杜雪飛，葛以躍，祁賢

1. 南京市疾病預(yù)防控制中心，南京 210009； 2. 江蘇省疾病預(yù)防控制中心，南京 210009

·論著·

2013—2014年南京市流感病毒H3N2亞型血凝素分子遺傳特性分析

杜雪飛1，葛以躍2，祁賢2

1. 南京市疾病預(yù)防控制中心，南京 210009； 2. 江蘇省疾病預(yù)防控制中心，南京 210009

2013—2014年南京市流感病原監(jiān)測系統(tǒng)分離到31株流感病毒H3N2亞型毒株，通過提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)擴增血凝素(hemagglutinin，HA)基因片段，進行PCR產(chǎn)物純化、測序并分析其遺傳進化特征。結(jié)果顯示，31株分離株與疫苗株A/Texas/50/2012之間的核苷酸和氨基酸進化距離分別為0.010 2和0.012 1，核苷酸和氨基酸的同源性分別為97.9%～99.6%和97.2%～99.3%。遺傳進化分析表明，分離株的HA基因分屬不同的進化分支，3株2013年分離株屬3B基因型，3株2014年分離株屬3C.1基因型，2株2014年分離株屬3C.2b基因型，其余23株屬3C.3a基因型。與疫苗株相比，分離株的分子特征表現(xiàn)為發(fā)生N128A/T和P198S/A(去信號肽排列)氨基酸位點變異，均位于抗原決定簇B；分離株抗原決定簇上發(fā)生變異的位點共計24個；7株分離株出現(xiàn)126 NWT糖基化位點，3株分離株糖基化位點45NSS和144NNS消失。結(jié)果提示， 2013—2014年南京市流感病毒H3N2亞型的HA基因較疫苗株發(fā)生了較大變異，疫苗對病毒的預(yù)防效果需重新評估。

流感病毒H3N2亞型；血凝素；分子特征

自1968年以來，甲型H3N2亞型流感病毒一直是人類季節(jié)性流感的重要病原。在人群免疫壓力下，抗原漂移成為H3N2亞型變異的主要方式，也是持續(xù)引起流行的主要動因[1]。甲型流感病毒抗原變異中，以血凝素(hemagglutinin，HA)基因最重要，分析HA基因序列可在分子水平了解甲型流感病毒的變異特點和規(guī)律。南京市2009—2013年流感監(jiān)測結(jié)果顯示，除2010年春季和2011年季節(jié)性H3N2流感呈低水平散發(fā)外，其他時段均有季節(jié)性H3N2流感流行[2]。本研究選取南京市2013—2014年不同地區(qū)、不同時間段的31株季節(jié)性流感病毒H3N2亞型(2013年15株、2014年16株)進行HA基因特性分析，旨在了解H3N2亞型的變異情況，為流感防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

甲型H3N2亞型流感病毒毒株來自南京市流感監(jiān)測哨點醫(yī)院。2013年1月—2014年12月采集流感病例咽拭子標本，流感樣病例的納入標準按中國疾病預(yù)防控制中心(Chinese Center for Disease Control and Prevention，CDC)國家流感中心公布的標準。

1.2 樣本采集及病毒分離

收集流感樣病例咽拭子標本，提取病毒RNA，采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)對流感病毒的型別進行鑒定。陽性標本經(jīng)MDCK細胞培養(yǎng)擴增后，上清液置于-80 ℃保存。

1.3 病毒HA基因片段PCR擴增

提取病毒核酸，采用Invitrogen公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用自行設(shè)計的引物對HA全基因進行PCR擴增。PCR擴增體系：總體積為50 μL。擴增程序：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。4 ℃ 保存。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測和鑒定，凝膠回收PCR產(chǎn)物并純化，純化產(chǎn)物經(jīng)測序儀完成測序。

1.4 基因序列分析

測序結(jié)果用CExpress軟件進行比對拼接，獲得全長HA基因序列。從NCBI Influenza Virus Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/nph-select.cgi?go=database)中選取2013—2014年全球不同地區(qū)流感病毒H3N2參考毒株(特別是中國和亞洲分離株)的HA序列，包括世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)推薦的2013—2014年疫苗毒株A/Texas/50/2012(H3N2)。

采用MEGA 5.2.1 軟件對序列進行比對(Clustal W)，采用FastTree 軟件的GTR+GAMMA模型構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，并進行基因和氨基酸變異分析。利用在線軟件NetNGlyc 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc)對HA基因編碼的氨基酸序列進行糖基化位點預(yù)測。

2 結(jié)果

2.1 同源性分析

用MEGA軟件計算分離毒株與疫苗株HA基因的核苷酸和氨基酸平均遺傳距離，分別為0.010 2和0.012 1；與疫苗株核苷酸和氨基酸的同源性分別為97.9%～99.6%和97.2%～99.3%。

