劉曉伶，郝建平，付琳

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

山西野生黃芩種質(zhì)資源的RAPD分析

劉曉伶，郝建平，付琳

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

應(yīng)用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對7個山西不同產(chǎn)地的野生黃芩試管植株進行了分析，應(yīng)用SPSS 19.0軟件對結(jié)果進行了聚類分析。結(jié)果表明，5條引物擴增出20條片段，其中，多態(tài)性條帶17條，多態(tài)率為85%；7個野生種質(zhì)的遺傳距離在0～1，可聚為兩類，說明7個不同產(chǎn)地的山西野生黃芩之間存在明顯差異，具有豐富的遺傳多樣性。研究結(jié)果為山西野生黃芩種質(zhì)資源的保護和開發(fā)、利用以及黃芩優(yōu)良種質(zhì)的選育提供了試驗依據(jù)。

黃芩；試管植株；RAPD；遺傳多樣性

黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）為唇形科黃芩屬多年生草本植物，是我國的傳統(tǒng)中藥材，也是最常用和用量最大的中藥材之一，具有清熱燥濕、涼血安胎、解毒等功效[1]，其所含的黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素等黃酮類衍生物具有抗病原體、抗炎、抗自由基損傷、抗腫瘤、抗過敏、抗氧化、鎮(zhèn)痛、保肝、增強免疫功能以及調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用[2-4]。黃芩是山西省的道地藥材，全省共有野生黃芩13.52萬hm2，家種黃芩2.91萬hm2，野生資源分布區(qū)域和人工種植面積均位于全國前列[5]。RAPD是常用的遺傳標(biāo)記方法[6-7]，通過PCR來反映特異性擴增的DNA片段的多態(tài)性，可以快速有效地進行遺傳多樣性評價[8-12]。馮學(xué)鋒等[13]和邵愛娟等[14]利用RAPD方法分別對黃芩和并頭黃芩樣本以及34個不同種源的黃芩進行了種源間親緣關(guān)系的分析。RAPD分子標(biāo)記技術(shù)在北柴胡[15]、擬南芥[16]、太行菊[17]、蓖麻[18-19]、珍珠黃楊[20]、紫花苜蓿[21]等許多植物中也得到了普遍的應(yīng)用[12-13]。

本研究以山西7個產(chǎn)地的野生黃芩試管植株為材料，應(yīng)用RAPD技術(shù)分析不同種源試管植株的遺傳多樣性。黃芩種質(zhì)間的遺傳背景及親緣關(guān)系的確定，可為不同種質(zhì)的鑒定提供了新的試驗技術(shù)平臺，為山西黃芩種質(zhì)資源的保護和開發(fā)、利用以及優(yōu)良種質(zhì)資源的選育提供科學(xué)依據(jù)。而以試管植株為試驗材料，可以彌補由于個別野生種質(zhì)資源分布稀少所引起的數(shù)量限制，克服由于野生植株生長年限難以確定所帶來的原始誤差，以保證試驗數(shù)據(jù)的可比性和可信度。

1 材料和方法

1.1 材料

分別在山西省7個不同產(chǎn)地采集野生黃芩植株（種質(zhì)來源如表1所示），并應(yīng)用快速繁殖技術(shù)獲得試管植株。選取生長30 d長勢良好的試管植株的幼嫩葉片作為試驗材料。

表1 山西野生黃芩試管植株種質(zhì)來源

1.2 試驗儀器

Blue pard人工氣候箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），YXQ-LS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），TGL-16G臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠），Eppendorf移液槍，BIOER LifeECO基因擴增儀（杭州博日科技有限公司），DYY-8C型電泳儀（北京市六一儀器廠），ZF-2紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）。

1.3 試驗試劑

CTAB，β-巰基乙醇，Tris，EDTA，無水乙醇，異戊醇，氯仿和異丙醇等，均為分析純試劑。

1.4 試驗方法

1.4.1 總DNA的提取采用CTAB法提取DNA。取150mg黃芩試管植株葉片置于研缽中，加入1 mL CTAB提取液置冰上研磨，研磨均勻后倒入2 mL EP管中，65℃水浴2 h，10 000 r/min離心10 min，取上清液加氯仿-異戊醇（24∶1）抽提3次，取上清液加入1/10體積NaAc冰浴10 min后再加入等體積異丙醇，置于4℃過夜沉淀DNA，次日取出后12 000 r/min離心10 min，棄上清液，用70%乙醇洗滌DNA沉淀3次，留沉淀自然風(fēng)干，加20 μL滅菌ddH2O溶解，并根據(jù)OD260值將各基因組DNA稀釋為40 ng/μL濃度，置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 RCR反應(yīng)體系及擴增程序PCR擴增反應(yīng)在20 μL體系中進行，其中含有10×Buffer（含Mg2+）緩沖液2 μL，dNTP 0.63 μL（其中含dATP，dGTP，dTTP，dCTP各10 mmol/L），擴增引物（濃度為10 μmol/L）1 μL，模板DNA稀釋液2.5 μL，Taq聚合酶0.3 μL，ddH2O13.57 μL。

