張薇，孟衡玲，孟珍貴，梁泉，魏翔，楊生超

(1.云南農(nóng)業(yè)大學 云南省優(yōu)勢中藥材規(guī)范化種植工程研究中心，云南 昆明 650201；2.紅河學院，云南 蒙自 661100)

燈盞花自交不親和SRK基因編碼區(qū)甲基化分析*

張薇1,2，孟衡玲2，孟珍貴1，梁泉1，魏翔2，楊生超1

(1.云南農(nóng)業(yè)大學 云南省優(yōu)勢中藥材規(guī)范化種植工程研究中心，云南 昆明 650201；2.紅河學院，云南 蒙自 661100)

為研究燈盞花自交不親和基因SRK(EbSRK)的DNA甲基化變異，本文利用甲基化敏感限制性內(nèi)切酶-PCR法，對EbSRK基因中包含CCGG位點的部分編碼區(qū)進行甲基化分析，同時，利用RT-PCR檢測EbSRK基因在燈盞花不同組織中的表達情況。實驗結(jié)果顯示,EbSRK基因中的兩個CCGG位點不存在甲基化，而EbSRK基因在不同組織該基因的表達量有顯著的差異性。這說明對EbSRK等位基因的抑制不是由于EbSRK基因中CCGG位點甲基化引起，而存在其他的調(diào)控機理。

燈盞花；SRK基因；DNA甲基化；MS-RE-PCR；MspⅠ/HpaⅡ；RT-PCR

表觀遺傳學的相關(guān)研究已經(jīng)成為很多領(lǐng)域關(guān)注的焦點[1]，DNA甲基化為常見的表觀遺傳學研究的內(nèi)容之一，是真核生物中影響基因表達的一種主要的修飾方式，在基因的時空特異性表達、自交不親和、胚胎發(fā)育和染色體穩(wěn)定性等方面扮演重要的角色[2]。DNA甲基化水平不足或過高，都會導致植物生長發(fā)育不正常和形態(tài)結(jié)構(gòu)異常。DNA甲基化主要通過參與植物基因表達的調(diào)控，調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育來發(fā)揮重要作用。DNA甲基化通過引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而抑制轉(zhuǎn)錄，進而調(diào)控基因表達[3]。當基因處于表達狀態(tài)時甲基化水平往往很低，隨著生長發(fā)育的進行需要將該基因關(guān)閉，就會在該基因的啟動子或編碼區(qū)發(fā)生甲基化，使基因轉(zhuǎn)錄受到抑制，基因失活，終止其表達。甲基化通常發(fā)生在胞嘧啶的C5位，而甲基化的胞嘧啶多位于CpG島上，形成5-甲基胞嘧啶(5mC)[4]。特定基因甲基化分析有多種方法，包括甲基化特異性PCR[5]，結(jié)合重亞硫酸鹽限制性分析[6～7]，基于Sanger法的重亞硫酸氫鹽測序[8]，以及甲基化敏感限制性內(nèi)切酶PCR(MS-RE-PCR)法等，其中MS-RE-PCR是一種重要方法，它利用不同限制性內(nèi)切酶對甲基化位點的敏感性差異特點對DNA進行酶切。該方法經(jīng)常用于分析植物mCCGG位點的甲基化水平[9～10]。

自交不親和(Self-incompatibility,SI)是指植物為了阻止自交促進異交來保持后代遺傳多樣性的一種系統(tǒng)。在很多被子植物中SI由S位點控制[11]。其中SRK基因是決定自交不親和反應(yīng)的雌性因子，它是S位點發(fā)現(xiàn)的第二個基因[12]，在開花前的柱頭乳突細胞中特異表達[13]。SRK基因的第3至第7個外顯子編碼它的激酶結(jié)構(gòu)域[14]，具有催化活性，能結(jié)合下游信號反應(yīng)分子，是SI信號傳導的關(guān)鍵。SRK基因的失活會導致植物自交親和。前人在甲基化對自交不親和的作用方面做了大量研究[9～10,15]。在扁桃(Amygdaluscommunis)中，因為轉(zhuǎn)錄的差異，SI品種中Sf-RNase被命名為Sfa[16]，但在SC品種中為Sfi[17]，而Sfa和Sfi在C1-C5編碼區(qū)及其側(cè)翼中核苷酸序列是一致的[16～18]。在其它的李屬(Prunus)中也存在具有相同的S基因型，但表型不同的現(xiàn)象[19～22]。這些現(xiàn)象均受到甲基化的影響。白菜(Brassicapekinensis)自交不親和株系的顯隱性關(guān)系也是由于甲基化的作用[4,23]。蕓薹(Coriandrumsativum)中顯性的SCR等位基因的轉(zhuǎn)錄沉默，主要是因為DNA甲基化影響了基因的表達[4]。很多研究表明DNA甲基化在植物自交不親和中扮演了重要的角色[9～10,15]。