2.2 HA基因系統(tǒng)進化樹分析

對31株流感病毒H3N2分離株的HA基因構(gòu)建核苷酸進化樹(圖1)。其中3株2013年分離株(A/Jiangsutinghu/1268/2013、A/Jiangsuchongchuan/1423/2013和A/Jiangsuchongchuan/12237/2013)屬3B基因型，3株2014年分離株(A/Jiangsutinghu/1448/2014、A/Jiangsutinghu/1351/2014和A/Jiangsuqingpu/152/2014)屬3C.1基因型，2株2014年分離株(A/Jiangsudanyang/159/2014和A/Jiangsuquanshan/1258/2014)屬3C.2b基因型，其余23株屬3C.3a基因型。3C.1基因型平均遺傳距離包含WHO推薦疫苗株A/Texas/50/2012和3株2014年南京分離株，均有S45N、T48I、K62E、A198S、T212A和V223I氨基酸變異。在3C.1基因型毒株變異的基礎(chǔ)上，23株3C.3基因型分離株(包括2013年的13株和2014年的10株)發(fā)生T128A和R142G氨基酸變異。與3C.1基因型相比，3B基因型缺少糖基化位點45NSS和144NSS； 兩者HA基因核苷酸和氨基酸的平均遺傳距離分別為0.027和0.032。3C.1與3C.3基因型毒株之間HA基因核苷酸和氨基酸的平均遺傳距離分別為0.012和0.014。

注：圖中標尺值0.005代表單位長度內(nèi)核苷酸差異水平；●代表WHO推薦的疫苗株；▲表示南京分離株。

圖1 2013—2014年南京市流感病毒H3N2亞型的HA基因系統(tǒng)進化樹

Fig.1 Phylogenetic analysis of influenza A virus H3N2 subtype strains isolated from Nanjing city during 2013-2014

表1 2013—2014年南京市流感病毒H3N2亞型分離株的抗原位點變異分析

Tab.1 Antigenic variants of influenza A virus H3N2 subtype strains isolated from Nanjing city during 2013-2014

毒株名稱抗原位點(以H3亞型HA1序列為編號標準)A138142144145150B128159194198C454850278279312D182214217E629194262A/Texas/50/12ARNNRNFLPNIEKSSVIIESYSJs/1690/13-G-S-A--S-------------Js/32/13-G-S-A--S------IT----Js/1544/13-G-S-A--S------------Js/1423/13--K--T--AST-N-N---K---Js/12237/13--K--T--AST-N-N---K---Js/1398/13-G-S-A--S------------Js/38/13-G-S-A--S------------Js/1239/13-G-S-A--S------------Js/113/13-G-S-A--S--------V---Js/1341/13-G-S-A--S------------Js/1189/13-G-S-A--S------------Js/11752/13-G-S-A--S------------Js/1268/13--K--T-PASTKNYN---K---Js/149/13-G-S-A--S-------------Js/119/13-G-S-A--S-------------Js/116/14-G-S-A--S-------------Js/1448/14-----T--S-------------Js/1408/14-G-S-A--S-------------Js/159/14---S-T--S-----------H-Js/12486/14SG-S-AS-S---------G---Js/1351/14SG-S-AS-S------------Js/11383/14SG-S-AS-S------------Js/11692/14SG-S-AS-S------------Js/1780/14SG-S-AS-S------------Js/1839/14-G-STA--S---------N-KJs/111/14-G-S-A--S------------Js/152/14---S-T--S------------Js/1484/14-G-S-A--S------------Js/1258/14---S-T--S----------H-Js/1165/14-G-S-A--S------------Js/1122/13-G-S-A--S------------

2.3 HA分子特征分析

31株H3N2南京分離株的裂解位點序列為PEKQTR↓G，與參考株比對未發(fā)生變異，屬于低致病力流感病毒。HA蛋白發(fā)生41處位點變異(按去信號肽HA氨基酸序列排序)，其中31株均發(fā)生變異的位點為N128A/T和P198S/A，發(fā)生變異頻率較高的位點有R142G、N145S。本研究分離株的41處氨基酸變異位點中，32處位于HA1區(qū)，9處位于HA2區(qū)，分別占78.05%與21.95%。季節(jié)性流感病毒H3N2 HA蛋白的5個抗原決定簇(包括A、B、C、D和E)均分布于HA頭部重鏈HA1區(qū)[3]?？乖瓫Q定簇內(nèi)的氨基酸替換可能引起HA蛋白發(fā)生抗原漂移。本研究中分離株抗原決定簇上發(fā)生變異的位點共計24個(位于抗原決定簇A者5個、B者4個、C者6個、D者5個、E者4個)(表1)。流感病毒HA蛋白與宿主細胞表面受體結(jié)合是感染發(fā)生的關(guān)鍵步驟，HA蛋白的受體結(jié)合特性是流感病毒宿主限制性的一個重要決定因素[4]。HA蛋白的受體結(jié)合部位呈口袋狀，位于HA1分子的球區(qū)末端，98、153位氨基酸側(cè)鏈構(gòu)成其底部，183、190、194位氨基酸構(gòu)成其后壁，左壁和前壁分別由225～228、130～137位氨基酸構(gòu)成[5]。本研究中1株分離株發(fā)生L194P變異，5株發(fā)生N225D變異，1株發(fā)生N225S變異。

