郭 珮,冉建華,李 靜,陳地龍,楊寶學(xué),何 菲,熊 偉,石雪萍,李海星

(重慶醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織細(xì)胞工程與干細(xì)胞研究室；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室；3.神經(jīng)科學(xué)研究中心,重慶 400016； 4.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系,北京 100191)

注射用核糖核酸Ⅱ上調(diào)p53誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞凋亡

郭 珮1,2,冉建華2,3,李 靜1,陳地龍1,楊寶學(xué)4,何 菲2,3,熊 偉1,石雪萍1,李海星1

(重慶醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織細(xì)胞工程與干細(xì)胞研究室；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室；3.神經(jīng)科學(xué)研究中心,重慶 400016； 4.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系,北京 100191)

目的 研究注射用核糖核酸Ⅱ誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞系K562和KG1a細(xì)胞凋亡的作用。方法 以K562和KG1a細(xì)胞為研究對象，采用CCK-8法檢測注射用核糖核酸Ⅱ?qū)?xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率的變化；Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞核形態(tài)；免疫印跡技術(shù)檢測p53及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)。結(jié)果 以100～300 mg·L-1注射用核糖核酸Ⅱ處理K562和KG1a細(xì)胞12、24、48 h后，CCK-8檢測結(jié)果顯示K562和KG1a細(xì)胞的增殖降低，抑制率明顯增高，并呈時間劑量依賴性；100、150、200 mg·L-1注射用核糖核酸Ⅱ處理K562和KG1a細(xì)胞24 h后，F(xiàn)CM結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡率隨藥物劑量增加而增高；Hoechst 33258染色觀察到細(xì)胞核出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮聚集、染色加深等凋亡指征；Western blot結(jié)果顯示，注射用核糖核酸Ⅱ上調(diào)p53、Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2表達(dá)。結(jié)論 注射用核糖核酸Ⅱ通過上調(diào)p53，調(diào)控Bcl-2/Bax的表達(dá)，激活caspase-3誘導(dǎo)人白血病K562和KG1a細(xì)胞凋亡。

注射用核糖核酸Ⅱ;白血病;p53;K562細(xì)胞；KG1a細(xì)胞; 凋亡

白血病是以惡性克隆性白血病細(xì)胞增殖異常、分化障礙、凋亡受阻和正常造血受抑制為特點(diǎn)的造血系統(tǒng)惡性疾病，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，與染色體斷裂、易位所引起的癌基因激活、抑癌基因失活等多種因素有關(guān)[1]。臨床上，白血病的分型復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。目前的治療手段以化療為主而療效欠佳，需要尋找新的治療藥物。

注射用核糖核酸Ⅱ(商品名BP素)是從牛胰腺提取的高純度、具有生物活性的核糖核酸，有抗腫瘤和提高免疫功能的作用[2]。臨床上，采用注射用核糖核酸Ⅱ治療肝癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌及宮頸癌等已有報道，而對白血病的治療及機(jī)制研究極為有限。此前有研究發(fā)現(xiàn)注射用核糖核酸Ⅱ具有抑制白血病K562細(xì)胞增殖的作用，而對正常細(xì)胞無明顯影響，其作用機(jī)制不清[3]。目前對注射用核糖核酸Ⅱ治療機(jī)制的研究證實(shí)，其除了具有提高免疫功能的作用外，抑制腫瘤細(xì)胞DNA的復(fù)制也是其重要的抗腫瘤機(jī)制之一[4]。DNA損傷激活凋亡相關(guān)信號通路、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是多種抗癌藥物療效的重要機(jī)制[5]。p53作為腫瘤抑制因子，在DNA損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中具有關(guān)鍵作用[6]。注射用核糖核酸Ⅱ抑制K562細(xì)胞增殖的作用是否與誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡有關(guān)尚未見報道。因此我們的研究擬通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證注射用核糖核酸Ⅱ?qū)Π籽〖?xì)胞系K562和KG1a細(xì)胞的增殖抑制作用，以及對細(xì)胞凋亡的影響，并檢測p53及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，探討注射用核糖核酸Ⅱ治療白血病的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料和試劑 人白血病細(xì)胞株(K562細(xì)胞)來源于 ATCC；人白血病細(xì)胞株(KG1a細(xì)胞)為重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)系血液學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈；注射用核糖核酸Ⅱ(BP素，規(guī)格50mg)由吉林敖東藥業(yè)集團(tuán)延吉股份有限公司提供；胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Hochest 33258染液、青霉素-鏈霉素溶液(100 X)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型)、RIPA裂解液(強(qiáng))、PMSF(100 nmol·L-1)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；6孔板和96孔板購自Falcon Plastics 公司； CCK-8試劑盒(cell counting Kit-8)購自日本株式會社同仁化學(xué)研究所；β-actin抗體、兔抗人IgG抗體購自巴傲得生物科技有限公司； p53、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3抗體購自沈陽萬類科技有限公司；PVDF膜和ECL顯色劑購自Miliproe公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人白血病K562和KG1a細(xì)胞培養(yǎng)基體系由90% RPMI 1640培養(yǎng)基加10%胎牛血清再加1%青霉素-鏈霉素溶液混合組成。所有細(xì)胞均置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，每隔24 h觀察細(xì)胞狀態(tài)，每2～3 d換液傳代。

