陳志偉，汪洋，葉藤，許潔，陳信春，周翹楚，杜曉靖

（1．浙江省溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，溫州325000；2．安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥330012）

·論著·

芒柄花素對(duì)人表皮共培養(yǎng)體黑素合成的影響

陳志偉1，汪洋1，葉藤1，許潔1，陳信春2，周翹楚1，杜曉靖1

（1．浙江省溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，溫州325000；2．安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥330012）

目的觀察芒柄花素對(duì)人表皮黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)體系模型（人表皮共培養(yǎng)體）中酪氨酸酶活性及黑素合成的影響。方法建立人表皮共培養(yǎng)體，建成后分別加入30 mg/L、60 mg/L、120 mg/L芒柄花素，熊果苷為陽(yáng)性對(duì)照組，測(cè)定芒柄花素和熊果苷對(duì)人表皮共培養(yǎng)體中酪氨酸酶活性以及黑素合成的影響。結(jié)果芒柄花素3種濃度對(duì)人表皮共培養(yǎng)體中酪氨酸酶活性及黑素合成與對(duì)照組比較均有明顯抑制作用（P＜0．05），且濃度越高抑制作用越明顯（P＜0．05）。高、中濃度芒柄花素黑素抑制率高于熊果苷（P＜0．05）。結(jié)論芒柄花素對(duì)黑素合成有明顯抑制作用，機(jī)理與其對(duì)酪氨酸酶活性有抑制作用相關(guān)。

芒柄花素；人表皮共培養(yǎng)體；酪氨酸酶，黑素

皮膚的黑素主要由位于表皮基底層黑素細(xì)胞產(chǎn)生，皮膚顏色的深淺是由黑素含量的多少及其分布決定。酪氨酸酶是皮膚黑素合成的主要限速酶，其活性與黑素合成含量呈正相關(guān)。因而影響黑素細(xì)胞和酪氨酸酶生物活性的藥物可以用于色素障礙性皮膚病的治療[1]。芒柄花素又名刺芒柄花素，是黃酮類植物激素的一種，具有調(diào)節(jié)體內(nèi)血脂代謝、抑制過敏性炎癥等作用[2－3]，本研究在人表皮共培養(yǎng)體中檢測(cè)芒柄花素對(duì)酪氨酸酶活性及黑素的影響。

1材料與方法

1.1 材料 芒柄花素、254黑素細(xì)胞培養(yǎng)基（M254）、人黑素細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑2（HMGS－2）、牛垂體提取物、角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基（K－SFM）、人角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑（HKGS），表皮生長(zhǎng)因子購(gòu)自Cascade公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、DMEM、EDTA、胰酶均購(gòu)自Gibco公司；左旋多巴（L－DOPA）均購(gòu)自Sigma公司；L－谷氨酰胺購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自杭州四季青生物有限公司；倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 取材來源 本院外科6～20歲正常男性常規(guī)包皮環(huán)切術(shù)后的包皮，知情同意。

1.2.2 人表皮共培養(yǎng)體[4]①原代黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)：取包皮環(huán)切術(shù)后的包皮，去除皮下組織后分割成1 cm×1 cm左右的小塊，胰酶4℃消化過夜；分離表真皮，吹打成細(xì)胞懸液，離心后計(jì)數(shù)，以（4～6）×106/mL的密度接種于直徑25 mL培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為MC254完全培養(yǎng)基。24 h后換液，1周后傳代。角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)步驟同上，只是它使用的是角質(zhì)形成細(xì)胞完全培養(yǎng)基。取3代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。②黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞共同培養(yǎng)：將黑素細(xì)胞接種于已有角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)板中，兩者接種比例為1∶2，其所用培養(yǎng)基為黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞完全培養(yǎng)基1∶2混合而得。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 設(shè)加入3種濃度芒柄花素為實(shí)驗(yàn)組1（30 mg/L）、實(shí)驗(yàn)組2（60 mg/L）、實(shí)驗(yàn)組3（120 mg/L），加入熊果苷為陽(yáng)性對(duì)照組[5]（20 mg/L），單純細(xì)胞培養(yǎng)基為空白對(duì)照組。

