閆津津，余 昊，王美玲

(1.北京大學深圳醫(yī)院檢驗科，廣東深圳 518000；2.北京大學第一醫(yī)院檢驗科，北京 100034)

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·論 著·

3種方法測定變應性鼻炎患者的變應原試驗結果比較

閆津津1，余 昊1，王美玲2

(1.北京大學深圳醫(yī)院檢驗科，廣東深圳 518000；2.北京大學第一醫(yī)院檢驗科，北京 100034)

目的 通過斑點免疫印跡法(dot-IBT)、熒光酶聯(lián)免疫法(FEIA)測定變應性鼻炎患者血清的變應原特異性IgE(sIgE)，皮膚點刺試驗(SPT)檢測變應原，比較分析體外dot-IBT、FEIA與體內SPT的結果,為臨床提供準確可靠的sIgE實驗數(shù)據。方法 37例變應性鼻炎患者采用dot-IBT、FEIA檢測sIgE、SPT測定變應原,分別分析dot-IBT、FEIA的特異度和靈敏度，通過Kappa檢驗分析dot-IBT、FEIA與SPT結果的一致性。結果 dot-IBT法測定變應原靈敏度均較高，其中樹花粉、雜草花粉、真菌、塵螨和動物毛靈敏度都在90.00%以上,特異度指標中，雜草花粉、塵螨和動物毛的特異度最好(>90.00%)，一致性分析中雜草花粉、塵螨和動物毛一致性較高(Kappa系數(shù)>0.9)。FEIA法測定變應原的特異度較高，樹花粉、雜草花粉、霉菌、動物毛均在90.00%以上，靈敏度指標中最好的是塵螨(100.00%)和動物毛(100.00%)，一致性分析中顯示變應原的一致性均較高(Kappa系數(shù)>0.6)。結論 dot-IBT總體靈敏度較高，快速，需要血清量少，可用于變應原sIgE的篩查。FEIA法結果特異度較高，靈敏度尚可，有利于變應原的確定。綜合dot-IBT、FEIA兩種方法sIgE的結果，并結合SPT及臨床過敏癥狀共同確定變應原。

斑點免疫印跡法； 熒光酶聯(lián)免疫法； 特異度IgE； 皮膚點刺試驗

變應性鼻炎是接觸變應原后，由Th2細胞介導的免疫炎癥。Th2細胞產生細胞因子，如白細胞介素(IL)-4,IL-13,誘導變態(tài)反應炎癥的發(fā)生，并誘導產生IgE抗體[1]。診斷變應性鼻炎的基礎是看是否有過敏，臨床懷疑變應性鼻炎需要了解患者的變態(tài)反應病史，而找到變應原是確診變應性鼻炎的有力證據[2]。變應原檢測的皮膚點刺試驗(SPT)是目前診斷變態(tài)反應病中尋找變應原推薦的試驗，然而其常受藥物、皮膚劃痕癥等條件的限制[2]。體外血清學檢測特異度IgE(sIgE)不受身體等條件的限制彌補了SPT試驗的不足，斑點免疫印跡法(dot-IBT)和熒光酶聯(lián)免疫法(FEIA)是目前體外檢測sIgE應用較廣泛的兩種方法。FEIA法是自1989年生產以來因其較好的靈敏度和特異度，目前公認為較可靠的IgE試驗方法[3]，但其成本較高，需要血清量較大，使其臨床應用受到較大限制。dot-IBT是近年來興起的具有簡單、快速、用血量較少的特點的sIgE試驗，可同時測定多種變應原組合，成本較低。但臨床試驗中常發(fā)現(xiàn)sIgE結果與SPT結果不符的情況，為了解體外sIgE不同檢測方法與SPT結果的符合情況，本文比較了dot-IBT、FEIA分別與SPT結果的異同。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2012年3月至2013年8月北京大學第一醫(yī)院就診于耳鼻喉科確診的變應性鼻炎患者37例，男18例，女19例，年齡4～70歲，中位年齡36歲。主訴有變應性鼻炎病史或接觸變應原后出現(xiàn)相關變態(tài)反應病癥狀，皮膚點刺試驗(SPT)或(和)特異度IgE陽性。

1.2 儀器與試劑 dot-IBT采用德國歐蒙醫(yī)學實驗診斷股份公司的EURO Blot Master印跡法自動操作儀以及特應性變應原 (中國組合)檢測試劑盒，佳能Canoscanline 100掃描判讀系統(tǒng)。