菊科(Asteraceae)植物是典型自交不親和植物。在20世紀40年代就開始了菊科植物自交不親和的研究[24～25]，而對菊科自交不親和機理的研究從2000年開始[26]，在菊科植物千里光(Senecioscandens)中克隆了3個SRK基因[27]，但是未對其具體的功能進行分析研究。后來又在千里光中找到了一些在柱頭特異表達的基因[28～29]，基因功能仍未確定。至此菊科植物自交不親和機理仍然是未解之謎。燈盞花[Erigeronbreviscapus(Vant.) Hand.-Mazz]為菊科飛蓬屬(Erigeron)多年生植物，是云南省特有的藥用植物之一。前期研究表明，燈盞花的自交不親和反應(yīng)發(fā)生在柱頭表面，推測為孢子體型自交不親和[30]。但是燈盞花自交不親和性的研究還停留在現(xiàn)象觀察的層面，其SI機理沒有進行過分子層面的研究。本研究在克隆獲得燈盞花SRK基因的全長cDNA基礎(chǔ)上，從表觀遺傳學的角度，用MS-RE-PCR的方法對燈盞花SRK基因的兩個CCGG位點進行甲基化分析，并用RT-PCR檢測SRK基因不同組織表達情況，以期對燈盞花自交不親和的機制做進一步的探索。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為具有典型的自交不親和特征的燈盞花植株的新鮮葉片、莖、根以及不同花期(花蕾、開花前一天、盛花)的花序材料，采自云南紅河千山生物有限公司基地，樣品采集后立即置于液氮中，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 燈盞花基因組DNA和總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

用改良的CTAB法提取燈盞花的基因組DNA。把燈盞花的樣品洗凈晾干，放入預(yù)先滅菌的研缽中，加入液氮和β-巰基乙醇，快速磨碎后轉(zhuǎn)移至離心管中，加入預(yù)熱的CTAB充分混勻。提取的DNA用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測?？俁NA的提取采用TRIzol法，TRIzol試劑購自北京全式金公司，各取0.1g的組織液氮磨碎后進行提取。cDNA第一鏈合成試劑盒為TaKaRa的1st Strand cDNA Synthesis Kit，合成根據(jù)其提供的說明書進行。

1.3 燈盞花SRK基因目的片段擴增

本研究的前期克隆了燈盞花的SRK基因的全長cDNA序列，用該基因和NCBI上的其它物種的SRK基因進行比對。設(shè)計了一對包含2個CCGG位點的保守序列的特異性引物，由上海生工合成。上游引物SRK1F：5’-GGGTCTCAGATATTAATGATTCG-3’；下游引物SRK1R：5’-TAATACTCATAGCCAAACTCCAA-3’。PCR反應(yīng)體系25μL，其中ddH2O 11.8μL，10×buffer 5μL，10 mmol/L dNTP(含Mg2+)5μL，上、下游引物各1μL，模板1μL，Taq酶0.2μL。PCR反應(yīng)程序為：94℃。預(yù)變性5min；94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸2min，38個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR結(jié)束后用1.2%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 目的片段的克隆測序及限制性酶切分析

目的片段按照全式金回收試劑盒進行。回收的目的片段連接到pEASY-T1載體，連接體系5μL，室溫連接25min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。預(yù)先準備涂有Amp,X-gal和IPTG的平板備用。取80μL重懸菌涂布于備用的平板，正置30min后于37℃倒置培養(yǎng)12-14h。挑白色的單克隆做菌落PCR，檢測為陽性的單克隆在接種于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至適合濃度送上海生工測序。2μg gDNA用3μL的酶進行酶切；PCR產(chǎn)物的酶切體系為20μL，2μL的酶。用NEB公司的MspⅠ/HpaⅡ酶切后進行PCR擴增檢測酶切的效果。MspI和HpaII是同裂酶，即識別位點相同，切割位點也相同。當MspI和HpaII的識別序列CCGG中外部的C被甲基化時，MspI和HpaII均無法切割識別位點。但是，當識別位點內(nèi)部的C被甲基化時，MspI就能夠切割識別序列，而HpaII則不能。在實驗中可以根據(jù)酶切后條帶大小來判斷目的片段有無甲基化。