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，34℃復(fù)性50 s，72℃延伸2 min，37個循環(huán)；72℃8 min補齊。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 RAPD擴增產(chǎn)物檢測取5 μLLoadingBuffer與PCR擴增產(chǎn)物混勻，于含4%的GoldenView的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測，DNA Marker DL5000作為參照。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

將PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上同一位置的條帶按有帶（包括顯帶和弱帶）、無帶分別記為“1”和“0”，將試驗結(jié)果轉(zhuǎn)化為數(shù)字形式，用SPSS 19.0軟件分析計算7個處理種之間的遺傳相似系數(shù)及遺傳距離，并繪制聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 7種晉產(chǎn)野生黃芩試管植株P(guān)CR擴增結(jié)果

在查詢相關(guān)文獻的基礎(chǔ)上，設(shè)計20條引物，經(jīng)反復(fù)篩選，其中，5條引物擴增的條帶清晰、多態(tài)性良好，可用于RAPD檢測。圖1、圖2為部分引物的擴增結(jié)果。

RAPD統(tǒng)計結(jié)果表明，5條引物共擴增出20條片段，其中，平行性條帶3條，多態(tài)性條帶17條，多態(tài)率為85%（表2）。

表2 山西野生黃芩試管植株的PCR擴增結(jié)果

2.2 7種山西野生黃芩種質(zhì)聚類分析

由表3，4可知，7個不同產(chǎn)地的山西野生黃芩間的遺傳距離在0～1。其中，產(chǎn)自汾陽市后溝村的種質(zhì)與產(chǎn)自朔城區(qū)大蓮花村、右玉縣溝北村、平魯區(qū)烏龍洞的種質(zhì)之間遺傳距離最小，為0；產(chǎn)自沁源縣上灣村的種質(zhì)與產(chǎn)自朔城區(qū)大蓮花村、右玉縣溝北村、平魯區(qū)烏龍洞及汾陽市后溝村的種質(zhì)之間的遺傳距離最大，為1。

表3 7種山西野生黃芩試管苗植株的遺傳距離

表4 7種山西野生黃芩試管植株的遺傳相似系數(shù)

由圖3可知，7個產(chǎn)地的山西野生黃芩種質(zhì)可劃分為2個類群：產(chǎn)自朔城區(qū)大蓮花村、右玉縣溝北村、平魯區(qū)烏龍洞及汾陽市后溝村的種質(zhì)首先聚在一起，然后與沁源縣西王勇村的種質(zhì)聚在一起形成類群Ⅰ；產(chǎn)自交城縣雙家寨村的種質(zhì)與沁源縣上灣村的種質(zhì)遺傳距離較近，首先聚到一起，然后與類群Ⅰ聚到一起形成類群Ⅱ。

3 討論與結(jié)論

7個不同產(chǎn)地的山西野生黃芩試管植株的PCR擴增多態(tài)率達到了85%，說明山西野生黃芩具有豐富的遺傳多樣性，也有著一定程度的相似性。本研究以不同產(chǎn)地的野生黃芩試管植株為試驗材料，不受生長季節(jié)、生長年限以及氣候條件的限制；試管植株生長環(huán)境一致，遺傳穩(wěn)定性相對更高，使試驗結(jié)果更加可靠。

從生長地理位置及環(huán)境來看，產(chǎn)自山西省朔州市大蓮花村、溝北村、烏龍洞以及產(chǎn)自山西省汾陽市后溝村的4種黃芩種質(zhì)的遺傳距離為0；產(chǎn)自山西省長治市沁源縣上灣村和西王勇村的2種黃芩種質(zhì)的遺傳距離為0.750，差異較大；產(chǎn)自山西省呂梁市交城縣雙家寨村的黃芩種質(zhì)與產(chǎn)自山西省呂梁市汾陽市后溝村的黃芩種質(zhì)產(chǎn)地相距較近，但遺傳距離為0.750，差異較大。本研究結(jié)果表明，山西野生黃芩分布的地理位置與其遺傳多樣性沒有直接的相關(guān)性。

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RAPD Analysis of Germplasm Resources of WildScutellaria baicalensisfrom Shanxi

LIUXiao-ling，HAOJian-ping，F(xiàn)ULin
（College ofLife Sciences，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

Toknowthe genetic distance and phylogenetic relationsships amongthe 7 varies oftest-tube plantlets ofwild Scutellaria baicalensis from Shanxi,the paper used the RAPD technique to analyze and make a cluster analysis to the result with the software SPSS 19.0.The results showed that 5 primers amplificated 20 pieces,including17 polymorphic bands,and the polymorphic rate was 85%.The genetic distance among 7 varies of test-tube plantlets of wild Scitellarie baicalensis was from 0 to 1,and it could be divided into two classes.This revealed that there was a obvious difference and the abundant genetic diversity among the test-tube plantlets of wild Scitellarie baicalensis in 7 different regions of Shanxi,which provided experimental basis for genetic resources breeding,artificial cultivation and resources protection.

Scutellaria baicalensis;test-tube plantlet;RAPD;genetic diversity

R282.71

A

1002-2481（2016）03-0288-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.03.03

2015-08-14

山西省科技攻關(guān)計劃項目（振東專項）（2014ZD0503）

劉曉伶（1991-），女，山西朔州人，在讀碩士，研究方向：藥用植物細胞工程。郝建平為通信作者。