劉高米洋，朱 慧，何 潔，劉菊芬，阮光萍，李自安，潘興華

臍帶間充質(zhì)干細胞對膠質(zhì)瘤細胞轉(zhuǎn)移侵襲能力影響初探

劉高米洋，朱 慧，何 潔，劉菊芬，阮光萍，李自安，潘興華

目的觀察人源臍帶間充質(zhì)干細胞（HUCMSC）對膠質(zhì)瘤細胞株U87轉(zhuǎn)移、侵襲能力的影響。方法建立細胞共培養(yǎng)體系，CCK8法、transwell法和Matrigel法分別檢測 HUCMSC與U87非接觸共培養(yǎng)后，U87增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲能力變化。結(jié)果體外細胞共培養(yǎng)體系中，HUCMSC共培養(yǎng)U87組（實驗組）比U87單獨培養(yǎng)組（對照組）轉(zhuǎn)移和侵襲能力都有顯著提高（P＜0.05），HUCMSC共培養(yǎng)對U87有促增殖作用。結(jié)論在體外共培養(yǎng)體系中，HUCMSC可能通過促進EMT轉(zhuǎn)化而提高膠質(zhì)瘤細胞株U87增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲潛能。因此，在HUCMSC的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用中，應(yīng)該考慮其可能的促腫瘤作用。

臍帶；間充質(zhì)干細胞；膠質(zhì)瘤；轉(zhuǎn)移；侵襲

由于臍帶間充質(zhì)干細胞的免疫原性較低、易取材、容易擴增等優(yōu)點，被認為是一種潛在的組織修復、抗衰老的新型生物治療手段。近年研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞能夠定向遷移到某些特定的腫瘤部位，一部分研究顯示，間充質(zhì)干細胞能夠促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但也有學者報道，遷移到腫瘤部位的間充質(zhì)干細胞有抑制腫瘤生長的作用。本實驗以惡性程度較高的膠質(zhì)瘤細胞株U87為研究對象，旨在研究臍帶間充質(zhì)干細胞對U87細胞的生物學行為的影響及其可能機制，為臍帶干細胞的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供資料，進一步明確臍帶干細胞應(yīng)用的安全性和適用性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與器材 DMEM/F12培養(yǎng)基 （美國Hyclone公司），胎牛血清（美國BI公司），雙抗（美國BI公司），Trizol（美國Invitrigen公司），GoTag qPCR Master Mix（美國Promega公司），Anti-Ki67 antibody、Anti-E-cadherin antibody、Anti-N-cadherin antibody、anti-GAPDH antibody（美國abcam公司），兔抗鼠IgG H&L（HRP），羊抗兔IgG H&L（HRP），qPCR引物由Thermo公司設(shè)計合成；百萬層級層流超凈工作臺（SW-CL-2F型，蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司），細胞培養(yǎng)37℃、CO2孵箱（美國Thermo公司），電泳槽（Bio-rad公司），Matrigel Invasion Chamber（BD公司），Transwell Chamber（美國Costar公司）。

1.2 細胞株和實驗動物 U87細胞株購于中科院昆明動物所，人源臍帶間充質(zhì)干細胞（HUCMSC）來自本實驗室分離培養(yǎng)的剖腹產(chǎn)臍帶3～5代間充質(zhì)干細胞。

1.3 人臍帶間充質(zhì)干細胞分離和培養(yǎng) 在產(chǎn)婦及其家屬知情同意下，取本院足月剖腹產(chǎn)新生兒臍帶，經(jīng)檢測產(chǎn)婦無傳染性疾病，胎兒無先天性疾病和畸形。無菌條件下，將采集的臍帶用生理鹽水反復沖洗，去掉殘留血液。將臍帶剪碎后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，用含20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，次日補液，3 d后換液，7 d后觀察細胞生長狀態(tài)，達到80%融合后傳代培養(yǎng)。

1.4 增殖能力檢測 消化對數(shù)生長期U87細胞，計數(shù)后將細胞懸液貼壁輕柔加入96孔板中，實驗組采用50%MSC培養(yǎng)上清加50%DMEM/F12完全培養(yǎng)基，對照組采用DMEM/F12完全培養(yǎng)基。6 h后為檢測起始點，此后每隔24 h檢測1次。CCK8法記錄細胞生長曲線。

1.5 轉(zhuǎn)移侵襲能力檢測 Transwell實驗：消化第5代對數(shù)生長期HUCMSC，在24孔板中分別種入0、1.0×104、2.0×104、3.0×104個 HUCMSC；12 h后在8 μm Transwell Chamber中種入無血清培養(yǎng)的1.5× 104個U87細胞，將小室輕輕放入已種入HUCMSC的24孔板中。24 h后取出小室風干片刻，4%甲醛固定30 min，去除甲醛，結(jié)晶紫染色30 min。拍照計數(shù)細胞。

