郭文磊，趙 寧，李 偉，白 霜，王金信

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山東泰安 271018)

山東省小麥田看麥娘對甲基二磺隆的抗性及其基因突變

郭文磊，趙 寧，李 偉，白 霜，王金信

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山東泰安 271018)

為明確山東省麥田看麥娘種群對甲基二磺隆的抗性情況及可能存在的抗性機(jī)理，本研究在臨沂、日照等山東省看麥娘發(fā)生嚴(yán)重地區(qū)的小麥田共采集10個(gè)看麥娘種群，在溫室條件下測定了其對甲基二磺隆的抗性以及對其他4種除草劑的敏感性，擴(kuò)增和比對了靶標(biāo)酶乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase, ALS)基因部分片段的差異。結(jié)果表明，SDTC-4種群對甲基二磺隆具有高抗性，抗性倍數(shù)達(dá)30.1，其他種群對甲基二磺隆敏感，抗性倍數(shù)在1.0～1.8之間。對ALS基因片段測序發(fā)現(xiàn)，SDTC-4種群看麥娘ALS基因 197位氨基酸由脯氨酸(CCC)突變?yōu)榻z氨酸(TCC)(P197S)，其他種群均未發(fā)現(xiàn)有突變產(chǎn)生。SDTC-4種群對啶磺草胺和氟唑磺隆產(chǎn)生了一定的交互抗性，在推薦劑量下死亡率分別為10.0%和13.3%。所有的看麥娘種群對精噁唑禾草靈和異丙隆敏感，推薦劑量下死亡率達(dá)100%。本研究是看麥娘對甲基二磺隆抗性在山東省的第一例報(bào)道，ALS基因P197S突變是第一次在看麥娘中被發(fā)現(xiàn)，該突變很可能是導(dǎo)致SDTC-4種群對甲基二磺隆產(chǎn)生抗性的重要原因之一。

看麥娘；甲基二磺隆；乙酰乳酸合成酶；抗性；基因突變

看麥娘(AlopecurusaequalisSobol.)是禾本科看麥娘屬植物，在我國分布廣泛，是我國農(nóng)田十大害草之一[1-2]，其繁殖力強(qiáng)、種子量大，成熟后自行散落，容易經(jīng)風(fēng)、水流、機(jī)械等途徑傳播，群體競爭力強(qiáng)，導(dǎo)致作物嚴(yán)重減產(chǎn)[3-4]。作為山東省冬小麥田優(yōu)勢雜草，看麥娘在山東省魯南等地區(qū)的稻麥輪作田危害十分嚴(yán)重[5]。

甲基二磺隆(mesosulfuron-methyl)，是由德國拜耳作物科學(xué)公司開發(fā)的一種磺酰脲類(sulfonylureas, SUs)除草劑，該藥劑2004年在我國正式登記，廣泛用于小麥田防除禾本科及部分闊葉雜草，其作用靶標(biāo)為乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase, ALS)。 ALS類除草劑還包括咪唑啉酮類(imidazolinones, IMIs)、嘧啶氧(硫)苯甲酸酯類(pyrimidinyl-thiobenzoates, PTBs)、三唑并嘧啶類(triazolopyrimidines, TPs)和磺酰胺羰基三唑啉酮類(sulfonyl-aminocarbonyl-triazolinones, SCTs)[6]。ALS類除草劑具有殺草譜廣、用量低、對作物安全性高、對人畜低毒等優(yōu)點(diǎn)，但其作用位點(diǎn)單一，極易導(dǎo)致抗藥性的產(chǎn)生，截至目前全球已有158種雜草對該類藥劑產(chǎn)生了抗性[7-8]。在我國，Bi 等[9]報(bào)道江蘇省1個(gè)日本看麥娘(Alopecurusjaponicus)種群對甲基二磺隆的抗性水平達(dá)169倍。韓玉嬌等[10]報(bào)道江蘇、安徽部分菵草(Beckmanniasyzigachne)種群對甲基二磺隆產(chǎn)生了明顯的抗性。另外，Guo等[11]和Xia等[12]分別報(bào)道了安徽、江蘇小麥田看麥娘對甲基二磺隆的抗性，且其對精噁唑禾草靈產(chǎn)生了多抗性。

