李維娜 何 飛 薛慧君 張 敏 張曉軍 曾召利

孕激素和脂聯(lián)素分子受體11對A549肺癌細胞侵襲轉移的影響研究*

李維娜①*何 飛②③*薛慧君①張 敏①張曉軍①曾召利①

目的：觀察孕激素和脂聯(lián)素分子受體11(PAQR11)對A549肺癌細胞侵襲轉移的作用，探索其可能的分子機制。方法：設計2條干擾PAQR11的核酸序列，以分子克隆的方法插入pLKO.1慢病毒載體，轉染HEK-293T細胞包裝病毒，以病毒上清感染A549細胞，嘌呤霉素篩選A549細胞；細胞劃痕實驗檢測敲低PAQR11對A549細胞遷移的影響；Transwell小室實驗檢測敲低PAQR11對A549細胞侵襲能力的影響；實時定量PCR檢測上皮間質轉化相關分子的表達。結果：成功構建了干擾PAQR11表達慢病毒載體，獲得穩(wěn)定干擾PAQR11的A549細胞，實時定量PCR、Western blot驗證干擾效果。敲低PAQR11能夠促進A549細胞的遷移和侵襲能力；敲低PAQR11后E-Cadherin的表達水平降低，Snail1、Twist1和N-Cadherin表達升高。結論：敲低PAQR11能夠促進A549細胞的遷移和侵襲能力，其機制可能與EMT增強有關。

肺癌；孕激素和脂聯(lián)素分子受體家族11；侵襲；轉移；上皮間質轉化

[First-author’s address]Department of Biomedical Engineering, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China.

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤，其5年生存率不到15%，是目前腫瘤死亡的首要原因[1-4]。肺癌的傳統(tǒng)治療手段主要有手術療法、化學療法和放射療法，但居高不下的病死率對傳統(tǒng)療法提出嚴峻挑戰(zhàn)。近年來的分子靶向、基因治療以及精準治療的提法方興未艾，但是其基礎是深入了解與腫瘤相關的基因和分子在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移中的作用。

孕激素和脂聯(lián)素分子受體11(PAQR11)又稱單核細胞向巨噬細胞分化相關分子(monocyte to macrophage differentiation-associated，MMD)[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，PAQR11在肺癌組織中高表達，并且與腫瘤發(fā)展和患者預后密切相關[7]。然而，PAQR11其具體功能目前仍然不清楚。本研究通過在A549肺癌細胞中干擾PAQR11的表達，觀察其對肺癌細胞遷移侵襲的影響，并初步探索其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

人肺癌A549細胞株由第四軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院胸外科惠贈；HEK-293T細胞株由第四軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院生化教研室惠贈。常規(guī)復蘇，傳代接種后取其生長良好的第三代細胞完成本次實驗。

1.2 試劑與儀器

(1)pLKO.1、psPAX2和pMD2.G慢病毒ShRNA體系由第四軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院生化教研室惠贈；AgeI，NcoI和EcoRI購于美國NEB公司；轉染試劑Fugene 6購于瑞士Roche公司；抗PAQR11抗體購于美國Santa Cruz公司；抗β-actin抗體購于美國Sigma公司；抗山羊-HRP抗體和抗小鼠-HRP抗體購于武漢博士德公司；Transwell小室為美國Corning產(chǎn)品。

(2)質粒提取、回收試劑盒購于北京天根公司；PrimeScript RT Reagent kit反轉錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTM II(Perfect Real Time)實時定量試劑盒購于大連寶生公司；化學發(fā)光試劑盒supersignal WESTPICO，購于美國PIERCE公司。引物序列由北京奧科公司合成。ECL發(fā)光利用PIERCE supersignal WESTPICO試劑盒，A液和B液各取500 μL，混勻，把PVDF膜在濾紙上吸去液體，放入儀器暗室，混好的顯影液均勻地滴于膜上，軟件顯影。

