張人 / 復旦大學分析測試中心

拉曼光譜液體樣品檢測過程的標準化設(shè)計與影響因素分析

張人 / 復旦大學分析測試中心

介紹了拉曼光譜液體樣品毛細管檢測法，研究了毛細管的管徑以及毛細管內(nèi)不同空間位置對于信號強度的影響，明確了獲得最優(yōu)信號強度的空間位置，并給出了標準化檢測步驟。實驗結(jié)果的統(tǒng)計分析驗證了毛細管法能夠獲取具有高重復性的實驗結(jié)果。

拉曼光譜；液體樣品；毛細管；標準化檢測

0 引言

拉曼光譜是一種基于分子極化率變化的分子振動光譜，具有無損、高靈敏度、高分辨率、可在線檢測等優(yōu)點，被越來越廣泛應(yīng)用到包括醫(yī)藥、化工、公共安全、新材料及納米科技等各個行業(yè)。拉曼光譜不需制樣便可檢測包括水溶液的液體樣品，可定性及定量地提供相關(guān)溶液所包含的溶質(zhì)及溶劑的物質(zhì)種類信息。JY/T 002-1996《激光喇曼光譜分析方法通則》及正在修訂的《激光拉曼光譜分析方法通則》征求意見稿提出了液體樣品檢測的指導意見，包括使用毛細管樣品檢測法。然而因市售毛細管種類眾多，且上述指導意見未明確標準化操作，因此在實際檢測過程中因毛細管規(guī)格的不同造成對樣品檢測結(jié)果的不一致。本文通過研究拉曼光譜液體樣品毛細管檢測法中多種毛細管因素對實驗結(jié)果的影響，提出了一種標準化檢測流程。

1 測量系統(tǒng)的構(gòu)成

液體樣品的拉曼光譜毛細管檢測系統(tǒng)由拉曼光譜儀的顯微系統(tǒng)（物鏡）和毛細管構(gòu)成，如圖1（A）所示。整個系統(tǒng)置于減震平臺上，毛細管置于固定裝置后固定于顯微鏡下。若液體為易揮發(fā)樣品或易于流動，需封閉毛細管的兩個端口。將毛細管放置于顯微物鏡下，通過物鏡的觀察調(diào)節(jié)物鏡臺，將物鏡焦點置于液體內(nèi)部。通過拉曼光譜儀控制軟件，設(shè)定激光波長、檢測范圍和掃描時間等參數(shù)，并控制拉曼光譜信號的采集。圖1（B）為毛細管內(nèi)部空間示意圖，中間的三角錐代表入射激光，同時將毛細管內(nèi)與入射光平行的方向(y)計為垂直徑向方向，與入射光垂直的方向(x)計為平行軸向方向。

圖1 (A)顯微拉曼光譜儀毛細管檢測系統(tǒng)；(B) 毛細管內(nèi)部空間示意圖

本文所用拉曼光譜儀型號為Horiba Jobin Yvon公司的XploRA，激光波長選為785 nm，測量光譜范圍設(shè)定為200-1 800 cm-1，信號采集方式為180°背散射檢測。被檢測物品為國藥集團生產(chǎn)的分析純無水乙醇，并以拉曼散射位置在875.8 cm-1的C-C-O骨架伸縮振動峰用作記錄信號強度的標記峰[1]。

2 方法依據(jù)與方法分析

拉曼光譜液體樣品毛細管檢測法，因毛細管在使用過程中便捷，所需樣品量少（一至幾十微升），對檢測時間無要求（暴露環(huán)境中的液體因不斷揮發(fā)，會導致檢測時間短且不穩(wěn)定），可以再次回收樣品等特點，使其成為實際檢測操作的首選方法。但在樣品檢測過程中，因拉曼光譜儀的共焦設(shè)計[2]提供信號的空間約為直徑10 μm、長度數(shù)十微米的圓柱狀[3]，而毛細管的直徑有數(shù)百微米至毫米數(shù)種規(guī)格，且毛細管管壁對入射激光具有散射作用而影響入射光強，故需考察毛細管的管徑與毛細管內(nèi)部的空間布局對信號強度的影響，以明確不同檢測條件下所測結(jié)果的可比性。