將雜草對除草劑的抗性機(jī)理一般分為靶標(biāo)抗性(Target site resistance，TSR)和非靶標(biāo)抗性(Non-target site resistance，NTSR)[13]。非靶標(biāo)抗性是由于雜草對除草劑代謝能力的增強(qiáng)或吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的減少，導(dǎo)致到達(dá)靶標(biāo)位點(diǎn)的除草劑的量減少，從而使雜草得以存活[14-15]。非靶標(biāo)抗性由復(fù)雜的多基因控制，目前國內(nèi)外研究均較少。靶標(biāo)抗性主要由于靶標(biāo)酶特定位點(diǎn)發(fā)生氨基酸替代，導(dǎo)致對除草劑的敏感性降低。目前，已經(jīng)證實(shí)雜草的ALS基因有8個(gè)位點(diǎn)(122、197、205、376、377、574、653、654)發(fā)生了27種氨基酸替代形式，這些突變可導(dǎo)致雜草對ALS類除草劑產(chǎn)生抗性[13, 16]。Guo等[11]報(bào)道了甲基二磺隆抗性看麥娘ALS基因574位點(diǎn)由色氨酸突變?yōu)榱涟彼?W574L)；Xia等[12]發(fā)現(xiàn)看麥娘種群對甲基二磺隆的抗性是由于ALS基因197位脯氨酸突變?yōu)樘K氨酸(P197T)。ALS基因不同位點(diǎn)的突變可能產(chǎn)生不同的交互抗性譜，如574位點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致雜草對所有5類ALS類除草劑產(chǎn)生抗性，而197位點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致雜草對SU類除草劑產(chǎn)生高抗性，對其他4類ALS類除草劑的交互抗性則不盡相同。

山東省是我國小麥的主要種植區(qū)之一，看麥娘等禾本科雜草在山東省部分地區(qū)的小麥田危害嚴(yán)重。目前，在安徽、江蘇等地區(qū)均已發(fā)現(xiàn)抗甲基二磺隆的看麥娘等禾本科雜草，但山東省冬小麥田雜草對該除草劑的抗性尚未見報(bào)道。本研究在山東南部等看麥娘發(fā)生嚴(yán)重區(qū)域的冬小麥田采集部分看麥娘種群，測定其對甲基二磺隆的敏感性差異，擴(kuò)增和比對了抗性和敏感種群的ALS基因片段，并測定供試種群對其他除草劑的敏感性，以期為看麥娘的治理提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 看麥娘種子

從山東郯城、東港、嵐山、萊陽、萊西等地小麥田采集看麥娘種群共9個(gè)，分別編號為SDTC-1、SDTC-2、SDTC-3、SDTC-4、SDDG-1、SDDG-2、SDLS-1、SDLY-1、SDLX-1；另從山東泰安泰山區(qū)一處非耕地采集1個(gè)種群作為敏感對照，編號為SDTS-1。采集地點(diǎn)等具體信息見表1。

1.1.2 供試除草劑

30 g·L-1甲基二磺隆可分散油懸浮劑、69 g·L-1精噁唑禾草靈(fenoxaprop-p-ethyl)微乳劑，拜耳作物科學(xué)(中國)有限公司；7.5% 啶磺草胺(pyroxsulam)水分散粒劑，美國陶氏益農(nóng)公司；70%氟唑磺隆(flucarbazone-sodium)水分散粒劑，日本愛利思達(dá)公司；50%異丙隆(isoproturon)可濕性粉劑，美豐農(nóng)化有限公司。

