王長明，張金菊，徐平，劉海軍，魏志杰，張麗

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563003)

不明原因腦炎患者腦脊液HCV-E1基因片段檢測

王長明，張金菊，徐平，劉海軍，魏志杰，張麗

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563003)

目的 探討丙型肝炎病毒(HCV)與不明原因腦炎的關(guān)系。方法 不明原因的腦炎患者48例，丙型肝炎患者及HCV攜帶者共25例，采用熒光定量PCR和巢式PCR技術(shù)檢測其腦脊液中的HCV-E1基因片段。結(jié)果 48例不明原因腦炎患者中有6例腦脊液HCV-E1基因片段陽性，25例丙型肝炎患者及HCV攜帶者均為陰性，兩者相比，P<0.05。6例不明原因腦炎患者腦脊液中檢測到的HCV-E1基因片段測序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)毒株相符。結(jié)論 HCV與部分不明原因腦炎的發(fā)病可能有關(guān)。

腦炎;病毒性腦炎；丙型肝炎病毒；丙型肝炎病毒-E1基因片段

丙型肝炎病毒(HCV)主要損害肝臟，表現(xiàn)肝炎的臨床癥狀及體征。HCV還可能會損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，破壞神經(jīng)細胞，導(dǎo)致人類某些神經(jīng)疾病的發(fā)生，在部分國家和地區(qū)曾引起短暫爆發(fā)流行[1]。在我國，存在較多散發(fā)的、病因較難明確的病毒性腦炎。為尋找病因，臨床上常檢測腦脊液(CSF)中的抗體、病原體及基因片段。檢測到病原體是顱內(nèi)感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但對于病毒感染性疾病，要檢測到病原體極其困難。因此，檢測抗體及基因片段的方法被廣泛采用。但由于抗體的產(chǎn)生有窗口期，其檢測也受到限制。我們常采用PCR技術(shù)檢測CSF中的基因片段，用于顱內(nèi)感染的診斷。但由于CSF細胞總RNA含量低、容易降解，用常規(guī)PCR技術(shù)和單純熒光定量PCR技術(shù)檢測CSF中的基因片段非常困難。為了探討部分不明原因腦炎是否與HCV感染有關(guān)，我們收取48例不明原因腦炎患者的CSF，提取其中的單個核細胞總RNA，設(shè)計、合成了檢測HCV的引物和探針，采用熒光定量巢式PCR技術(shù)對其HCV-E1基因片段進行了檢測?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2012年10月～2015年5月遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的原因不明腦炎患者48例，男31例，女17例；年齡(35±8)歲；發(fā)病后7 d內(nèi)采集CSF。48例患者的臨床癥狀、體征、CSF檢查結(jié)果、血液生化及常規(guī)檢查結(jié)果、細胞學(xué)檢查結(jié)果、腦電圖及影像學(xué)檢查結(jié)果等均符合腦炎的表現(xiàn)，且其CSF中單純皰疹病毒、EB病毒、乙型腦炎病毒、HCV、帶狀皰疹病毒特異性抗體檢測均為陰性，腦炎病因不能明確。排除腦炎發(fā)病7 d以上的患者、顱內(nèi)有明確梗死灶和出血灶的患者、病原學(xué)診斷明確的顱內(nèi)感染患者。遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院同期收治的丙型肝炎患者及HCV攜帶者共25例，男14例，女11例；年齡(30±3)歲；丙型肝炎發(fā)病后、HCV攜帶確診后7 d內(nèi)采集CSF。