1.2.2 注射用核糖核酸Ⅱ的配制 將500 μL高溫消毒后的DEPC水加入50 mg的注射用核糖核酸Ⅱ粉末中使之充分溶解，配制成濃度為100 g·L-1的儲存液，-20℃儲存。實(shí)驗(yàn)前以100 mL·L-1的胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

1.2.3 CCK-8方法檢測K562和KG1a細(xì)胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期的K562或KG1a 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×109·L-1，取1 mL稀釋至25 mL接種于96孔板，每孔200 μL。設(shè)空白對照組：10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基；Control組：含有細(xì)胞10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基；注射用核糖核酸Ⅱ組：加入終濃度為100、150、200 mg·L-1的注射用核糖核酸Ⅱ；每組分別設(shè)5個復(fù)孔。培養(yǎng)12、24、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8 工作液，輕輕震蕩使之混勻，于37℃、5% CO2飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)2 h。在450 nm波長處檢測各孔吸光度值(A值)，并計算細(xì)胞生長抑制率和各時間點(diǎn)的半數(shù)抑制濃度(half inhibitory concentration，IC50)，以IC50為標(biāo)準(zhǔn)確定藥物最適作用濃度和時間，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

抑制率/%=(AControl組-A注射用核糖核酸Ⅱ組)/(AControl組-A空白對照組)×100%

1.2.4 FCM法檢測K562和KG1a細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期的K562或KG1a細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×109·L-1，取0.5 mL稀釋至12.5 mL接種于6孔板，每孔3 mL。實(shí)驗(yàn)分組：Control組：含有細(xì)胞10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基；終濃度為100、150、200 mg·L-1的注射用核糖核酸Ⅱ，于37℃、5% CO2飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的0.01 mol·L-1PBS(pH 7.2)漂洗細(xì)胞2次，4℃，1 000×g，離心5 min。每組樣本測定3×104個細(xì)胞上流式細(xì)胞儀檢測采用CellQuest 軟件分析得出細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Hoechst 33258染色實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的K562和KG1a細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×109·L-1，接種于6孔板，每孔3 mL。實(shí)驗(yàn)分組：Control組：含有細(xì)胞10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基；終濃度為100、150、200 mg·L-1的注射用核糖核酸Ⅱ，于37℃，5% CO2飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的0.01 mol·L-1PBS(pH7.2)漂洗細(xì)胞2次，4℃，1 000×g,離心5 min。加甲醇 ∶乙醇(3 ∶1)固定液固定15 min，離心去除固定液加Hoechst 33258染色液，避光室溫染色30 min，PBS洗5次，再加上PBS制成細(xì)胞懸液滴在載玻片上，50%甘油封片，置于熒光顯微鏡下觀察、采圖，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Western blot 取對數(shù)生長期的K562或KG1a細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×109·L-1，取0.5 mL稀釋至12.5 mL接種于6孔板，每孔3 mL。實(shí)驗(yàn)分組：Control組：含有細(xì)胞10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基；終濃度為100、150、200 mg·L-1的注射用核糖核酸Ⅱ，于37℃，5% CO2飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的0.01 mol·L-1PBS(pH7.2)漂洗細(xì)胞2次，4 ℃, 1 000×g,離心5 min。將細(xì)胞裂解液、1% PMSF冰上混勻，加100 μL至細(xì)胞中，用槍吹打，置于冰上10 min，然后渦旋混勻，重復(fù)3次，4 ℃, 12 000×g,離心15 min，取上清液即為所提細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測各組蛋白濃度。按每孔50 μg上樣，80 V～120 V進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，250 mA 30～60 min將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5% BSA溶液37℃封閉2 h，一抗孵育過夜(p53 1 ∶1 000, Bcl-2 1 ∶1 000, Bax 1 ∶500, cleaved caspase-3 1 ∶500, β-actin 1 ∶10 000)，TBST洗膜3次，每次15 min，二抗37℃孵育30 min(1 ∶10 000)，TBST洗膜3次，每次30 min，ECL發(fā)光液孵育30 s，ChemiDOC Touch imaging system(BIO-RAD)機(jī)器曝光，使用配套軟件檢測灰度值，p53、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3比β-actin灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)采用SPSS 22.0版本統(tǒng)計軟件包處理。進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 注射用核糖核酸Ⅱ能有效抑制人白血病細(xì)胞K562和KG1a增殖 運(yùn)用CCK-8法檢測注射用核糖核酸Ⅱ?qū)562和KG1a細(xì)胞增殖抑制率。分別用終濃度為100、150、200、250、300 mg·L-1的注射用核糖核酸Ⅱ作用于K562和KG1a細(xì)胞12、24、48 h，K562和KG1a細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。注射用核糖核酸Ⅱ作用于K562細(xì)胞12,24,48 h的半數(shù)致死濃度(IC50)分別為171.6、165.0、127.9 mg·L-1，注射用核糖核酸Ⅱ作用于KG1a細(xì)胞12、24、48 h的半數(shù)致死濃度(IC50)分別為172.6、156.0、120.7 mg·L-1。由Fig 1可見，注射用核糖核酸Ⅱ?qū)562和KG1a細(xì)胞的抑制率呈時間效應(yīng)和劑量效應(yīng)。