表1 看麥娘種群采集地點(diǎn)和時(shí)間

Table 1 Location and time ofAlopecurusaequalispopulations collected

種群編號Population采樣點(diǎn)Samplingsite經(jīng)緯度Longitudeandlatitude采集時(shí)間CollectiontimeSDTC?1臨沂市郯城縣紅花鎮(zhèn)前蒼村Qiancangvillage，Honghuatown，TanchengcountyofLinyiN：34°29′10″E：118°20′43″2013年6月June2013SDTC?2臨沂市郯城縣紅花鎮(zhèn)胡林村Hulinvillage，Honghuatown，TanchengcountyofLinyiN：34°28′47″E：118°19′23″2013年6月June2013SDTC?3臨沂市郯城縣紅花鎮(zhèn)袁堂村Yuantangvillage，Honghuatown，TanchengcountyofLinyiN：34°29′15″E：118°18′46″2013年6月June2013SDTC?4臨沂市郯城縣歸昌鄉(xiāng)歸昌三村Guichangthirdvillage，Guichangtown，TanchengcountyofLinyiN：34°30′48″E：118°16′39″2014年6月June2014SDDG?1日照市東港區(qū)濤雒鎮(zhèn)濤雒六村Taoluosixthvillage，Taoluotown，DonggangdistinctofRizhaoN：35°16′6″E：119°22′08″2013年6月June2013SDDG?2日照市東港區(qū)濤雒鎮(zhèn)濤雒七村Taoluoseventhvillage，Taoluotown，DonggangdistinctofRizhaoN：35°16′40″E：119°22′03″2013年6月June2013SDLS?1日照市嵐山區(qū)碑廓鎮(zhèn)下湖村Xiahuvillage，Beikuotown，LanshandistinctofRizhaoN：35°12′07″E：119°09′27″2013年6月June2013SDLY?1煙臺(tái)市萊陽市照旺莊鎮(zhèn)葉家泊村Yejiapovillage，Zhaowangzhuangtown，LaiyangcountyofYantaiN：36°54′28″E：120°45′05″2013年6月June2013SDLX?1青島市萊西市南墅鎮(zhèn)北墅村Beishuvillage，Nanshutown，LaixicountyofQingdaoN：37°03′12″E：120°19′59″2014年6月June2014SDTS?1泰安市泰山區(qū)南上高鄉(xiāng)黃家莊村Huangjiazhuangvillage，Nanshanggaotown，TaishandistinctofTaianN：36°10′36″E：117°10′12″2014年6月June2014

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 看麥娘對甲基二磺隆的抗性測定

采用溫室盆栽整株水平測定法[17]進(jìn)行看麥娘對甲基二磺隆的抗性測定。從各種群中，分別選取均勻一致的看麥娘種子，置于含30 mL 6 g·L-1的植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)用瓊脂(Duchefa Biochemie B.V公司)的培養(yǎng)皿中，每皿加滅菌水3 mL保持濕潤；將培養(yǎng)皿放入智能光照培養(yǎng)箱中催芽(光/暗比為12 h/12 h，溫度20 ℃/15 ℃)。選取芽長1 cm左右的幼苗，移植到盛有壤土的直徑12 cm的塑料花盆中，每盆15株，置于可控溫室中培養(yǎng)(18～25 ℃，濕度50%～70%，自然光照)。2～3葉期間苗，每盆留生長狀況一致的看麥娘10株。3～4葉期時(shí)采用ASS-4自動(dòng)控制農(nóng)藥噴灑系統(tǒng)(北京盛恒天寶科技有限公司)進(jìn)行莖葉噴霧處理，噴液壓力275 kPa，噴液量450 L·hm-2。在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)定甲基二磺隆有效成分(下同)施用劑量為：抗性(R)種群，0、3、9、27、81、243、729 g·hm-2；敏感(S)種群，0、0.1、0.3、1、3、9、27 g·hm-2。

處理后21 d剪取地上部分，在80 ℃條件下烘干72 h至恒重，稱量干重并記錄。每處理3次重復(fù)，試驗(yàn)共進(jìn)行2次。用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對兩次試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行ANOVA分析，合并后的結(jié)果采用SigmaPlot 12.5軟件進(jìn)行4參數(shù)非線性回歸[18]分析：

Y=C+(D-C)/[1+(X/GR50)b]

式中，Y為各除草劑處理劑量下看麥娘干重占空白對照的百分比；C為劑量反應(yīng)下限；D為劑量反應(yīng)上限；X為除草劑用量；b為斜率。利用該公式計(jì)算出GR50值，再利用R、S種群的GR50計(jì)算出抗性倍數(shù)RI= GR50(R)/GR50(S)。RI分級標(biāo)準(zhǔn)參考Beckie等[19]方法：敏感(RI<2)，低抗(RI=2～5)，中抗(RI=6～10)，高抗(RI=11～100)，極抗(RI>100)。