1.2.4 MTT實(shí)驗(yàn) 首先將角質(zhì)形成細(xì)胞種植于96孔板，24 h后再接種黑素細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后加入相應(yīng)藥物建立實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、實(shí)驗(yàn)組3，陽(yáng)性對(duì)照組及空白對(duì)照組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，棄上清，每孔加入5 mg/L的MTT溶液20 μL，放入37℃、5%CO2孵箱4 h，棄上清，每孔加DMSO 150 mL，室溫振蕩10 min后置酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.5 酪氨酸酶活性測(cè)定 按照Kazuhisas等[6]方法將共培養(yǎng)細(xì)胞按1×104/孔接種于96孔板，建立實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、實(shí)驗(yàn)組3，陽(yáng)性對(duì)照組及空白對(duì)照組，另設(shè)培養(yǎng)基組為只加培養(yǎng)基，不加細(xì)胞，在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔吸光度值（A）。酪氨酸酶活性抑制率=[（A對(duì)照組－A實(shí)驗(yàn)組）/（A對(duì)照組－A培養(yǎng)基組）]×100%。

1.2.6 黑素含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)[7]將共培養(yǎng)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，37℃、5%CO2中孵育24 h，棄上清液，建立實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、實(shí)驗(yàn)組3，陽(yáng)性對(duì)照組及空白對(duì)照組。培養(yǎng)48 h后用0．25%胰酶消化收集細(xì)胞，鏡下計(jì)數(shù)。得到的細(xì)胞懸液1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入1 mL NaOH，在80℃水浴保溫2 h后于490 nm酶標(biāo)儀測(cè)吸光度值。黑素含量抑制率= [1－（實(shí)驗(yàn)組吸光度/細(xì)胞數(shù)的平均值）/（空白對(duì)照組吸光度/細(xì)胞數(shù)的平均值）]×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間方差分析，2組間比較t檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT實(shí)驗(yàn) 結(jié)果顯示3種濃度芒柄花素及熊果苷對(duì)人表皮共培養(yǎng)體中細(xì)胞活力均無明顯影響。

2.2 芒柄花素對(duì)酪氨酸酶活性的影響 結(jié)果表明3種濃度芒柄花素對(duì)人表皮共培養(yǎng)體中酪氨酸酶活性呈劑量依賴性抑制作用，實(shí)驗(yàn)組間比較差異有顯著性（t12=32．12，P＜0．05，t23=4．76，P＜0．05），與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。熊果苷對(duì)酪氨酸活性無明顯影響（P＞0．05）。見表1。

表1 芒柄花素對(duì)人表皮共培養(yǎng)體酪氨酸酶活性和黑素的影響 （s，%）

表1 芒柄花素對(duì)人表皮共培養(yǎng)體酪氨酸酶活性和黑素的影響 （s，%）

注：設(shè)空白對(duì)照組抑制率為0，與對(duì)照組比較，芒柄花素各組對(duì)酪氨酸酶活性和黑素合成抑制率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，*P＜0．05，#P＜0．05。熊果苷對(duì)酪氨酸酶活性與對(duì)照組比較無顯著抑制P＜0．05。

組別（濃度mg/L） 酪氨酸酶活性抑制率 黑素抑制率芒柄花素 （030） 30．03±4．41* 32．95±1．92#（060） 47．73±3．61* 52．37±1．48#（120） 51．65±3．91* 57．50±1．73#熊果苷 （020） 0．04±0．13 46．64±1．46空白對(duì)照組 0* 0#

2.3 芒柄花素黑素含量的影響 結(jié)果表明3種濃度芒柄花素對(duì)人表皮共培養(yǎng)體中黑素含量呈劑量依賴性抑制作用，實(shí)驗(yàn)組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t12=93．93，P＜0．05，t23=9．23，P＜0．05），與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），高、中濃度芒柄花素對(duì)黑素含量的抑制率高于熊果苷（P＜0．05）。

3 討論

隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)不斷提高，體外黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)體系不斷完善，人表皮共培養(yǎng)體越來越接近人體內(nèi)黑素實(shí)際沉著的過程，故其用于篩選藥物對(duì)黑素沉著的影響更接近于臨床。沙苑子為筆者臨床治療黃褐斑的效方[8]—消斑美膚湯的主要藥物，黃酮類又是沙苑子中的主要成分之一，具有抗肝損傷、調(diào)節(jié)血脂、降壓、抑制血小板聚集、提高免疫功能、抗炎、抗氧化、清除自由基、抗衰老、及抗腫瘤等作用[9－10]。芒柄花素為沙苑子黃酮的主要成分，故筆者采用其3種濃度（30 mg/L、60 mg/L，120 mg/L）及熊果苷在人表皮共培養(yǎng)體中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)其對(duì)酪氨酸酶活性以及黑素的影響，研究芒柄花素對(duì)黑素影響的機(jī)理及適宜濃度。結(jié)果表明芒柄花素在不影響細(xì)胞活力的3種濃度下對(duì)人表皮共培養(yǎng)體中酪氨酸酶活性以及黑素合成的抑制均呈劑量依賴性抑制作用，高、中濃度對(duì)黑素生成的抑制率優(yōu)于20 mg/L熊果苷，提示其抑制黑素生成機(jī)理與其抑制酪氨酸酶活性相關(guān)。同時(shí)本研究的結(jié)果顯示芒柄花素抑制黑素的作用強(qiáng)于抑制酪氨酸酶的作用，故筆者認(rèn)為芒柄花素還有其他途徑抑制黑素的生成，其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