HA蛋白糖基化位點在穩(wěn)定HA三維結(jié)構(gòu)和誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護性抗體方面起一定作用，其增加或減少對病毒的生物學(xué)特性均有一定影響[6]。7株測序毒株與疫苗株相比發(fā)生了N128T變異，出現(xiàn)126 NWT糖基化位點。2013年3株分離株均發(fā)生N45S和N144K變異，導(dǎo)致糖基化位點45NSS和144NNS消失。

3 討論

自1968年流感流行以來，H3N2亞型由于基因突變發(fā)生頻率較高，一直是引起人群感染的主要型別。2013—2014年中國流感監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，季節(jié)性H3N2亞型流感病毒成為南方省份流感流行的優(yōu)勢毒株。本研究中2013—2014年南京分離株與疫苗株A/Victoria/361/2011 HA核苷酸、氨基酸的同源性小于國內(nèi)其他地區(qū)的報道[7]，可能與病毒表面蛋白變異加快有關(guān)。

一般認為，具有流行病學(xué)意義的流感病毒變種要存在一定抗原差異，HA1蛋白上至少有4個以上氨基酸發(fā)生替換，這些氨基酸替換需涉及2～3個抗原決定簇。上述氨基酸的替代可導(dǎo)致病毒抗原漂移[3,8]。與疫苗株相比，除1株分離株氨基酸位點變異僅涉及抗原決定簇B外，其余分離株涉及的抗原決定簇分別為2～5個，滿足流感病毒新的變種要求。突變頻率較高的HA變異位點N128A、R142G、N145S和P198S在Wedde等[9]的研究中也被發(fā)現(xiàn)。有研究表明，HA基因的T128A突變與兒童高病死率相關(guān)[10]。本研究中24株發(fā)生N128A突變，7株發(fā)生N128T突變，應(yīng)繼續(xù)加強對HA基因抗原位點變異的監(jiān)測。以疫苗株為參考，本研究通過分析HA1蛋白抗原位點的氨基酸變異情況，提示流行株的抗原性可能發(fā)生變化，但需通過抗原性實驗來驗證流行株是否發(fā)生了抗原漂移。

流感病毒HA蛋白的糖基化對其抗原性和受體結(jié)合能力均有重要影響，可促進病毒進化[11-12]。本研究中分離株HA的固定糖基化位點共10個，另外出現(xiàn)3個位點改變。HA的氨基酸變異未涉及糖基化位點、抗原決定簇和受體結(jié)合位點者16個，其作用目前還不清楚[13]。

通過初步分析，本研究獲得了南京市2013—2014年季節(jié)性H3N2亞型流感病毒的HA蛋白分子特征，其抗原位點、受體結(jié)合位點和糖基化位點的改變在一定程度上驅(qū)使其成為2013—2014年的優(yōu)勢毒株。

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. QI Xian, E-mail: qixiansyc@hotmail.com

Molecular characteristics of hemagglutinin of influenza A virus H3N2 subtype, 2013-2014, Nanjing

DU Xuefei1, GE Yiyue2, QI Xian2

1.NanjingCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanjing210009,China；2.JiangsuProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanjing210009,China

A total of 31 representative strains of influenza A virus H3N2 subtype isolated at different time and regions in Nanjing between 2013 and 2014 through influenza pathogen monitoring system were selected for this study. The genetic distance between the vaccine strain A/Texas/50/2012 and the isolated group at nucleotide and amino acid levels were 0.010 2 and 0.012 1, respectively. The similarities of nucleotide and amino acid sequence were 97.9%-99.6% and 97.2%-99.3%, respectively. The phylogenetic analysis showed that hemagglutinin (HA) gene of 31 isolates could be divided into several groups. Three 2013 strains belonged to 3B, three 2014 strains belonged to 3C.1, two 2014 strains belonged to 3C.2b and the other 23 strains belonged to 3C.3a. Compared with the vaccine strain, the accumulated mutations on epitopes reached 24. The amino acid substitutions of N128A/T and P198S/A on HA in 31 isolates were observed. A new glycosylation site 126 NWT occurred in 7 isolates, and 45NSS and 144NNS glycosylation sites disappeared in 3 isolates. The results suggest that HA gene of H3N2 has a significant variation compared to the vaccine strain, and this may be related to the vaccine prevention program in Jiangsu Province during 2013-2014.

Influenza A virus H3N2 subtype; Hemagglutinin; Molecular characteristic

國家自然科學(xué)基金(81501785)，江蘇省自然科學(xué)基金(BK20131450)，南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展專項資金(YKK10129)

祁賢

2016-08-23)