2.2 FCM檢測注射用核糖核酸Ⅱ誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞K562和KG1a細(xì)胞凋亡 FCM檢測結(jié)果顯示，100、150、200 mg·L-1注射用核糖核酸Ⅱ能夠誘導(dǎo)人白血病K562和KG1a細(xì)胞凋亡，其中K562細(xì)胞的凋亡率分別為9.21%、15.8%、29.36%,與空白組4.75%相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；KG1a細(xì)胞的凋亡率分別為10.06%、56.49%、77.24%，與空白組6.91%相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由Tab 1、2可見，K562和KG1a細(xì)胞的凋亡率隨藥物作用濃度的增加而逐漸上升，提示注射用核糖核酸Ⅱ抑制人白血病K562和KG1a細(xì)胞的增殖活性與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

Fig 1 Inhibitory effect of ribonucleic acid Ⅱ on K562/KG1a by CCK-8 assay

A:Inhibitory effect of ribonucleic acid Ⅱ on K562 after treatment for 12,24,48 h; B: Inhibitory effect of ribonucleic acid Ⅱ on KG1a after treatment for 12,24,48 h

RibonucleicacidⅡ/mg·L-1Apoptosisrate/%04.75±0.121009.21±0.61*15015.80±4.34*20029.36±2.67*

*P<0.05vscontrol

RibonucleicacidⅡ/mg·L-1Apoptosisrate/%06.91±0.0910010.06±0.42*15056.49±5.91*20077.24±5.61*

*P<0.05vscontrol

2.3 Hoechst染色觀察人白血病細(xì)胞K562和KG1a細(xì)胞凋亡 K562和KG1a細(xì)胞經(jīng)100、150、200 mg·L-1注射用核糖核酸Ⅱ誘導(dǎo)24 h后染色，在熒光顯微鏡下觀察可見，空白對照組發(fā)出均勻、淡藍(lán)色熒光，未見凋亡細(xì)胞；而注射用核糖核酸Ⅱ處理的各組均出現(xiàn)核染色質(zhì)濃縮聚集、核碎裂、核邊集及發(fā)出藍(lán)白色熒光等典型的細(xì)胞凋亡特征，凋亡改變隨藥物作用濃度升高而更加明顯。

2.4 注射用核糖核酸Ⅱ誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞K562和KG1a調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) K562和KG1a細(xì)胞經(jīng)100、150、200 mg·L-1注射用核糖核酸Ⅱ誘導(dǎo)24 h后收集細(xì)胞提取總蛋白進(jìn)行凝膠電泳分析。Western blot法檢測結(jié)果顯示，p53、Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平隨注射用核糖核酸Ⅱ藥物濃度的增高而表達(dá)上調(diào)，而Bcl-2蛋白表達(dá)水平逐漸降低，與空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示注射用核糖核酸Ⅱ可能是通過上調(diào)p53調(diào)控Bcl-2/Bax的表達(dá)，激活caspase-3促進(jìn)K562和KG1a細(xì)胞凋亡。