[1] Sharma VK，Choi J，Sharma N，et al．In vitro anti－tyrosinase activity of 5－（hydroxymethyl）－2－furfural isolated from Dictyophora indusiata[J]．Phytother Res，2004，18:841－844．

[2]趙培，楊媛，徐揚(yáng)，等．刺芒柄花素調(diào)節(jié)血脂代謝及改善動(dòng)脈粥樣硬化病變的實(shí)驗(yàn)研究[J]．中國(guó)新藥雜志，2009，18（10）:925－929．

[3]王燕，陶羽，王曉鈺，等．芒柄花素抑制小鼠Th2型變應(yīng)性接觸性皮炎的機(jī)制分析[J]．中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2016，22（10）:88－91．

[4]羅增香，項(xiàng)蕾紅，李劍．兩味中藥單體對(duì)人黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性及黑素合成的影響 [J]．中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志，2008，24（8）: 583－585．

[5]仲少敏，吳艷，汪科，等．威靈仙等4種中藥抑制黑素生成作用的機(jī)制研究[J]．臨床皮膚科雜志，2006，35（11）:701－704．

[6] Kazuhisa S，Takahisa N，Koji S，et al．Inhibitory effects of alphaarbutin on melanin synthesis in cultured human melanoma cells and a three－dimensional human model[J]．Biol Pharm Bull，2004，27: 510－514．

[7]馬慧軍，朱文元，岳學(xué)狀，等．甲氧沙林對(duì)培養(yǎng)人表皮黑素細(xì)胞黑素合成的影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究[J]．臨床皮膚科雜志，2004，33（9）:526－528．

[8] 陳志偉，汪洋，周翹楚．中西醫(yī)結(jié)合治療女性黃褐斑48例臨床觀察[J]．浙江中醫(yī)雜志，2010，45（1）:60－61．

[9] 劉麗君，佟海寧．沙苑子藥理作用研究進(jìn)展[J]．亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2012，8（1）:181－183．

[10]楊瑾．沙苑子的生物學(xué)效應(yīng)及其作為運(yùn)動(dòng)補(bǔ)劑的應(yīng)用前景[J]．現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐雜志，2015，29（1）:84－86．

Effects of the Formonone on Melanin Biosynthesis in Human Epidermal Co-culture System

Chen Zhiwei1,Wang Yang1,Ye Teng1,Xu Jie1,Chen Xinchun2,Zhou Qiaochu1,Du Xiaojing1
1.Wenzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine in Zhejiang Province,Wenzhou 325000,China;
2.Anhui Univercity of Tradisional Chinese Medicine in Anhui Province,Hefei 330012,China;

ObjectiveIn order to observe the effects of the formonone on tyrosinase and melanin in the model of pigment of human epidermal cells combined with malpighian cell co－culture system(human epidermal co－culture system)．MethodsEstablished the human epidermal co－culture system，added the formonone at three concentrations(30 μg/mL，60 μg/mL，120 μg/mL)into this system．Added the arbutin into this system as the control group．The effects of the formononetin and arbutin on tyrosinase activity and melanin pigment in the human epidermal co－culture system were observed．ResultsCompared to the control group，formononetin at three concentrations had obviously inhibitory effects on tyrosinase activity and melanin pigment in the human epidermal co－culture system (P＜0．05);and the higher concentrations，the more obvious inhibition effects(P＜0．05)．At high and middle concentrations，the formononetin had more inhibitory rate than arbutin(P＜0．05)．ConclusionThe formononetin has obvious inhibitory action on melanogenesis．The mechanism may be correlated with inhibitting the activity of tyrosinase．

Formonone;Human epidermal co－culture system;Tyrosinase;Melanin pigment

R739.5

A

1672－0709（2016）05－0261－02

2015－08－18）

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃；項(xiàng)目編號(hào)：2013ZA121

汪洋，E－mail：5486842@163．com