(3)QYC-200恒溫搖床(上海)，ChemiScope 3400 Mini化學發(fā)光儀(上海)；實時定量PCR儀(Mastercycler ep realplex，德國Eppendorf公司)，倒置顯微鏡、正置顯微鏡(日本Olymbus公司)。

1.3 PAQR11干擾慢病毒載體的構建和鑒定

1.3.1 干擾序列的設計

針對PAQR11設計2個靶點，每個靶點2條核苷酸序列，見表1。

表1 引物序列表

1.3.2 干擾慢病毒載體的構建和鑒定

將2條引物混合加熱煮沸，自然降溫退火，反復3次；以AgeI和EcoRI分步酶切pLKO.1載體；退火引物混合物與回收的線性化pLKO.1載體連接，轉化XL10感受態(tài)，挑克隆，接種于LB培養(yǎng)基(含50 μg/ml氨芐青霉素)，37 ℃恒溫搖床220 r/min，孵育12 h，提取質粒，以NcoI和EcoRI雙酶切鑒定，構建pLKO.1-shPAQR11-1和pLKO.1-shPAQR11-2質粒。

1.4 病毒包裝、感染和篩選穩(wěn)定

pLKO.1-shPAQR11、psPAX2和pMD2.G以FuGENE6共轉入HEK-293T細胞，12～15 h后更換培養(yǎng)基，加入新鮮DMEM，然后每24 h收集含病毒的培養(yǎng)上清，于-70 ℃保存。肺癌細胞A549接種于6 cm培養(yǎng)皿，加入0.05～1 ml含病毒的培養(yǎng)上清，24 h后加入含有嘌呤霉素(2 μg/ml)的DMEM培養(yǎng)基，進行抗生素篩選獲得穩(wěn)定干擾PAQR11的肺癌細胞株。

1.5 檢測穩(wěn)篩A549細胞的mRNA水平變化

實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測穩(wěn)篩A549細胞的mRNA水平變化。常規(guī)利用Trizol提取穩(wěn)定篩選獲得A549肺癌細胞RNA，以PrimeScript RT Reagent kit進行反轉錄，以SYBR Premix Ex TaqTM II(Perfect Real Time)進行Real-time PCR，以β-actin作為內參照。引物序列見表1

1.6 Western blot檢測A549細胞PAQR11的表達

RIPA常規(guī)提取A549肺癌細胞蛋白，SDS-PAGE電泳蛋白，穩(wěn)流轉膜到PVDF膜上，含5%脫脂奶粉PBST溶液封閉2 h，抗PAQR11抗體1∶500稀釋，抗β-actin抗體1∶1000稀釋，4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3次，分別以HRP標記抗山羊IgG二抗和HRP標記抗小鼠IgG二抗(1∶2000)室溫孵育2 h，PBST洗膜3次后ECL顯色發(fā)光。

1.7 細胞劃痕實驗

接種7×105A549細胞于6 cm培養(yǎng)皿，第2 d達到80%匯合度，用槍頭垂直的在6 cm皿底劃線，用PBS清洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基，放入37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。在0 h、12 h及24 h時拍照。

1.8 Transwell小室侵襲實驗

1.8.1 Transwell小室的準備

用8 μm微孔的Transwell細胞培養(yǎng)室進行侵襲實驗。用50 mg/L的Matrigel 1∶3稀釋包被Transwell小室底膜的上室面，并放入24孔中，37 ℃膠化30 min。

1.8.2 A549細胞的準備

無血清培養(yǎng)基稀釋不同組的A549細胞(5×105/ ml)，接種至Transwell小室的上室，每孔200 μl，給Transwell小室下室加入600 μl完全培養(yǎng)基，將24孔板放入37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h。

1.8.3 Transwell小室的染色和拍照

將培養(yǎng)24 h后不同的Transwell小室取出，用PBS清洗3遍，每次5 min；用95%的乙醇固定2～3 min，用水清洗30～60 s；用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞；給每孔加入400 μl結晶紫，將Transwell小室放入其中染色10 min；用PBS清洗3遍，每次5 min；在正置顯微鏡下用10×鏡觀察，并任選4個區(qū)域拍照。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism 5軟件對數(shù)據(jù)進行處理和分析。