1.5 燈盞花SRK基因的實時熒光定量分析

Real-time RT-PCR反應(yīng)用熒光染料SYBR Green Ⅰ，GAPDH為內(nèi)參基因。上游引物為EbSRKF1:5’-GGGCAGAATCGGACCCTTAC-3’，下游引物為EbSRKR1:5’-TGAGACCCTTCTTCGTTGG-3’，目標片段95bp。PCR反應(yīng)體系20μL，反應(yīng)程序：擴增曲線反應(yīng)94℃ 30s，94℃ 20s，55℃ 20s，72℃ 30s，45個循環(huán)，72℃單點檢測信號。反應(yīng)結(jié)束后，60℃連續(xù)檢測信號產(chǎn)生溶解曲線。用Opticon monitor 3.1軟件進行數(shù)據(jù)的記錄和分析。每個樣品3次重復(fù)，滅菌水為空白對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 燈盞花基因組DNA和總RNA的提取

燈盞花基因組DNA提取后的凝膠電泳檢測如圖1，條帶單一清晰，無拖尾；紫外檢測OD260/OD280在1.8～2.0之間，CTAB法較適合燈盞花基因組DNA的提取，完全可以用來做后續(xù)試驗分析。從燈盞花里提取的總RNA，經(jīng)紫外檢測，OD260/OD280在1.8～2.0之間，說明RNA樣品中無雜質(zhì)污染，純度較高。電泳檢測的凝膠成像如圖2所示，28S，18S，5S條帶整齊清晰，28S的亮度約為18S的兩倍，說明所獲得的總RNA較完整，可以滿足后續(xù)的RT-PCR試驗所需。

圖1 燈盞花不同組織基因組DNA電泳圖

圖2 燈盞花不同組織總RNA電泳圖

2.2SRK基因目的片段擴增及序列分析

以燈盞花基因組DNA為模板，用SRK基因的cDNA序列設(shè)計的引物經(jīng)過PCR擴增，得到了1 285bp的片段(圖3)。

圖3 以燈盞花gDNA為模板的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖

克隆測序后發(fā)現(xiàn)，該片段有兩處CCGG位點，分別位于第100bp和第1 081bp。兩者相距978bp。和SRK基因的cDNA序列(圖4)相比，該片段包含3個內(nèi)含子序列(613-691bp、800bp-925bp、1 126bp-1 209bp)。圖中黃色、綠色、藍色、紅色各代表燈盞花SRK基因的第一、第二、第三、第四外顯子。

圖4 燈盞花SRK基因部分DNA序列

圖5 燈盞花SRK基因部分cDNA序列

對SRK基因的cDNA序列和DNA序列的矩陣圖對比見圖5。從上述比對矩陣圖可以明顯看出，gDNA中與cDNA相似的區(qū)域被分成4個部分。根據(jù)序列比對的細節(jié)情況，結(jié)合真核生物外顯子內(nèi)含子剪切位點特征，確定嚴格的分界點。

圖6 燈盞花SRK基因部分cDNA序列

大多數(shù)真核生物內(nèi)含子序列的兩端分別是GT和AG(GT/AG法則)，外顯子-內(nèi)含子剪切位點一般的特征序列規(guī)律是：5’端剪切位點：CAG/GTATTC或RG/GTRAGT(R表示嘌呤，斜杠“/”左側(cè)為外顯子)3’端剪切位點：TCCAG/G或NCAG/G(N表示任意堿基，斜杠“/”左側(cè)為內(nèi)含子)。結(jié)合以上特征序列規(guī)律和序列比對情況，確定了確切的外顯子-內(nèi)含子邊界(圖7)。