1.2.2 基因組DNA提取

從看麥娘R、S種群分別隨機(jī)選取30株進(jìn)行基因組DNA提取。3～4葉期時(shí)，每植株剪取約0.1 g幼嫩葉片組織，按植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)說明書提取DNA。其中，R種群為單株提取，共得到30個(gè)DNA樣品；S種群均為3株混合提取，每個(gè)S種群得到10組DNA樣品。提取的總DNA樣品立即用于PCR擴(kuò)增或放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank登記的大穗看麥娘AlopecurusmyosuroidesALS(AJ437300.2)基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計(jì)引物用于看麥娘ALS基因檢測，所擴(kuò)增ALS基因片段不包含內(nèi)含子，覆蓋所有已報(bào)道的ALS抗性突變位點(diǎn)。另設(shè)計(jì)引物AL-F2、AL-F3用于擴(kuò)增片段的測序，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表2。

表2 擴(kuò)增看麥娘ALS基因片段的引物

Table 2 Primers used for ALS gene amplification fromAlopecurusaequalis

引物Primer序列(5′?3′)Sequence(5′?3′)退火溫度Annealingtemperature/℃用途Usage片段大小Productsize/bpAL?F1CGTCGCCTTACCCAAACCTAC59．6PCR擴(kuò)增及測序PCRandALSsequencing1859AL?R1RTCCTGCCATCACCWTCCAAL?F2ATTGCCCGCCTTCCTAAGCCALS測序ALSsequencingAL?F3TCATTGCCACTGGTGTTGGGCALS測序ALSsequencing

引物序列中R、W均為簡并堿基，R:A/G, W:A/T。

In the primer sequence, R and W are degenerate bases, R:A/G, W:A/T.

1.2.4 看麥娘ALS基因片段克隆與測序

ALS基因片段擴(kuò)增均采用50 μL反應(yīng)體系：34.5 μL ddH2O、5 μL 10× EasyTaq緩沖液、4 μL dNTP、2 μL引物AL-F1、2 μL引物AL-R1、0.5 μL EasyTaqDNA 聚合酶、2 μL 基因組DNA模板，緩沖液、dNTP、DNA聚合酶均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。采用T100 Thermal cycler PCR儀(美國伯樂公司)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 1 min，59.6 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min， 35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。

取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL于1.0%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測，將含目的條帶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用EasyPure PCR Purification Kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司)純化后測序(上海生工)。

將測序所得序列用DNAman 5.2.2軟件進(jìn)行翻譯，得到相應(yīng)的氨基酸序列；對氨基酸序列進(jìn)行比對分析。本研究中，所有看麥娘ALS氨基酸序列位數(shù)均參照擬南芥ArabidopsisthalianaALS(NM-114714.2)氨基酸序列全長進(jìn)行比對。

1.2.5 看麥娘對其他除草劑的敏感性測定

采用單劑量測定所采集種群對ALS類除草劑啶磺草胺、氟唑磺隆、ACCase類除草劑精噁唑禾草靈和取代脲類除草劑異丙隆的敏感性，以清水處理為對照。4種除草劑有效成分(下同)施用劑量分別為：啶磺草胺10.55 g·hm-2，氟唑磺隆31.5 g·hm-2，精噁唑禾草靈62.1 g·hm-2，異丙隆900 g·hm-2?？贷溎锱囵B(yǎng)及噴藥方法同1.2.1。處理后21 d記錄每盆看麥娘植株死亡數(shù)；剪取地上部分稱量干重，計(jì)算死亡率和干重抑制率。

死亡率=(對照雜草株數(shù)-處理雜草株數(shù))÷對照雜草株數(shù)×100%

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用DPS 7.05進(jìn)行處理，差異性分析采用鄧肯新復(fù)極差法(DMRT)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同看麥娘種群對甲基二磺隆的抗性水平

如表3所示，10個(gè)被測看麥娘種群中有9個(gè)對甲基二磺隆都較為敏感，GR50值在1.3～2.4 g·hm-2之間；只有采自山東郯城的SDTC-4種群對甲基二磺隆具有高抗性，其GR50值達(dá)39.1 g·hm-2，遠(yuǎn)大于推薦劑量(9 g·hm-2)，與敏感種群SDTS-1相比抗性倍數(shù)達(dá)30.1倍。說明甲基二磺隆在推薦劑量下已不能有效防治SDTC-4看麥娘種群。試驗(yàn)結(jié)果與田間觀察結(jié)果一致。