根據(jù)上述要求，如果將激光焦點移動定位至毛細管管徑截面圓心，因激光焦點距離管壁最遠，受管壁影響最小，且能夠獲得整個檢測空間的信號，故可以獲得最強的散射信號。實際操作中可以發(fā)現(xiàn)，當處于截面圓心位置時，恰好能夠在物鏡中觀察到如圖2（A）所示的清晰毛細管內(nèi)徑側(cè)壁的像，故可以利用該聚焦位置進行檢測標準化設(shè)計?；谏鲜隼碚撛O(shè)想與操作特點，本文以毛細管截面圓心位置為出發(fā)點，比較周圍空間的拉曼散射信號的強度變化情況，進而對JY/T 002-1996《激光喇曼光譜分析方法通則》及正在修訂的《激光拉曼光譜分析方法通則》征求意見稿中的推薦方法進行標準化操作探討。

2.1 測量步驟

1）用毛細管吸取被檢測溶液；

2）將毛細管置于毛細管架上；

3）將毛細管置于拉曼光譜儀的物鏡下；

4）調(diào)節(jié)樣品平臺位置，將毛細管準確定位于物鏡焦點下方；

5）調(diào)節(jié)樣品平臺高度，將物鏡焦點推至毛細管內(nèi)部；

6）精細調(diào)節(jié)樣品臺的位置與高度，使得物鏡視野內(nèi)能清晰觀察到如圖2（A）所示的毛細管內(nèi)徑側(cè)壁像，且將焦點位置移至內(nèi)鏡像的中心位置；

7）在拉曼光譜儀中設(shè)定好檢測范圍、掃描時間和激光波長等參數(shù)后開始檢測，獲取如圖2（B）所示的拉曼散射信號（被標記處信號峰為C-C-O骨架伸縮振動，用于記錄散射信號）。

圖2 (A)顯微鏡下觀察到的毛細管內(nèi)徑成像；(B)無水乙醇的拉曼散射光譜圖

2.2 管徑的影響

為了研究不同直徑的毛細管對于拉曼信號強度的影響，本文選取了5種毛細管（如圖3（A）所示），管徑均值分別為0.3 mm、0.5 mm、1 mm、1.8 mm和5 mm（5 mm管為核磁管，已無毛細效應(yīng)，用于比較管徑的影響）。在吸取適量的無水乙醇后，按本文2.1的測量步驟進行信號采集，信號強度與管徑關(guān)系如圖3（B）所示。從圖3（B）中可以看到，隨著管徑的增大信號逐漸增強，當管徑為1.8 mm時信號最強，增大至5 mm時信號略下降，其原因可能在于激光光柱受小管徑毛細管管壁的散射要大于大直徑毛細管管壁的散射，從而使得照射在采樣區(qū)的激光強度下降，導致信號隨管徑的減小而下降。

2.3 毛細管水平徑向位置的影響

拉曼光譜采樣信號界面大約為數(shù)微米，因而需考慮毛細管水平徑向方向（圖1（B）中x軸）是否對強度也有明顯影響。為了考察該問題，如圖4（A）所示，對直徑為1 mm的毛細管該方向進行超過30個點的掃描，并將強度記錄成隨水平徑向分布的圖形如圖4（B）所示。從圖4（B）中可以看到，在水平徑向中心位置（橫坐標0點即毛細管橫截面圓心位置處）至兩側(cè)一定范圍內(nèi)的強度基本保持穩(wěn)定，但在超出該范圍后強度迅速下降。該結(jié)果表明，在毛細管水平徑向位置中線上是強度最高的點，同時在一定水平位置空間內(nèi)能夠保持信號穩(wěn)定。

為了進一步考察不同管徑的毛細管在水平徑向位置上的信號強度分布情況，5種不同管徑的毛細管吸取無水乙醇后進行了跨度為6 mm（-3～3 mm）的水平掃描，結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看到，管徑越大，所能提供的水平徑向檢測空間越寬，管徑5 mm的毛細管比管徑1 mm的檢測空間寬大約4倍，比0.3 mm的大約7倍。其原因可解釋為管徑越大截面圓心離管壁越遠，故檢測空間越大。但需要指出的是，當管徑增大時，一方面毛細管效應(yīng)下降，另一方面樣品需求量上升明顯，所以在實際使用中需要綜合考慮所用毛細管的規(guī)格。