1.2 HCV-E1基因片段的檢測 采用熒光定PCR和巢式PCR技術(shù)。利用計算機Primer Express2.0

軟件輔助設(shè)計引物探針。HCV-E1外引物244 bp、內(nèi)引物63 bp，序列如下：內(nèi)引物中正向引物為5′-GATGCCATCCTGCACACTCC-3′、反向引物為5-AGTGGCGCCTGGGAGAGA-3′，外引物中正向引物為5′-CACCAGGGACGGCAAACT-3′、反向引物為5′-CTCCCGACAAGCAGATCGA-3′，Probe引物為5′-FAMCCCACAACGCAGCTTCGACGTCAT-TAMRA-3′。引物探針由Invitrogen公司用ABI 3900臺式高通量DNA合成儀合成。①CSF中單核細胞(CSFMC)RNA提?。好坷軝z者采集CSF 5 mL，4 ℃、3 000 r/min離心(半徑10 cm)10 min，棄上清液。將分離的CSFMC中加入1 mL的PBS 稀釋，加TRIzol并振蕩15 s，再加200 μL的氯仿并振蕩15 s，室溫靜置5 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。取離心后的上清液0.5 mL，加入另一離心管中，加0.5 mL的異丙醇，輕輕搖勻，-20 ℃沉淀30 min，然后在4 ℃、12 000 r/min離心15 min，丟棄上清液，加入1 mL用 DEPC水配制的75%乙醇，洗滌RNA后沉淀、混勻，再次4 ℃、12 000 r/min離心5 min。小心緩慢吸去乙醇，在真空或空氣中干燥5～10 min，加入DEPC水30 μL溶解RNA，-80 ℃冰箱保存?zhèn)錂z。如需要長期保存，則需加入2.5倍體積乙醇，-80 ℃下保存。②RNA逆轉(zhuǎn)錄及cDNA擴增:采用熒光定量巢式PCR技術(shù)，用美國BIO-RAD 定性PCR儀。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)取4 μL的RNA作為模板。PCR反應(yīng)體系：10 μL的RNase Freed H2O，1 μL的Prime ScriptTMRT Enzyme Mix I ，1 μL的Oligo dT Primer ，2 μL的5×Prime ScriptTMBuffer (for real time)， 4 μL的RNA ，2 μL的Random 6 mers ，總體積為20 μL。反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。外引物定性反應(yīng)：取4 μL的cDNA模板做定性擴增，儀器為C1000 Thermal cycler(美國BIO-ARD公司)，每例份反應(yīng)體系：32 μL的H2O ，10 μL的5×定性 buffer ，1 μL的dNTPS，1 μL的TAQ，1 μL的Reverse Primer，1 μL的Forward Primer(外)，4 μL的cDNA ，總體積50 μL。PCR buffer成分：50 mmol/L的KCl, 2 mmol/L的 MgCl2，10 mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0)。反應(yīng)條件：93 ℃ 5 min， 93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共40個循環(huán)，72 ℃ 7 min。熒光定量PCR反應(yīng)：待測樣本每例份按以下反應(yīng)體系進行，25 μL的H2O，2.5 μL的10×PCR buffer，0.5 μL的dNTPS，0.5 μL的TAQ，0.5 μL的Forward Primer，0.5 μL的Probe，2 μL的cDNA，總體積25 μL。反應(yīng)條件：93 ℃ 2 min，93 ℃ 15 s，55 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，共40個循環(huán)。③基因克隆測序：陽性PCR 產(chǎn)物用醋酸鈉、乙醇沉淀法純化后與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。鑒定篩選重組子采用菌落-FQ-PCR及藍白斑，同時收集每例份標(biāo)本陽性菌落進行培養(yǎng)。收集菌落，提取質(zhì)粒DNA，重新采用FQ-PCR進行鑒定，對陽性質(zhì)粒重組子進行基因測序(廣州藍吉生物工程有限公司)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)比較用Fisher精確概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

48例不明原因腦炎患者中有6例CSF中的HCV-E1基因片段陽性，25例丙型肝炎患者及HCV攜帶者則均為陰性，兩者相比，P<0.05。經(jīng)BLSAT軟件分析證明6例不明原因腦炎患者CSF中檢則到的HCV-E1基因片段序列與基因庫HCV-E1基因片段序列一致，見圖1。

圖1 1例不明原因腦炎患者CSF中檢測到的HCV-E1克隆的核苷酸序列測序結(jié)果(160～220為基因組序列)

3 討論

HCV為黃病毒科，病毒體直徑<80 nm，呈球形，在核衣殼外有含脂質(zhì)的囊膜包繞，有剌突在囊膜上形成[2]。HCV基因有一開放可讀框架在5′端非編碼區(qū)下游，基因組排列順序5′-C-E1-E2/NS1-NS2-S3-NS4-NS5-3′，編碼的多聚蛋白前體有3 014個氨基酸，該多聚蛋白前體經(jīng)病毒自身蛋白酶和宿主細胞作用，裂解為E1、C和E2/NS1三種獨立結(jié)構(gòu)的糖蛋白[3]。作為細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，核殼蛋白可能與肝細胞損害以及肝癌發(fā)生有關(guān)。另外還有參與病毒復(fù)制與裝配的四種非結(jié)構(gòu)蛋白NS2、NS3、NS4、NS5，其中NS2和NS4與細胞膜緊密結(jié)合在一起，但其功能尚不清楚。具有螺旋酶活性的NS3蛋白參與解旋HCV-RNA分子，在RNA復(fù)制中起協(xié)助作用。NS5依賴于RNA的聚合酶活性參與HCV基因組復(fù)制。E1和E2分別是HCV的兩個膜蛋白，E1具有高度保守性，E2可能是HCV基因組中最高可變區(qū)域。因此，E1、NS5對HCV診斷試劑盒的開發(fā)及疫苗研制具有很好的靶位潛力[4,5]。