Fig 2 Effect of ribonucleic acid Ⅱ on cell apoptosis of K562 cells

A:Control; B: 100 mg·L-1; C:150 mg·L-1; D: 200 mg·L-1

Fig 3 Effect of ribonucleic acid Ⅱ on cell apoptosis of KG1a cells

A:Control; B: 100 mg·L-1; C: 150 mg·L-1; D: 200 mg·L-1

Fig 4 Hoechst 33258 staining after ribonucleic acid Ⅱ induced K562 for 24 h(The arrow points to the apoptotic cell)

A:Control;B:100 mg·L-1;C:150 mg·L-1;D:200 mg·L-1

Fig 5 Hoechst 33258 staining after ribonucleic acid Ⅱ induced KG1a for 24 h (The arrow points to the apoptotic cell)

A:Control;B:100 mg·L-1;C:150 mg·L-1;D:200 mg·L-1

Fig 6 Expression of proteins in K562 cells after ribonucleic acid Ⅱ treatment for 24 hours

A:Control;B:100 mg·L-1;C:150 mg·L-1;D:200 mg·L-1.*P<0.05vscontrol

Fig 7 Expression of proteins in KG1a cells after ribonucleic acid Ⅱ treatment for 24 hours

A:Control; B:100 mg·L-1;C:150 mg·L-1;D:200 mg·L-1.*P<0.05vscontrol

3 討論

白血病在我國的發(fā)病率為十萬分之六左右，居腫瘤發(fā)病率第6位，還因其在兒童惡性腫瘤發(fā)病率中居于前列，受到了眾多學(xué)者的關(guān)注。雖然臨床上對白血病的治療進(jìn)行了不懈的努力和嘗試，采用了骨髓移植、化療等方法，但因其治療價格昂貴、配型困難、副作用多等不利因素影響了白血病的治療效果，尋找價格低廉而療效明顯的藥物迫在眉睫。注射用核糖核酸Ⅱ在抗癌及增強(qiáng)免疫功能方面的作用為其治療白血病提供新的方向。

目前已有臨床上采用注射用核糖核酸Ⅱ治療肝癌、肺癌等腫瘤的報道，但對其抗癌作用的機(jī)制研究較少[7]。本研究運(yùn)用CCK-8法檢測注射用核糖核酸Ⅱ?qū)β粤＜?xì)胞白血病細(xì)胞K562和急性髓系白血病細(xì)胞KG1a的增殖抑制作用，結(jié)果提示，100～300 mg·L-1的藥物在12、24、48 h均可明顯抑制上述兩種細(xì)胞的增殖，并且對急慢性白血病細(xì)胞的抑制率均呈時間和劑量依賴性。研究不僅證實(shí)了注射用核糖核酸Ⅱ?qū)甭园籽〖?xì)胞的增殖抑制作用，并且在不同時間點(diǎn)的藥物較此前研究活性更好[3]，這可能與藥物的批次、作用時間和細(xì)胞狀態(tài)不同等因素有關(guān)。有研究報道，注射用核糖核酸Ⅱ的抗腫瘤作用與DNA損傷有關(guān)，而DNA損傷與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切；因此注射用核糖核酸Ⅱ?qū)Π籽〖?xì)胞的增殖抑制作用是否與凋亡有關(guān)值得深入研究。

研究采用了FCM和Hoechst染色兩種方法檢測了注射用核糖核酸Ⅱ?qū)Π籽〖?xì)胞凋亡的影響。FCM檢測結(jié)果顯示，100、150、200 mg·L-1注射用核糖核酸Ⅱ誘導(dǎo)K562細(xì)胞的凋亡率分別為9.21%、15.8%、29.36%；KG1a細(xì)胞的凋亡率分別為10.06%、56.49%、77.24%，提示注射用核糖核酸Ⅱ能有效誘導(dǎo)急慢性白血病細(xì)胞的凋亡。與此同時，采用相同濃度的注射用核糖核酸Ⅱ誘導(dǎo)急慢性白血病細(xì)胞，出現(xiàn)了核染色質(zhì)濃縮聚集、核碎裂、核邊集等典型的凋亡變化，凋亡形態(tài)變化的程度與凋亡率的改變一致；但注射用核糖核酸Ⅱ誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不清楚。