2.2 看麥娘ALS基因片段測序

對看麥娘ALS基因片段進(jìn)行擴(kuò)增后，得到長度為1 859 bp的ALS基因片段，該ALS基因序列與親緣關(guān)系較近的大穗看麥娘相應(yīng)基因的同源性達(dá)96.2%。將翻譯后的氨基酸序列與擬南芥進(jìn)行比對，結(jié)果顯示在產(chǎn)生抗性的SDTC-4種群中，ALS氨基酸序列的197位(以擬南芥ALS全長氨基酸序列為標(biāo)準(zhǔn))氨基酸密碼子由CCC突變?yōu)門CC，導(dǎo)致脯氨酸(P)突變?yōu)榻z氨酸(S)(圖1)。所測SDTC-4種群的30株看麥娘均產(chǎn)生上述突變，對其測序峰圖進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，30株中有18株是純合型突變(即197位密碼子為TCC)，另有12株為雜合型(即197位密碼子為CCC/TCC)。SDTC-4種群中未發(fā)現(xiàn)其他位點(diǎn)的突變，所有敏感型種群均未發(fā)現(xiàn)已證實(shí)的突變。

表3 不同看麥娘種群對甲基二磺隆的抗性水平

Table 3 Resistance level to mesosulfuron-methyl in different populations ofAlopecurusaequalis

種群Population回歸方程參數(shù)RegressionparameterCDbGR50/[g(a．i)·hm-2]抗性倍數(shù)RISDTC?122．2(4．0)86．1(3．6)1．2(0．3)1．9(0．3)1．5SDTC?218．4(3．2)92．5(4．6)0．8(0．2)2．4(0．9)1．8SDTC?321．8(0．7)96．2(0．7)1．3(0．1)1．8(0．1)1．4SDTC?423．8(2．1)91．7(2．4)1．4(0．2)39．1(3．7)30．1SDDG?122．4(2．8)79．8(2．7)2．1(0．5)1．9(0．3)1．5SDDG?215．4(7．5)90．3(7．3)0．8(0．3)1．8(0．5)1．4SDLS?129．4(1．9)86．0(2．1)1．5(0．2)1．5(0．2)1．2SDLY?125．7(2．2)86．9(2．4)1．1(0．2)1．6(0．2)1．2SDLX?123．8(0．9)84．1(1．1)1．3(0．1)1．4(0．1)1．1SDTS?121．5(1．5)80．5(1．9)1．2(0．1)1．3(0．1)1．0

括號內(nèi)數(shù)據(jù)為標(biāo)準(zhǔn)誤。

Standard errors(SE) are in parentheses.

方框表示種群中ALS的197位氨基酸。

Boxed codons indicate 197 amino acid in ALS.

圖1 不同看麥娘種群ALS部分氨基酸序列

Fig.1 Partial amino acid sequences of ALS gene from differentAlopecurusaequalispopulations

P197S突變在地膚(Kochiascoparia)、硬直黑麥草(Loliumrigidum)、虞美人(Papaverrhoeas)等雜草中已有報(bào)道，該突變可使得抗性雜草對磺酰脲類除草劑產(chǎn)生高水平或極高水平(RI>100)的抗性[17]。本研究中，SDTC-4種群對甲基二磺隆的高抗性很可能與其ALS基因的P197S突變有關(guān)。

2.3 看麥娘對其他除草劑的敏感性

為了確定山東省看麥娘種群對其他麥田禾本科雜草常用除草劑啶磺草胺、氟唑磺隆、精噁唑禾草靈和異丙隆的敏感性，以及抗性種群SDTC-4是否對其他ALS類除草劑產(chǎn)生了一定的交互抗性，本研究采用單劑量測定的方法進(jìn)行了試驗(yàn)。

如表4所示，采自山東省的10個(gè)看麥娘種群，在精噁唑禾草靈(62.1 g·hm-2)和異丙隆(900 g·hm-2)推薦劑量處理下，死亡率均達(dá)100%，干重抑制率在81.9%～84.3%和89.9%～92.5%之間。另外，大多數(shù)看麥娘種群的植株在啶磺草胺(10.55 g·hm-2)和氟唑磺隆(31.5 g·hm-2)處理下均死亡，而SDTC-4種群死亡率僅為10.0%和13.3%，干重抑制率為35.4%和42.9%。