1.3 方法 SPT將變應原液點于患者前臂屈側皮膚，持點刺針將針尖垂直點壓在液滴中，一液一針，不重復使用，破皮而不出血，且深度一致。SPT點刺20 min后觀察抗原的皮膚反應。

dot-IBT：用dot-IBT法檢測5類血清變應原sIgE，操作嚴格按試劑盒說明書步驟如下：(1)加樣。復融血清至室溫，充分混勻后加入血清150 μL至預先加有1.0 mL通用緩沖液及檢測膜條的溫育槽內，搖床溫育16 h；(2)清洗。吸取溫育槽內液體，用1.0 mL通用緩沖液清洗膜條3次，每次5 min；(3)加酶結合物。于各溫育槽加入1.0 mL酶結合物，搖床溫育60 min后重復上述清洗步驟1次；(4)加底物。每個溫育槽中加入底物1.0 mL，避光搖床溫育10 min后終止反應；(5)取出檢測膜條自然風干，采用專門軟件自動判讀結果。

FEIA:Immuno-CAP系統(tǒng)使用纖維素固相載體，該固相載體是裝存小膠囊內的親水性的多聚纖維素，經溴化氧活化后與過敏原共價結合，過敏原預先結合在固相帽狀物的ImmunoCAP中，37 ℃孵育，如患者血清中有針對該變應原的sIgE，即形成抗此變應原抗體復合物，洗脫，加酶標記的兔抗人IgE抗血清(酶標二抗)，形成固相載體-變應原-sIgE-酶標二抗的結合物，再次洗脫，加入底物，產生酶催化熒光產物，終止液終止反應；測定熒光值。根據熒光吸光度的大小換算成sIgE的含量。sIgE的定量結果以KU/L為單位。

1.4 結果判斷 SPT：變應原風團反應與陰性對照相同為陰性；變應原分團反應范圍為標準組胺分團反應范圍的1/4為+；變應原分團反應范圍為標準組胺分團反應范圍的1/2為++；變應原分團反應范圍為標準組胺分團反應范圍為+++；變應原分團反應范圍為標準組胺分團反應范圍的2倍為++++。

dot-IBT：結果用掃描儀收集數(shù)據后，由專用軟件根據條帶著色強度自動判讀結果。條帶著色強度<3為陰性，著色強度≥3為陽性。

FEIA：檢測結果根據吸光度的大小換算成IgE結果。sIgE<0.35 KU/L為陰性， ≥0.35 KU/L為陽性。

1.5 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據錄入Excel中建立數(shù)據庫。以SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，以SPT為比對方法，dot-IBT、FEIA與其進行一致性檢驗，Kappa系數(shù)≥0.6表示一致性較好,0.4

2 結 果

2.1 dot-IBT方法評價 以SPT為比對方法，評價dot-IBT與SPT測定結果的符合率見表1。

2.2 FEIA方法評價 以SPT為比對方法，評價EEIA與SPT測定結果的符合率見表2。

表1 dot-IBT法檢測變應原sIgE的性能

表2 FEIA法檢測變應原sIgE的性能

表3 變應原不同方法ROC曲線下面積

2.3 變應原不同方法ROC曲線下面積 各種類變應原dot-IBT、FEIA法ROC曲線下面積結果見表3。

3 討 論

SPT檢測是將多種變應原刺入皮膚，模擬變應原接觸的過程，誘發(fā)Ⅰ型變態(tài)反應的發(fā)生，是直接觀察機體對于變應原的反應，反映患者對變應原的真實情況，但結果易受到操作者的技術和經驗影響，且標準變應原的含量和純度也會有所不同[2]。dot-IBT是根據某些固相載體具有較強吸附蛋白能力的特點建立起來的，是將經分離的變應原提取物吸附到膜條上作為固相。FEIA是將變應原固定在親水性的多聚纖維素上，經溴化氟活化后與變應原共價結合。兩種方法的sIgE檢測結果不盡相同，王美玲等[4]對dot-IBT與FEIA兩種方法進行了sIgE結果的比對，表明兩者之間具有良好的一致性。但與SPT結果是否一致需進一步闡述。

本研究以變應性鼻炎患者為研究對象，選取了吸入性變應原中最常見的五類變應原，根據dot-IBT與SPT結果比對得出，dot-IBT法測定變應原靈敏度較高，五類吸入性變應原靈敏度都在90.00%以上,特異度指標中，雜草花粉、塵螨和動物毛的特異度最好(>90.00%)，一致性分析中雜草花粉、塵螨和動物毛一致性較高(Kappa系數(shù)>0.9)。加之dot-IBT實驗使用小型儀器，也可手工操作，操作過程簡單，易于推廣和普及，因此，dot-IBT用于篩查試驗結果較為理想。

FEIA法與SPT結果比對得出，F(xiàn)EIA法測定變應原的特異度較高，樹花粉、雜草花粉、真菌、動物毛均在90.00%以上，靈敏度指標中最好的是塵螨(100.00%)和動物毛(100.00%)，雜草花粉和霉菌的靈敏度較低，一致性分析中顯示變應原的一致性均較高(Kappa系數(shù)>0.6)，總符合率高于dot-IBT。FEIA法中變應原的特異度較高，可用于確診具體變應原的種類，但是FEIA使用大型儀器，價格較昂貴，普通實驗室推廣較為困難。