p53是人體抑癌基因，其失活對腫瘤的形成具有舉足輕重的作用，因而成為藥物治療白血病機(jī)制研究中的關(guān)鍵靶點(diǎn)[8]。p53可在DNA受損后通過維持基因組穩(wěn)定參與DNA的修復(fù)過程[9]。p53可通過影響B(tài)cl-2/Bax和cleaved caspase-3等蛋白的表達(dá)和活性實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞凋亡過程的調(diào)控作用[10]。Bcl-2基因是惡性腫瘤中最為重要的抗凋亡基因，Bax基因通過組成同源二聚體或與Bcl-2組成異源二聚體抑制Bcl-2的作用而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能[11-12]。caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶, 是細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路[13]。Bcl-2/Bax通過促進(jìn)細(xì)胞色素C在內(nèi)的多種促凋亡蛋白的釋放，激活caspase家族，產(chǎn)生caspase級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[14]。本實(shí)驗(yàn)采用100、150、200 mg·L-1注射用核糖核酸Ⅱ分別誘導(dǎo)K562和KG1a細(xì)胞24h后的蛋白印跡結(jié)果顯示，p53、Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平隨注射用核糖核酸Ⅱ藥物濃度的增高而表達(dá)上調(diào)，而Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，提示注射用核糖核酸Ⅱ可能是通過上調(diào)p53來調(diào)控Bcl-2/Bax的表達(dá)，激活caspase-3進(jìn)而對K562和KG1a細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生影響，而注射用核糖核酸Ⅱ又是通過何種機(jī)制上調(diào)p53表達(dá)調(diào)控細(xì)胞凋亡的發(fā)生還需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

綜上所述，注射用核糖核酸Ⅱ可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮其抑制急慢性白血病細(xì)胞的增殖作用，而其凋亡的機(jī)制與上調(diào)p53，調(diào)控Bcl-2/Bax的表達(dá)，激活caspase-3有關(guān)，深入探討p53上下游凋亡有關(guān)的信號分子改變可為注射用核糖核酸Ⅱ治療白血病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

(致謝：此研究在重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織細(xì)胞工程與干細(xì)胞研究室及解剖學(xué)教研室實(shí)驗(yàn)室完成，特此感謝！)

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Ribonucleic acid Ⅱ induces apoptosis in human leukemia cells by up-regulating p53

GUO Pei1,2,RAN Jian-hua2,3,LI Jing1,CHEN Di-long1,YANG Bao-xue4,HE Fei2,3,XIONG Wei1,SHI Xue-ping1,LI Hai-xing1

(1.LaboratoryofStemCellsandTissueEngineering,CollegeofBasicMedicine;2.DeptofAnatomy;3.NeuroscienceResearchCenter,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016; 4.DeptofPharmacology,SchoolofBasicMedicalScience,Beijing100191)

Aim To investigate the effect of ribonucleic acid Ⅱon apoptosis in human leukemia cell lines K562 and KG1a.Methods Cell counting kit-8(CCK-8) assay was performed to detect proliferation activity of K562 and KG1a cells treated with ribonucleic acidⅡ. Apoptosis index was assessed by flow cytometry(FCM) and fluorescent Hoechst 33258 staining was used for observing morphologic changes of apoptosis. Expression levels of p53,Bax,Bcl-2 and cleaved caspase-3 were analyzed by Western blot.Results The proliferation of K562 and KG1a cells was significantly inhibited by ribonucleic acid Ⅱ treatment for 12 h, 24 h, 48 h at concentrations of 100～300 mg·L-1, which indicated the inhibitory effect of ribonucleic acid Ⅱ was in dose-dependent and time-dependent manners. FCM results displayed a dose-dependent increase in cell apoptotic rate. Hoechst 33258 staining showed the typical apoptotic morphology in some leukemic cells treated with ribonucleic acid Ⅱ, including increased nuclear chromatin concentration and edge accumulation. Western blot analysis showed the increased expression of p53, Bax, cleaved caspase-3 and decreased expression of Bcl-2 in K562 and KG1a cells treated with ribonucleic acid Ⅱ.Conclusions Ribonucleic acid Ⅱ can induce apoptosis of leukemia K562 and KG1a cells by up-regulating p53, which mediates Bcl-2/Bax balance and activates caspase-3.

ribonucleic acid Ⅱ;leukemia;p53; K562 cells; KG1a cells; apoptosis

時間：2016-12-5 15:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.036.html

2016-08-05，

2016-09-29

重慶市科技計劃資助項(xiàng)目(No cstc2015jcyjA0036)

郭 珮(1991-)，女，碩士生，研究方向：白血病基礎(chǔ)與臨床,E-mail:930029089@qq.com; 冉建華(1974-)，女，博士，教授，研究方向：尿素通道蛋白生理功能及藥物開發(fā),通訊作者,E-mail:ranjianhua2013@163.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.018

A

1001-1978(2016)12-1729-06

R329.24；R329.25；R342.2；R733.7；R979.1