圖7 燈盞花SRK基因目的片段內(nèi)含子外顯子分析結(jié)果

2.3 燈盞花SRK基因目的片段的MspⅠ/HpaⅡ酶切及甲基化分析

燈盞花SRK基因目的片段的酶切電泳圖見圖8。

圖8 燈盞花SRK基因目標序列的甲基化分析

注：M為Marker DL2000 plus；1為以葉片gDNA為模板的PCR產(chǎn)物；2為MspⅠ酶切后的PCR擴增產(chǎn)物；3為HpaⅡ酶切后的PCR產(chǎn)物；4為MspⅠ酶切后的葉片gDNA;5為HpaⅡ酶切后的葉片gDNA;6為以MspⅠ酶切后的葉片gDNA為模板的PCR產(chǎn)物；7為以HpaⅡ酶切后的葉片gDNA為模板的PCR產(chǎn)物；8為以莖gDNA為模板的PCR產(chǎn)物；9為MspⅠ酶切后的PCR擴增產(chǎn)物；10為HpaⅡ酶切后的PCR產(chǎn)物；11為MspⅠ酶切后的莖gDNA;12為HpaⅡ酶切后的莖gDNA;13為以MspⅠ酶切后的莖gDNA為模板的PCR產(chǎn)物；14為以HpaⅡ酶切后的莖gDNA為模板的PCR產(chǎn)物；15為以花gDNA為模板的PCR產(chǎn)物；16為MspⅠ酶切后的PCR擴增產(chǎn)物；17為HpaⅡ酶切后的PCR產(chǎn)物；18為MspⅠ酶切后的花gDNA;19為HpaⅡ酶切后的花gDNA;20為以MspⅠ酶切后的花gDNA為模板的PCR產(chǎn)物；21為以HpaⅡ酶切后的花gDNA為模板的PCR產(chǎn)物。

Fig.8 The methylation analysis of the target fragment inSRKgene coding region

泳道1～7為以葉片所提的gDNA為材料進行的甲基化分析；8～14為以莖干所提的gDNA為材料進行的甲基化分析；15～21為以花序(開放前一天)所提的gDNA為材料進行的甲基化分析。點樣順序均一致。

由圖8可知，泳道1所示的以葉片gDNA為模板進行PCR可以得到清晰的目標帶(1 285bp)，泳道2和3是把泳道1的PCR產(chǎn)物進行酶切(MspⅠ和HpaⅡ)后的情況。目的片段被消化為3個片段，分別是100bp、982bp、203bp；泳道6和7均無特異性的目標譜帶擴出。在以莖干和花序所提的gDNA為材料進行的甲基化分析的結(jié)果也和前面的相同。譜帶分析表明葉片、莖干、花序的SRK基因目的片段內(nèi)的CCGG位點均可以被MspⅠ和HpaⅡ限制性酶切，說明這些CCGG位點均未發(fā)生甲基化(3’端和5’端均無甲基化)。圖8所示的交叉組合式的酶切和電泳結(jié)果表明在燈盞花的3種組織中SRK基因的部分編碼區(qū)可能不存在甲基化現(xiàn)象。

2.4 燈盞花不同組織SRK基因的qRT-PCR分析

對燈盞花的組織酶切實驗表明SRK基因在不同組織中都能被MspⅠ和HpaⅡ切開，說明SRK基因在這些組織中沒有發(fā)生甲基化。因此對燈盞花不同組織里的SRK基因的表達量進行了熒光定量PCR檢測，驗證酶切實驗的結(jié)果。

對燈盞花不同組織的qRT-PCR的分析如圖9。在燈盞花中的各個組織均有SRK基因的表達，莖和開花前一天的相對表達量最低；根、花蕾和盛花的表達量也較低，均為1.0左右；而葉中SRK基因的表達量最高，和其余樣品均有顯著性差異(P<0.05)。SRK基因在燈盞花不同組織中均有表達，但在SI反應(yīng)中的功能還需要進一步研究。

圖9 燈盞花不同組織中SRK基因的表達分析

3 結(jié)論與討論

植物DNA甲基化可以抑制基因的表達，當基因表達的時候甲基化程度很低，而生長發(fā)育到一定階段的時候會在該基因的啟動子或編碼區(qū)發(fā)生重新甲基化，基因失活[31]。植物的自交不親和是一個很復(fù)雜的過程，有很多的信號分子參與，例如SRK，SCR，SLG，ARC1，THL1/2等。對自交親和與自交不親和的種子的基因組DNA甲基化水平的研究揭示了在這兩類種子中全甲基化、半甲基化水平都有明顯差異，可能和它們的自交親和與否相關(guān)[32]。

本研究對燈盞花SRK基因的兩個CCGG位點進行甲基化研究。以基因組DNA為模板，研究前期克隆出的SRK基因的cDNA序列設(shè)計特異性引物進行PCR擴增，測序結(jié)果顯示該擴增片段包括第一外顯子的部分，第二外顯子、第三外顯子及第四外顯子的部分，對燈盞花三種組織中(葉、莖、花)的SRK基因的甲基化CCGG位點分析，表明在所選樣本的SRK基因片段中均不存在甲基化。