2 實驗結果

2.1 干擾PAQR11的慢病毒載體酶切鑒定

通過NcoI和EcoRI雙酶切能否獲得大小約5 kbp和2 kbp的片段來鑒定干擾序列是否正確連入pLKO.1載體。對照shscramble的1～2號克隆，shPAQR11-1的5～6號克隆，shPAQR11-2的7～9號克隆都能夠酶切獲得大小約5 kbp和2 kbp的片段，連入正確，構建載體成功(如圖1所示)。

圖1 干擾慢病毒質粒NcoI和EcoRI雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 Real-time PCR和Western blot檢測A549細胞PAQR11的干擾效率

通過慢病毒感染、嘌呤霉素篩選獲得A549感染對照shscramble，shPAQR11-1和shPAQR11-2的3個細胞株，為了確認敲低的效率，操作步驟為：①Realtime PCR檢測不同組A549中mRNA的表達水平；shPAQR11-1和shPAQR11-2分別是對照組的1/2和1/6，shPAQR11-2的干擾效果好；②Western blot在蛋白質水平檢測不同組A549中的PAQR11的表達水平，通過灰度掃描，shPAQR11-2顯著降低A549細胞中PAQR11的表達水平，約為對照組的1/5。通過以上2個實驗證實shPAQR11-2敲低效果好(如圖2所示)。

圖2 A549細胞PAQR11干擾效率檢測結果圖

2.3 PAQR11敲低對A549細胞遷移和侵襲的影響

通過細胞劃痕實驗檢測PAQR11敲低對A549細胞遷移能力的影響，shPAQR11-2組在24 h劃痕顯著縮小，提示細胞遷移能力增強(如圖3所示)。

圖3 A549細胞劃痕后不同時間點明場圖(×40)

Transwell小室侵襲實驗檢測PAQR11敲低對A549細胞侵襲能力的影響，shPAQR11-2組穿過小室的細胞(紫色著色)明顯增加，提示敲低PAQR11促進A549細胞侵襲轉移(如圖4所示)。

圖4 Transwell小室侵襲實驗結晶紫染色結果圖(×100)

2.4 PAQR11敲低對上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)的影響

為了探索PAQR11敲低對A549細胞遷移和侵襲影響的機制，本研究實驗通過real-time PCR檢測了EMT相關分子的表達，包括E-Cadherin、N-Cadherin、Twist1和Snail1，如圖5所示。

圖5 Real-time PCR檢測EMT相關分子表達結果圖

干擾PAQR11后E-Cadherin為對照組0.57倍，而與EMT成正相關的N-Cadherin、Twist1和Snail1表達升高，分別是對照組的1.5、1.9和2.1倍。這些結果提示在A549肺癌細胞中敲低PAQR11而增強的細胞侵襲轉移可能與EMT密切相關。

3 討論

人MMD于1995年被發(fā)現(xiàn)，由于最初發(fā)現(xiàn)其高表達于成熟巨噬細胞，而單核細胞不表達，故命名為單核細胞向巨噬細胞分化相關基因[5]。其后根據(jù)分子結構特點，將其歸為孕激素和脂聯(lián)素分子受體家族(PAQR)成員，故MMD又稱為PAQR11。PAQR家族是一類不同于G蛋白耦聯(lián)受體家族的7次跨膜蛋白家族，與原核生物的溶血素Ⅲ型蛋白在結構上相似[6]。研究發(fā)現(xiàn)，PAQR11除在單核細胞低表達外，幾乎在所有組織中都可以檢測到PAQR11表達[7]。這一結果提示PAQR11的功能很可能不局限于單核-巨噬細胞的分化。Chen等[8]和Nieto等[9]研究發(fā)現(xiàn)，PAQR11高表達于肺癌組織中，但PAQR11高表達的生物學意義仍不清楚。