上述結(jié)果表明，山東省大多數(shù)看麥娘種群對精噁唑禾草靈、異丙隆、啶磺草胺和氟唑磺隆依然敏感，這4種除草劑仍可用于防除麥田看麥娘。SDTC-4種群對甲基二磺隆產(chǎn)生抗性的同時(shí)，對啶磺草胺和氟唑磺隆也產(chǎn)生了一定的交互抗性，已不適于采用這2種藥劑對其進(jìn)行防治。

表4 不同看麥娘種群對其他4種除草劑的敏感性

Table 4 Sensitivity of differentAlopecurusaequalispopulations to four kinds of herbicide

%

同列數(shù)據(jù)后的不同字母表示種群間差異顯著(P<0.05)。

Different letters following values within same column mean significant difference(P<0.05).

3 討 論

本研究所測的山東省10個(gè)看麥娘種群中，SDTC-4種群對甲基二磺隆產(chǎn)生了高水平抗性，抗性倍數(shù)達(dá)30.1倍，其他種群對甲基二磺隆表現(xiàn)敏感。SDTC-4種群對甲基二磺隆抗性的產(chǎn)生可能與其用藥歷史有關(guān)。該地區(qū)已連續(xù)使用甲基二磺隆防治看麥娘等禾本科雜草多年。據(jù)報(bào)道，ALS類除草劑使用不到10次即可導(dǎo)致雜草對其產(chǎn)生抗性[19]。目前在世界范圍內(nèi)，對ALS類除草劑產(chǎn)生抗性的雜草數(shù)目在全部抗性雜草中居第一位[8]。SDTC-4種群抗性純合植株約占60%，說明抗性在該地塊可能已產(chǎn)生多年。看麥娘是二倍體植物，且可以通過異花授粉(40%)方式完成授粉[20]。因此，抗性相關(guān)基因很容易通過花粉從抗性植株傳播到其他植株，從而使得抗性基因在田間很快蔓延開來。種植方式及不合理的施藥方式也有助于抗性的產(chǎn)生和傳播。在施藥時(shí)隨意提高劑量[21]，甚至在同一個(gè)生產(chǎn)季度內(nèi)施用2～3次同種或同類的除草劑可能是加快抗性種群產(chǎn)生的主要原因。據(jù)黃世霞[1]報(bào)道，看麥娘在0～5 cm的淺土層適宜萌發(fā)，2 cm時(shí)萌發(fā)率最高，隨著埋藏深度增加萌發(fā)率顯著降低。因此，除了利用除草劑進(jìn)行化學(xué)除草外，可有針對性地采取深耕等措施對看麥娘進(jìn)行防治。

本研究中，SDTC-4看麥娘種群植株的ALS基因產(chǎn)生了P197S突變，該突變在至少20種雜草中已被證實(shí)可導(dǎo)致對ALS除草劑的抗性[19]，因此P197S突變很可能與該種群對甲基二磺隆的抗性有關(guān)。ALS 基因197位點(diǎn)突變導(dǎo)致雜草對除草劑產(chǎn)生抗性的同時(shí)，一般不會(huì)對雜草的其他生物學(xué)特性帶來明顯影響，除草劑選擇壓消失后，抗性植株在種群中所占比例并不會(huì)降低。Yu等[22]研究了P197S突變對ALS酶動(dòng)力學(xué)方面的影響，發(fā)現(xiàn)P197S突變對ALS功能幾乎沒有影響，這可能是該突變形式普遍存在的一個(gè)原因。

不同的突變位點(diǎn)，或者同一突變位點(diǎn)的不同突變方式，其交互抗性譜也不盡相同[19]。本研究發(fā)現(xiàn)抗性看麥娘種群(SDTC-4)對尚未使用過的除草劑啶磺草胺和氟唑磺隆已產(chǎn)生了抗性，這與前人的研究相一致[13,16,19]；精噁唑禾草靈和異丙隆仍可用于防治小麥田看麥娘。為延緩抗藥性的發(fā)生，在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)選擇不同種類的除草劑輪換使用或混用，避免單一、長期使用某類除草劑。考慮到多抗性看麥娘已有相關(guān)報(bào)道，應(yīng)盡量避免連續(xù)使用某單一類型的除草劑。