文獻[2]報道，部分神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者的血液和CSF中發(fā)現(xiàn)HCV抗體或抗原陽性，間接提示部分中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害可能與HCV感染有關(guān)。研究[6]認為HCV導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能受損的癥狀及體征機制可能是HCV與星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元相互影響，如Fujita等[7]曾報道1例34歲男性患者，出現(xiàn)定向力障礙及精神行為異常等神經(jīng)系統(tǒng)受損的癥狀和體征，CSF生化、常規(guī)檢測以及細胞學(xué)檢查均呈中度異常，腦電圖表現(xiàn)為較多的彌漫性慢波，給予無環(huán)鳥苷抗病毒治療后，定向力障礙及精神行為異常癥狀逐漸改善，但卻出現(xiàn)肝臟損害癥狀及體征如黃疸、肝區(qū)疼痛和谷丙轉(zhuǎn)氨酶增高等，同時其血清HCV-RNA陽性，但CSF中HCV-RNA陰性。分析其原因可能是HCV在CSF中濃度通常在100拷貝/mL以下，濃度過低，應(yīng)用常規(guī)PCR技術(shù)無法檢測到。Laskus等[8]采用套式RT-PCR技術(shù)檢測了13例HCV肝炎患者的CSF，其中8例HCV-RNA陽性，但是這些患者沒有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀及體征，只能說明HCV在CSF中被復(fù)制，不能明確其能否導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。王振海等[9]采用FQ-nRT-PCR技術(shù)檢測了病毒性腦炎患者及健康人的血液和CSF中HCV-RNA基因片段，其中46例病毒性腦炎患者中4例血液、3例CSF中HCV-RNA基因片段陽性。該研究檢測到的HCV-RNA基因片段陽性率低，而且沒有明確其檢測片段是否穩(wěn)定、保守，不易判定假陽性及假陰性。

盡管上述文獻報道有部分神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者的血液和腦脊液中HCV抗體、抗原以及基因為陽性，這只能間接提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害可能由HCV導(dǎo)致，卻沒有直接證據(jù)能夠表明HCV可損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能障礙。本研究采用熒光定量PCR技術(shù)，對不明原因病毒腦炎患者的CSF和丙型肝炎患者及HCV攜帶者的CSF中高度保守的HCV-E1基因片段進行了檢測，結(jié)果顯示48例不明原因病毒性腦炎患者，6例CSF中檢測到HCV-E1基因片段，克隆測序經(jīng)BLSAT軟件分析證明為HCV-E1基因片段，與基因庫HCV-E1序列一致。本研究檢測的陽性率(12.5%)明顯高于文獻[7]報道的8.69%，可能是HCV-E1具有高度保守性，從而提高了檢測的可靠性。6例HCV-E1基因片段陽性的不明原因病毒性腦炎患者的血液HCV抗體為陰性，可能因感染HCV后抗HCV抗體出現(xiàn)較慢，而HCV-RNA在暴露后的1～2周才易被檢出所致[10,11]。檢測到HCV-E1基因片段的患者可能近期被HCV感染。

本研究中48例不明原因病毒性腦炎患者單純皰疹病毒、EB病毒和乙型腦炎病毒、帶狀皰疹病毒特異性抗體檢測均為陰性，6例CSF中檢測到HCV-E1基因片段，說明HCV與部分不明原因腦炎的發(fā)病可能有關(guān)，而且近期被HCV感染的可能性較大。由于經(jīng)費有限、樣本量少，本研究未能對HCV-E1基因片段陽性者的CSF進行原位PCR檢測，不能判定HCV-E1基因片段為陽性的腦炎患者即為HCV感染致病。下一步我們將擴大樣本量，對HCV-E1基因片段陽性CSF進行原位PCR檢測，進一步明確HCV感染與不明原因腦炎的關(guān)系。

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遵義醫(yī)學(xué)院碩士啟動基金資助項目(201106)。

王長明(E-mail: wangchangming3@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.43.024

R734.02

B

1002-266X(2016)43-0073-03

2016-08-02)