本研究前期在蛋白質水平和組織水平驗證了PAQR11高表達于NSCLC，發(fā)現(xiàn)敲低PARQ11的表達能顯著抑制A549肺癌細胞的增殖[10]。在本研究中發(fā)現(xiàn)干擾PAQR11的表達后，A549細胞的遷移和侵襲能力反而增強。

EMT是上皮細胞來源的腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學過程[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，敲低PARQ11的表達能促進A549肺癌細胞EMT相關分子N-Cadherin、Twist1和Snail1的表達上調，而E-Cadherin的表達下調，促進A549細胞發(fā)生EMT。因而，本研究考慮：PAQR11是否為調節(jié)肺癌細胞功能的“開關”，“開”則肺癌細胞增殖，“關”則肺癌細胞轉移？那么，在肺癌患者中是否由于PAQR11高表達，肺癌細胞原位擴增長大，但當達到“特定條件”時少量細胞PAQR11表達下降而發(fā)生轉移？這些疑問需要在后續(xù)的研究中進一步通過動物體內實驗證明。

有研究小組[12-13]發(fā)現(xiàn)，PAQR11定位于高爾基體細胞器膜，其能夠結合胞漿內的Ras和RasGPR1信號分子，促進ERK信號持續(xù)激活，而敲低PAQR11的表達則導致Ras/ERK信號的削弱。本研究前期研究也發(fā)現(xiàn)在A549肺癌細胞中敲低PAQR11抑制ERK1/2的活化，進而影響增殖相關信號途徑[10]。PAQR11是通過何種方式影響EMT途徑，仍然有待于進一步研究。

綜上所述，本研究成功構建了干擾PAQR11表達慢病毒載體，獲得穩(wěn)定干擾PAQR11的A549細胞，發(fā)現(xiàn)敲低PAQR11能夠促進A549細胞的遷移和侵襲，其機制可能與EMT增強有關。

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Study of the effect of PAQR11 on invasion and metastasis in A549 lung cancer cells/

LI Wei-na, HE Fei, XUE Hui-jun, et al// China Medical Equipment,2016,13(12):150-154.

Objective: To investigate the effect of PAQR11 on invasion and metastasis in A549 lung cancer cells, and explore the possible molecular mechanism. Methods: Two oligonucleotides for interfering PAQR11 were designed, and were cloned into pLKO.1 lentiviral plasmid. entiviral particles were produced with HEK-293T cells. A549 cells were infected with lentiviral particle solution supernatant and screened with puromycin. Then the migration of PAQR11 knockdown A549 cell was detected with erasion trace test and the invasion was observed with transwell chamber. The expression of EMT associated molecular was detected by real-time PCR. Results: Lentiviral vector for interfering PAQR11 was built. Stable PAQR11 knockdown A549 lung cancer cells were established. The knockdown of PAQR11 was tested by real-time PCR and Western blot. Cell migration and invasion was promoted in PAQR11 knockdown A549 lung cancer cells. PAQR11 knockdown could reduce the expression of E-Cadherin, but up-regulate the level of Snail1, Twist1 and N-Cadherin. Conclusion: Knockdown of PAQR11 could promote the invasion and metastasis of A549 lung cancer cells, and this effect may be relevant with reinforcing EMT.

Lung cancer; PAQR11; Invasion; Metastasis; EMT

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2016.12.044

1672-8270(2016)12-0150-05

R734.2

A

2016-09-17

陜西省自然科學基金面上資助項目(2015JM8470)“MiR-140-5p/PAQR11通路對肺癌的作用及機制”

①第四軍醫(yī)大學生物醫(yī)學工程系物理教研室 陜西 西安 710032

②第四軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院肝膽胰脾外科 陜西 西安 710032

③解放軍95982部隊衛(wèi)生隊 河南 開封 475003

*通訊作者：liweina228@163.com； hefei_hefei@163.com

李維娜，女，(1982- )，碩士，實驗師。第四軍醫(yī)大學生物醫(yī)學工程系物理教研室，從事生物物理研究工作。