對甘藍(Brassicaoleracea)的SRK和SLG的甲基化分析發(fā)現(xiàn)，在這兩個基因的第一編碼區(qū)均不存在甲基化[9～10]。DNA甲基化在組織間特異性較強，甲基化程度和模式存在很大差異。自交親和與自交不親和的羽衣甘藍(Brassicaoleraceavar.acephalaf.tricolor)的葉片基因組DNA的甲基化分析發(fā)現(xiàn)兩者的甲基化存在差異，包括與自交不親和相關(guān)的SRK和SCR基因[15]，但沒有針對甲基化對SRK基因功能的影響進行研究。扁桃中Sf基因的甲基化研究認為該基因具有組織特異性[32～33]。MS-RE-PCR方法也存在局限性，一是由于所采用的酶不能有效地檢測外胞嘧啶的甲基化；二是對于非CCGG位點的胞嘧啶甲基化該方法也無法檢測。燈盞花具有典型的自交不親和特性，雖然在本研究中燈盞花SRK基因特定片段中沒有發(fā)現(xiàn)甲基化的現(xiàn)象，但不排除甲基化在基因的其它編碼區(qū)或者轉(zhuǎn)錄起始階段的調(diào)控作用。另一方面，研究中所用的酶只是針對CCGG位點有特殊的識別性，不能有效地檢測外胞嘧啶的甲基化。而對于非CCGG位點的胞嘧啶甲基化都不敏感無法檢測。在燈盞花自交不親和的過程中，是否由于甲基化或者去甲基化的作用使得和SI相關(guān)的基因被開啟或者關(guān)閉從而產(chǎn)生自交不親和的過程，這還需要進一步的研究。

本研究對葉片、莖干、花序(開花前一天)分析表明3種組織的SRK基因的CCGG位點均未甲基化，但對燈盞花不同組織的SRK基因進行的RT-PCR分析結(jié)果表明：在測試的6個樣品中都有SRK基因的表達，表達量卻有顯著的差異性。其中葉片中表達量最高，莖和開花前一天的表達量最低，根和花蕾及盛花的表達量居中。本實驗選取的是SRK基因的片段，甲基化的分析存在局限性，因此對燈盞花不同組織的SRK基因的甲基化分析還需要進一步深入，包括啟動子功能、非CCGG位點的胞嘧啶甲基化、甲基化在轉(zhuǎn)錄起始階段的調(diào)控作用、SRK基因甲基化的特異性等，進一步闡述SRK基因在燈盞花自交不親和的作用及功能。

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Methylation Analysis on the Coding Region of Self-incompatibilitySRKGene ofErigeronbreviscapus

ZHANG Wei1,2,MENG Heng-ling2,MENG Zhen-gui1,LIANG Quan1,WEI Xiang2,YANG Sheng-chao1

(1.Yunnan Research Center on Good Agricultural Practices for Dominant Chinese Medicinal Materials,Yunnan Agricultural University,Kunming Yunnan 650201,P.R.China;2.Yunnan Honghe College,Mengzi Yunnan 661100,P.R.China)

The study was conducted to identify the variation of DNA methylation ofSRK(EbSRK) gene.With the method of methylation sensitive restriction endonucleases PCR,the methylation of CCGG locus in theEbSRKgene was analyzed,and the expression ofEbSRKgene in different tissues was detected by RT-PCR.The results showed that there was no methylation in two CCGG locus ofEbSRKgene,and it was sighificantly different whenEbSRKgene was expressed in different tissues.This indicates that the inhibition ofEbSRKgene was not caused by CCGG methylation in theEbSRKgene,but by other regulatory mechanisms.

Erigeronbreviscapus;S-locus receptor kinase gene (SRK); DNA methylation; Methylation sensitive restriction endonucleases PCR (MS-RE-PCR);MspⅠ/HpaⅡ; RT-PCR

10.16473/j.cnki.xblykx1972.2016.06.002

2015-10-21

國家自然科學基金(81160499)，國家自然科學基金(81503184)，云南省中青年學術(shù)和技術(shù)帶頭人后備人才2016。

張薇(1977-)，女，博士研究生，主要從事藥用植物資源及其利用研究。E-mail：zw_biology2@126.com

簡介：楊生超(1972-)，男，教授，博士生導師，主要從事藥用植物資源及其利用研究。E-mail：shengchaoyang@163.com

S 567

A

1672-8246(2016)06-0008-07