圖3 (A)不同管徑的毛細管；(B)不同毛細管管徑系統(tǒng)下測得的乙醇信號強度

圖4 水平徑向方向的強度分布(A)毛細管內(nèi)徑圖；(B)水平徑向方向上的檢測強度分布

圖5 不同毛細管管徑系統(tǒng)下的水平徑向檢測范圍

圖6 徑向垂直方向的強度分布

2.4 毛細管縱軸徑向位置的影響

由于毛細管縱軸徑向方向（圖1（B）中y軸）與激光入射方向重疊，且激光的采樣空間在縱軸方向的分布更廣（約數(shù)十至數(shù)百微米）[3]，故拉曼信號強度可能對縱軸方向的空間變化更敏感。根據(jù)上述推測，沿縱軸徑向不同位置進行采樣，將所得信號強度與其所處位置作圖，如圖6所示。從圖6中可以看到，確如預期縱軸徑向隨離圓心位置有明顯的信號強度衰減，其信號衰減速度大于水平徑向位置上的衰減速度，在偏離中心位置100 μm處便出現(xiàn)了明顯的信號下降，說明在縱軸徑向位置更需要標準化操作設(shè)計，即將觀察到明確的毛細管內(nèi)徑管壁像時才能確認激光焦點聚焦于毛細管截面中心，進而獲取最優(yōu)的拉曼光譜信號。

3 統(tǒng)計分析

明確激光焦點位置聚焦在毛細管界面圓心位置能獲取最優(yōu)的拉曼光譜信號后，尚需考察毛細管檢測系統(tǒng)的檢測重復性。在保持相同的實驗條件下，本文對拉曼光譜的強度進行了51次重復測試，相關(guān)統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。從表1中可以看到，51次測量的相對標準偏差為2.08%，從之前的實驗結(jié)果來看，該結(jié)果可能與毛細管的品質(zhì)直接相關(guān)。若能夠提升毛細管的品質(zhì)，如管徑和管壁厚度的均一度，或能進一步降低相對標準偏差，從而使得毛細管檢測體系能夠更加準確地應(yīng)用于定量檢測。

表1 同一規(guī)格的毛細管多次采樣的統(tǒng)計數(shù)據(jù)

4 結(jié)語

本文就JY/T 002-1996及正在修訂的《激光拉曼光譜分析方法通則》征求意見稿中所推薦的拉曼光譜液體樣品毛細管檢測法進行了檢測操作標準化設(shè)計，研究了相關(guān)毛細管參數(shù)及儀器檢測參數(shù)對檢測結(jié)果的影響，并依據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析了該標準化操作下的實驗誤差。實驗結(jié)果表明，拉曼光譜液體樣品毛細管檢測法能夠穩(wěn)定有效地提供被測樣品的拉曼光譜信號，但需要對指導方法補充的是在檢測過程中對檢測空間進行標準化的選取，即在光學成像輔助下使激光焦點聚焦到毛細管的截面圓心位置，才能獲得高穩(wěn)定性、高重復性、高強度的拉曼光譜信號，從而使拉曼光譜液體樣品毛細管檢測法更好地適用于各個應(yīng)用領(lǐng)域。

[1]F R 多林希.有機化合物的特征拉曼頻率[M].北京：中國化學學會，1980.

[2]楊序綱.拉曼光譜的分析與應(yīng)用[M].北京：國防工業(yè)出版社，2008.

[3]R Tabaksblat，R J Meier and B J Kip.Confocal raman microspectroscopy - theory and application to thin polymer sample[J].Applied Spectroscopy，1992（46）：60-68.

Standardized design of liquid sample testing process based on Raman spectra and its influencing factors

Zhang Ren
（Analysis and testing center of Fudan University）

This paper introduces the capillary testing method of liquid samples based on Raman spectra, investigates the influence of capillary diameter and different spatial position within the capillary on signal intensity, definds the spatial position to achieve the optimized signal intensity and the standardized testing process.Following the process, testing experiments are carried out.Statistics analysis results of the experiments show that the capillary method could obtain a good testing repeatability.

Raman spectra; liquid sample; capillary; standardized test