Matrigel實驗：消化第5代對數(shù)生長期HUCMSC，計數(shù)細胞密度，在24孔板中分別種入0、1.0×104、2.0× 104、3.0×104個 HUCMSC，無血清培養(yǎng)；12 h后在8 μm Matrigel Chamber中種入無血清培養(yǎng)的1.5× 104個U87細胞，將小室輕輕放入已種入HUCMSC的24孔板中。24 h后4%甲醛固定30 min，去除甲醛，結(jié)晶紫染色30 min。拍照計數(shù)細胞。

1.6 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用Graphpad統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HUCMSC的分離培養(yǎng) 將新鮮臍帶剪碎后，采用無酶直接貼壁法將組織塊直接放入培養(yǎng)瓶中，采用20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，待長滿傳代后，換用10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，大約次日即可看見少許細胞貼壁（圖1a），約3 d后可見細胞爬出（圖1b），傳代后的細胞轉(zhuǎn)移時呈纖維樣（圖1c），稠密呈漩渦狀生長（圖1d）。

圖1 臍帶間充質(zhì)干細胞的生長形態(tài)

2.2 HUCMSC培養(yǎng)上清對U87增值能力的影響CCK8法檢測各組細胞增殖能力，結(jié)果提示，實驗組較對照組有更強的增殖能力（P＜0.05，圖2）。

圖2 CCK8實驗檢測HUCMSC對U87細胞增殖能力的影響

2.3 非接觸共培養(yǎng)HUCMSC對U87轉(zhuǎn)移侵襲能力的影響 穿梭實驗檢測U87在HUCMSC非接觸共培養(yǎng)條件下顯示，隨共培養(yǎng)HUCMSC數(shù)目增加，U87轉(zhuǎn)移能力遞增（圖3）。顯微鏡下計數(shù)穿過小室的細胞進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果顯示有顯著差異（P＜0.05）。侵襲實驗檢測U87在HUCMSC非接觸式共培養(yǎng)條件下其侵襲能力的變化，見圖4，共培養(yǎng)組較對照組顯示出較強的侵襲能力（P＜0.05）。

圖3 Transwell實驗檢測非接觸共培養(yǎng)下MSC對U87細胞轉(zhuǎn)移能力的影響

圖4 Matrigels實驗檢測非接觸共培養(yǎng)下MSC對U87細胞侵襲能力的影響

3 討論

間充質(zhì)干細胞具有免疫調(diào)控、造血支持、連續(xù)傳代和凍存后仍有自我修復和多向分化潛能等特點，在特定條件下，可分化為多種組織細胞，可作為種子細胞用于組織器官損傷修復和抗衰老[1]。HUCMSCs較其他來源間充質(zhì)干細胞有增殖能力強、取材方便的優(yōu)勢，因此，其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用前景廣泛，但安全性是間充質(zhì)干細胞臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用前必須明確的重要問題。近年研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞能特異的向腫瘤部位遷移；部分研究顯示，遷移到腫瘤部位的間充質(zhì)干細胞能促進腫瘤的生長[2]；而另一部分研究顯示，遷移到腫瘤部位的間充質(zhì)干細胞能抑制腫瘤的生長[3-5]。

膠質(zhì)瘤是一種最為常見的原發(fā)性腦腫瘤，同時也是一個全球性重大疾病問題，在美國每年有超過12 000人罹患膠質(zhì)瘤[6]。惡性膠質(zhì)瘤患者預(yù)后較差，半數(shù)生存時間為15個月[7]，手術(shù)和放化療治療效果都不理想，患者復發(fā)率極高。有文獻報道，間充質(zhì)干細胞能夠向腫瘤部位遷移，這為腫瘤治療提供了一種理想的藥物載體[8]。本課題擬選用臨床上最常見的腦部腫瘤膠質(zhì)瘤為切入點，選擇膠質(zhì)瘤細胞系U87為研究對象，試圖探究臍帶間充質(zhì)干細胞對膠質(zhì)瘤細胞U87的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響。

本研究采用CCK8法檢測了HUCMSC培養(yǎng)上清對U87的增殖能力的影響，結(jié)果提示，HUCMSC培養(yǎng)上清能夠促進U87增殖；非接觸式培養(yǎng)，提示HUCMSC可能促進U87細胞的增殖。這些結(jié)果提示，HUCMSC對腫瘤細胞增殖能力的影響不可一概而論，需要進一步明確其促增殖的作用機制。