ROC曲線分析中顯示，F(xiàn)EIA法對于測定樹花粉、霉菌、動物毛變應原優(yōu)于dot-IBT法，雜草、塵螨兩種檢測方法dot-IBT法的ROC曲線下面積大于FEIA法，兩者曲線下面積均大于0.7，說明兩種方法檢測結果與SPT一致性均較好，然而兩種方法與SPT對于霉菌變應原的測定均較其他組低，自然界中可引起變態(tài)反應的霉菌變應原種類繁多，空氣中大多為曲霉菌、鏈格菌、枝孢菌、念珠菌等，SPT霉菌變應原提取物由多種霉菌組成，dot-IBT中霉菌變應原中僅包括點青霉、分枝孢霉、煙曲霉菌和交鏈孢霉菌組成，而FEIA中霉菌變應原組成包括青霉、多住分枝孢霉、煙曲霉、白色假絲酵母菌、交鏈孢霉、長蠕孢霉菌，均無SPT中所包含的霉菌類型多，由此可能會漏掉某些霉菌變應原。可能是造成符合率低的原因之一；其二可能是由于人體產生的抗交叉反應性糖類決定簇(anti-CCDIgE)的影響，而抑制實驗可提高變應原的符合率[6]。

3種不同方法檢測變應原中各類變應原所包含的具體變應原種類不盡相同，需要指出的是3種變應原檢測方法所用的變應原提取物有的為天然變應原， 有的為重組變應原[7-8]，有些是根據歐洲人群變應原設計的，有些是本國特有的變應原，并且同一類變應原中的變應原組分也不盡相同，提取制備的方法差別也較大[8-9]?，F(xiàn)在對變應原主要組分研究相對成熟，是否可以制備標準化變應原提取物，有待進一步研究。

dot-IBT與FEIA檢測sIgE各有優(yōu)缺點。dot-IBT由于包被變應原種類較多，可一次測定多種類型，總體靈敏度較高，可用于變應原的篩查試驗，快速、需要血清量少、成本適中。FEIA法則結果特異度較高、靈敏度尚可，可用于變應原的確定，對具體變應原種類有較好的指示作用。因此，對于變應原的確定需結合SPT和血清sIgE結果綜合判斷，根據患者的情況先進行SPT及血清dot-IBT法進行篩選變應原，再根據結果使用FEIA法進行變應原確診。

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Comparison of 3 kinds of method for performing allergen test in patients with allergic rhinitis

YANJinjin1,YUHao1,WANGMeiling2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,ShenzhenHospital,PekingUniversity,Shenzhen,Guangdong518000,China; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,FirstHospital,PekingUniversity,Beijing100034,China)

Objective To compare and analyze the results of in vitro dot immunoblotting (dot-IBT), fluorescent enzyme-linked immunoassay (FEIA) and in vivo skin prick test (SPT) by dot-IBT and FEIA for detecting allergen specific IgE(sIgE) and SPT for detecting allergens in order to provide accurate and reliable sIgE experiment data for clinic.Methods The allergens in 37 patients with allergic rhinitis were detected by SPT and sIgE was detected by dot-IBT and FEIA. The specificity and sensitivity of dot-IBT and FEIA were analyzed, and their consistency with SPT was analyzed through the Kappa test.Results The sensitivity of dot-IBT for detecting allergens was higher, which for detecting tree pollen, weeds pollen, fungi, dust mites and animal hair was more than 90.00%;in specific indicators, weeds pollen, dust mites and animal hair had best specificity (>90.00%), in the consistency analysis, weeds pollen, dust mites and animal hair had higher consistency (Kappa>0.9). The specificity of FEIA for detecting allergens was higher, which for detecting tree pollen, weeds pollen, moulds and animal hair all were above 90.00%; in the sensitivity indexes, the best was the dust mites (100.00%) and animal hair (100.00%), the consistency analysis showed the consistency of allergens was higher(Kappa>0.6).Conclusion dot-IBT has higher overall sensitivity wit rapidness, needs less serum and can be used for the screening of allergen sIgE. The results of FEIA method has higher specificity, its sensitivity is general, which is helpful to determine the allergens. The allergens can be jointly determined by comprehensive sIgE results of dot-IBT and FEIA, and combining with SPT and clinical allergic symptoms.

dot immunoblotting; FEIA; specific IgE; skin prick test

閆津津，女，主管技師，主要從事免疫及微生物研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.24.017

A

1673-4130(2016)24-3429-03

2016-09-06

2016-10-25)