本研究初步明確了山東省部分地區(qū)看麥娘對甲基二磺隆的抗性水平，發(fā)現(xiàn)SDTC-4種群對甲基二磺隆產(chǎn)生了高水平的抗性，且對啶磺草胺和氟唑磺隆具有抗性，其ALS基因的P197S突變應(yīng)該是其產(chǎn)生抗性的主要原因之一。本文是山東省有關(guān)甲基二磺隆抗性的第一例報(bào)道，P197S突變則是在看麥娘中第一次被發(fā)現(xiàn)。本研究只從靶標(biāo)抗性角度對其抗性機(jī)理進(jìn)行了研究，有必要從靶標(biāo)酶活性和代謝酶等角度對其抗性機(jī)理進(jìn)一步研究。

[1] 黃世霞.油菜田看麥娘的生物學(xué)特性及其對三種除草劑抗藥性的研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2004:8.

HUANG S X.Studies on biology and resistance ofAlopecurusaequalisSobol.to acetyl-coenzyme A carboxylase inhibitors [D].Nanjing:Nanjing Agricultural University,2004:8.

[2] ZHANG Z P.Development of chemical weed control and integrated weed management in China [J].WeedBiologyandManagement,2003,3:197.

[3] 唐洪元,王學(xué)鶚,沈國輝.看麥娘等雜草對麥子產(chǎn)量損失的研究[J].雜草學(xué)報(bào),1990,4(1):8.

TANG H Y,WANG X E,SHEN G H.Study on the yield loss of wheat and barley caused by the infestation ofAlopecurusjaponicusandA.aequalis[J].JournalofWeedScience,1990,4(1):8.

[4] 劉德鈞,王 兵,蔣耀培.看麥娘、牛繁縷和雨日對小麥產(chǎn)量的影響[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),1992,8(4):73.

LIU D J,WANG B,JIANG Y P.Effects ofAlopecurusaequalis,Malachiumaquaticumand rain days on production of wheat of Shanghai [J].ActaAgriculturaeShanghai,1992,8(4):73.

[5] 高興祥,李 美,房 鋒,等.山東省小麥田雜草組成及群落特征 [J].草業(yè)學(xué)報(bào),2014,23(5):92.

GAO X X,LI M,FANG F,etal.Species composition and characterization of weed communities in wheat fields in Shandong province [J].ActaPrataculturaeSinica,2014,23(5):92.[6] DéLYE C,PERMIN F,SCARABEL L.Evolution and diversity of the mechanisms endowing resistance to herbicides inhibiying acetolactate-synthase(ALS) in corn poppy(PapaverrhoeasL.) [J].Plant Science,2011,180:333.

[7] TRANEL P J,WRIGHT T R.Resistance of weeds to ALS-inhibiting herbicides:What have we learned? [J].WeedScience,2012,50:700.

[8] HEAP I M.International survey of herbicide resistant weeds [EB/OL](2016-04-30)[2016-04-30]:http://www.weedscience.com

[9] BI Y L,LIU W T,LI L X,etal.Molecular basis of resistance to mesosulfuron-methyl in Japanese foxtail,Alopecurusjaponicus[J].JournalofPesticideScience,2013,37:74.

[10] 韓玉皎,崔海蘭,李香菊.我國冬小麥區(qū)菵草種群對甲基二磺隆的抗性水平 [J].雜草科學(xué),2015,33(2):37.

HAN Y J,CUI H L,LI X J.Survey of resistance levels to mesosulfuron-methyl inBeckmanniasyzigachne(Steud.) Fernald populations in winter wheat fields in China [J].WeedScience,2015,33(2):37.

[11] GUO W L,YUAN G H,LIU W T,etal.Multiple resistance to ACCase and AHAS-inhibiting herbicides in shortawn foxtail(AlopecurusaequalisSobol.) from China [J].PesticideBiochemistryandPhysiology,2015,124:66.

[12] XIA W W,PAN L,LI J,etal.Molecular basis of ALS- and/or ACCase-inhibitor resistance in shortawn foxtail(AlopecurusaequalisSobol.) [J].PesticideBiochemistryandPhysiology,2015,122:76.