EMT轉(zhuǎn)化是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要理論之一，目前研究表明，腫瘤轉(zhuǎn)移復發(fā)不一定需要發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化，但發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化的腫瘤細胞轉(zhuǎn)移侵襲能力更強[9]。本研究中Transwell和Matrigel實驗結(jié)果提示，非接觸培養(yǎng)條件下，HUCMSC能夠明顯促進U87細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力，并且隨著共培養(yǎng)的HUCMSC數(shù)量越多，其促轉(zhuǎn)移侵襲作用越明顯，提示HUCMSC可能通過分泌某些成分促進U87細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。還有研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞能夠分泌一種直徑為20～100 nm的分泌小泡，又稱外泌體 （exosome），外泌體中包含miRNA、lncRNA和多種細胞生長因子[10]。間充質(zhì)干細胞可能通過分泌外泌體釋放相關(guān)蛋白，促進U87的轉(zhuǎn)移侵襲能力，但需要進一步驗證。

綜上所述，HUCMSC作為一種潛在腫瘤藥物載體，其與腫瘤尤其是難治性腫瘤的相互影響是其臨床前應(yīng)用的需要解決的基本問題。本研究結(jié)果表明，HUCMSC在非接觸式培養(yǎng)方式下，能促進U87細胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力，但具體機制不甚明確，需進一步探求。

[1] Kalwitz G1,Endres M,Neumann K,et al.Gene expression profile of adult human bone marrow-derived mesenchymal stem cells stimulated by the chemokine CXCL7[J].Int J Biochem Cell Biol，2009,1(3):649-658.

[2] Karnoub AE,Dash AB,Vo AP,et al.Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis[J]. Nature，2007,449:557-563.

[3] Khakoo AY,Pati S,Anderson SA,et al.Human mesenchymal stem cells exert potent antitumorigenic effects in a model of Kaposi's sarcoma[J].J Exp Med,2006,203:1235-1247.

[4] Qiao L,Xu Z,Zhao T,et al.Suppression of tumorigenesis by human mesenchymal stem cells in a hepatoma model[J].Cell Res, 2008,18:500-507.

[5] Zhu Y,Sun Z,Han Q，et al.Human mesenchymal stem cells inhibit cancer cell proliferation by secreting DKK-1[J].Leukemia, 2009,23:925-933.

[6] Kleihues P,Cavenee WK.Pathology and genetics of tumours of the nervous system[J].Lyon:International Agency for Research on Cancer,2000,84(1):148.

[7] Panditharatna E,Yaeger K.Clinicopathology of diffuse intrinsic pontine glioma and its redefined genomic and epigenomic landscape[J].Cancer Genet,2015,208(7-8):367-373.

[8] Karnoub AE,Dash AB,Vo AP,et al.Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis[J].Nature, 2007,449(7162):557-563.

[9] Zhao Peng,Chen-Xiao Wang,Er-Hu Fang,et al.Role of epithelial-mesenchymal transition in gastric cancer initiation and progression[J].World J Gastroenterology,2014,20(18):5403-5410. [10] Tang MK,Wong AS.Exosomes:emerging biomarkers and targets for ovarian cancer[J].Cancer Lett,2015,367(1):26-33.

Preliminary study on impacts of UC-MSCs on metastasis and invasion of GCs

Liugao Miyang,Zhu Hui,He Jie,Liu Jufen,Ruan Guangping,Li Zi'an,Pan Xinghua Cell Biological Therapy Center,Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032,China;National Joint Engineering Laboratory of Stem Cells and Immune Cells and Biological Medicine Technology,Kunming,Yunnan,650032,China;Key Laboratory of Cell Therapy Technology and Translational Medicine of Yunnan Province,Kunming,Yunnan,650032,China;Yunnan Stem Cell Engineering Laboratory,Kunming, Yunnan,650032,China;Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative Medicine of Kunming,Kunming,Yunnan,650032,China

Objective To observe the impacts of human umbilical cord mesenchymal stem cells(HUC-MSCs)on the metastasis and invasion of glioma cell(GC)line U87.MethodsA cell co-culture system was established.The changes in the proliferation, metastasis and invasion of U87 after the non-contact co-culture with HUC-MSCs were detected by CCK8 method,transwell method and Matrigel method.ResultsThe metastasis and invasion of U87 co-cultured with HUC-MSCs(in the experiment group)were much better than those of U87 separately cultured (the control group).ConclusionIn the co-culture system in vitro,HUC-MSCs may improve the proliferation,metastasis and invasion of glioma cell line U87 by promoting EMT transformation.Therefore,the potential tumor promoting effects of HUC-MSCs should be considered in the clinical transformation application.

HUC;MSC;glioma;metastasis;invasion

R 318.1

A

1004-0188（2016）12-1398-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.12.013

2016-06-28）

國家科技支撐計劃項目（2014BI01B0）；國家973計劃項目（2012CB5181060）；云南省科技計劃重點項目(2013CA005）

650032昆明,成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細胞生物治療中心，干細胞與免疫細胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室,云南省細胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學重點實驗室，云南省干細胞工程實驗室，昆明市干細胞與再生醫(yī)學研究重點實驗室

潘興華，E-mail:xinghuapan@aliyun.com