EPA，respectively.The results of GC-MS show that the main fatty acids were C16∶0，C18∶1，C20∶1，EPA and DHA in squid liver oil.PUFA accounts for 38.80%and the total content of EPA and DHA add up to 31.50%，indicating that the lipids of squid liver have high nutritional values and development prospects.

squid liver，NMR，GC-MS，lipids，fatty acids

TS251.9

A

1003-0174（2016）11-0140-05

國家自然科學(xué)基金（31201283），“水產(chǎn)”浙江省重中之重學(xué)科開放基金（xkzsc1531），寧波市自然科學(xué)基金（2012A610136）

2015-04-01

徐彤硯，女，1993年出生，碩士，食品工程

樓喬明，男，1981年出生，博士，講師，食品科學(xué)