[13] POWLES S B,YU Q.Evolution in action:Plants resistant to herbicides [J].AnnualReviewofPlantBiology,2010,61:317.

[14] YUAN J S,TRANEL P J,STEWART C N.Non-target-site herbicide resistance:a family business [J].TrendsinPlantScience,2007,12:6.

[15] DéLYE C.Unravelling the genetic bases of non-target-site based resistance(NTSR) to herbicides:A major challenge for weed science in the forthcoming decade [J].PestManagementScience,2013,69:176.

[16] YU Q,POWLES S B.Resistance to AHAS inhibitor herbicides:Current understanding [J].PestManagementScience,2014,70:1340.

[17] 吳小虎,王金信,劉偉堂,等.山東省部分市縣麥田雜草麥家公Lithospermumarvense對苯磺隆的抗藥性[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào),2011,13(6):597.

WU X H,WANG J X,LIU W T,etal.Resistance ofLithospermumarvenseto tribenuron-methyl in winter wheat fields in part of Shandong province [J].ChineseJournalofPesticideScience,2011,13(6):597.

[18] SEEFELDT S S,JENSEN J E,FUERST E P.Log-logistic analysis of herbicide dose-response relationships [J].WeedTechnology,1995,9:218.

[19] BECKIE H J,TARDIF F J.Herbicide cross resistance in weeds [J].CropProtection,2012,35:15.

[20] MORISHMA H,OKA H I.The impact of copper pollution on water foxtail(AlopecurusaequalisSobol.) populations and winter weed communities in rice fields [J].Agro-Ecosystem,1980,6:33.

[21] XU H L,LI J,ZHANG D,etal.Mutations at codon position 1999 of acetyl-CoA carboxylase confer resistance to ACCase-inhibiting herbicides in Japanese foxtail(Alopecurusjaponicus) [J].PestManagementScience,2014,70:1894.

[22] YU Q,HAN H P,VILA-AIUB M M,etal.AHAS herbicide resistance endowing mutations:Effect on AHAS functionality and plant growth [J].JournalofExperimentalBotany,2010,61(14):3925.

Resistance of Shortawn Foxtail(Alopecurus aequalis Sobol.) to Mesosulfuron-methyl in Wheat Fields in Shandong Province

GUO Wenlei, ZHAO Ning, LI Wei, BAI Shuang, WANG Jinxin

(College of Plant Protection, Shandong Agricultural University, Tai’an, Shandong 271018, China)

In order to examine the resistance level and the potential resistance mechanism ofAlopecurusaequalisto mesosulfuron-methyl, we collected ten populations from the wheat fields in Linyi, Rizhao and other places of Shandong province. Whole-plant dose-response experiments were conducted to evaluate the mesosulfuron-methyl resistance levels and susceptibilities to the other four herbicides in the greenhouse. Acetolactate synthase(ALS) gene fragments were amplified, sequenced, and compared between the resistant and susceptible populations. The results showed that SDTC-4 population displayed high level resistance to mesosulfuron-methyl, and the resistance index(RI) was 30.1. Oppositely, all the other populations were still susceptible to mesosulfuron-methyl, with RI 1.0-1.8. Sequencing results showed that the mutation of proline(CCC) to threonine(TCC) existed in ALS gene of SDTC-4 population, but there were no mutations in other populations. The SDTC-4 population was also cross resistant to pyroxsulam and flucarbazone-sodium, with the mortality rate 10.0% and 13.3% at the recommended field rate, respectively. AllA.aequalispopulations could still be controlled by fenoxaprop-p-ethyl and isoproturon, with the mortality rate up to 100% at the recommended field rate. This was the first report about mesosulfuron-methyl resistance in Shandong province, and P197S mutation of ALS was also firstly reported inA.aequalis. The P197S mutation was very likely one of the key reasons resulting in mesosulfuron-methyl resistance of SDTC-4 population.

Alopecurusaequalis; Mesosulfuron-methyl; ALS; Resistance; Gene mutation

時(shí)間：2016-12-07

2016-05-12

2016-06-20

國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303031)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31471787)

E-mail：nongzhida@126.com 通訊作者：王金信(E-mail:wangjx@sdau.edu.cn)

S512.1；S432

A

1009-1041(2016)12-1688-07

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